Summary
여기는 hypoxic 조건 하에서 생 핵 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하는 공동-immunoprecipitation 프로토콜에 설명 합니다. 이 메서드는 hypoxia에서 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용의 데모에 적합 합니다.
Abstract
낮은 산소 수준 (hypoxia) 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 (HIF 1) 복잡 한 마스터 레 귤 레이 터 역할 적응 응답의 다양 한 트리거. HIF 1는 heterodimeric 산소 레 귤 레이트 된 α 소 단위 (HIF-1α)의 구성 및 constitutively β 소 단위 (HIF-1β)로 알려진 aryl 탄화수소 수용 체 핵 translocator (ARNT), 신생을 포함 한 다양 한 프로세스에 관련 된 유전자 조절 표현 적혈구 및 분해. HIF 1 상호 작용 단백질의 id 신호 전달 경로 hypoxia의 이해에 열쇠 이다. HIF 1α 안정성의 규제 외 hypoxia 또한 ARNT HIF 1α 등 많은 녹음 방송 요인의 핵 전 좌를 트리거합니다. 특히, 같은 단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)를 공부 하는 데 사용 하는 현재 방법의 대부분은 단백질 overexpression 통해 단백질 레벨은 인위적으로 증가 하는 시스템 기반으로 합니다. 종종 단백질 overexpression 시간적, 공간적 유물에서 발생 하는 비 생리 적 결과를 리드. 여기 우리가 설명 하는 수정 된 co immunoprecipitation 생 핵 단백질를 사용 하 여 저 산소 증 치료 하 고 개념, HIF 1α와 ARNT 간의 상호 작용을 보여 증명 프로토콜. 이 프로토콜에 hypoxic 세포 hypoxic 조건 하에서 수확 했다 및 Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 워시 버퍼는 또한 복잡 한 단백질 또는 단백질 저하를 완화 하기 위해 사용 하기 전에 hypoxic 조건에 미리 equilibrated reoxygenation 중 분리입니다. 또한, 핵 분수 이후에 집중 하 고 내 생 핵 단백질 안정화 고 단백질 overexpression 동안 자주 본 가짜 결과 방지 추출 되었다. 이 프로토콜은 녹음 방송 요인과 hypoxic 조건 transcriptional 공동 레 귤 레이 터 간의 내 인 성 및 기본 상호 작용을 보여 주기 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
Hypoxia는 부적당 한 산소 세포와 신체의 조직에 제공 될 때 발생 합니다. 그것은 줄기 세포 분화, 염증 및 암1,2등 다양 한 생리 및 병리학 프로세스에서 중요 한 역할을 한다. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 (HIFs) heterodimers는 산소 레 귤 레이트 된 α 소 단위와 constitutively 표현된 β 소 단위 라고도 ARNT3의 구성으로 작동 합니다. HIF α 소 단위 (HIF 1α, HIF 2α 및 HIF 3α) 및 3 개의 HIF β 소 단위 (ARNT/HIF-1β, ARNT2 및 ARNT3)의 3 개의 isoforms 날짜 확인 되었습니다. HIF 1α 및 ARNT는 표현 편 반면 HIF 2α, HIF-3α, ARNT2 및 ARNT3는 더 제한 된 표현 패턴4. 복잡 한 HIF 1 단백질은 저 산소 증 응답의 키 레 귤 레이 터 이다. Hypoxic 조건 하에서 HIF 1α 안정 된다, 핵에 translocates 그리고 ARNT5dimerizes. 그 후,이 복잡 한 저 산소 증 응답 성분 (HREs)으로 알려진 특정 뉴클레오티드를 한다 신생, 적혈구 및 분해6을 포함 하 여 다양 한 프로세스에 관련 된 타겟 유전자의 표현을 규제. 이 "정식" 응답 뿐만 아니라 hypoxia 신호 통로 또한 알려져 누화를 노치 등 핵 인자-카파 B (NF κB) 통로 신호 하는 여러 세포 응답7,8,9.
소설 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별 통로 신호 하는 산소의 더 나은 이해를 위해 중요 하다. ARNT 산소 수준에 둔감 하 고 constitutively 표현 되는 달리 HIF 1α 단백질 수준 세포 산소 수준에 의해 밀접 하 게 통제 된다. Normoxia (21% 산소), HIF 1α 단백질은 빠르게 저하10,11. Normoxia에서 HIF 1α의 짧은 반감기에는 HIF 1α 상호 작용 단백질의 식별을 위해 뿐만 아니라 셀 추출에서 단백질의 검출에 대 한 특정 기술적인 도전을 선물 한다. 또한, 여러 전사 인자 HIF 1 단지 포함 한 hypoxic 조건12,13,14에서 핵으로 이동. PPI 연구에 사용 되는 현재 방법의 대부분은 단백질의 생리 적 비 overexpression를 사용 하 여 수행 됩니다. 이러한 단백질 overexpression 리소스 오버 로드, 화학 량 론 불균형, 무차별 상호 작용 및 통로 변조15,16를 포함 하 여 여러 메커니즘을 통해 다른 세포 결함을 일으킬 수 보고 되었습니다. PPI 연구에서 단백질 overexpression 거짓 긍정적인, 또는 심지어 거짓 부정, 단백질 속성과 overexpressed 단백질의 기능에 따라 결과 발생할 수 있습니다. 따라서, PPI 연구에 대 한 현재 메서드 hypoxic 조건 하에서 순수 관련 PPIs를 공개 하기 위해 수정할 수 있다. 우리는 이전 HIF 1 Ets 가족 녹음 방송 요인 조지아-의무적인 단백질 (GABP) hypoxic P19 셀에서 hypoxia17 Hes1 발기인의 반응에 기여 하는 상호 작용을 시연 했다. 여기, 우리는 hypoxic 조건 하에서 생 핵 단백질 사이의 PPIs를 공부 하는 공동-immunoprecipitation 프로토콜을 설명 합니다. HIF 1α ARNT의 상호작용 개념의 증거로 서 표시 됩니다. 이 프로토콜은 hypoxic 조건 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용을 보여주는 적합 하지에 국한 HIF 1 상호 작용 단백질의 id.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
인간 미 발달 신장 293A를 사용 하 여이 프로토콜 섹션 (HEK293A) 셀 s 난 양 기술 대학교, 싱가포르에서 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1입니다. HEK293A 세포에서 산소의 유도
- 준비 4 10 cm 요리와 씨 3-5 Dulbecco의 수정 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 m L-글루타민, m이 글의 중간 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당) 10 mL에 접시 당 106 HEK293A 셀 x 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg / mL 스입니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 세포 문화.
참고: 셀 시드 실행 되어야 한다 밖으로 생물 안전 캐비닛 (BSC)에. BSC에 배치 하는 모든 자료의 표면 70% 에탄올으로 닦아 해야 합니다. - 시드, 후 24 h 세포 80-90 %confluency 도달 했습니다 때 넣어 두 요리 인큐베이터 글러브에서 hypoxia subchamber ( 재료의 표참조) 1% O2 와 37 ° C, 및 계속 다른 두 normoxia (21 %O 요리 5% CO2 2, 5% CO2 37 ° C에서) 4 헤를 사용 하 여 1 세트의 normoxic와 hypoxic 셀 서쪽 오 점 하 여 저 산소 증 치료를 평가 하 고 공동-immunoprecipitation 실험에 대 한 셀의 다른 세트를 활용.
참고: 산소 수준을 설정할 수 있습니다 0-5%, 산소 치료의 기간 셀 유형에 따라 변화 될 수 있고 목표를 공부.
2. 전체 셀 및 핵 추출
참고:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼에 대 한 내용은 표 1 을 참조 하십시오.
-
Normoxia 제어 셀을 수확.
- 포부에 의해 문화 미디어를 제거 하 고 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) 셀 린스 10 mL 피 펫을 사용 하 여.
참고: 피펫으로와 셀 단층을 만지지 마십시오. 세척, 동안 세포 손실을 방지 하기 위해 셀 문화 판의 벽 아래로 DPBS 플라스틱 부드럽게. - 5 mL를 플라스틱 접시에 얼음 처럼 차가운 DPBS 셀 스 크레이 퍼와 얼음 처럼 차가운 PBS에 격판덮개의 표면에서 세포를 다쳤어요.
- 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 얼음에 계속.
- 포부에 의해 문화 미디어를 제거 하 고 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) 셀 린스 10 mL 피 펫을 사용 하 여.
-
Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포를 수확.
- 미리 사전에 24 h는 발견된 100 mL 실험 유리 시 약 병으로 가득 DPBS hypoxia subchamber (1% O2 와 37 ° C에서 5% CO2 )에 배치 하 여 hypoxic 조건 DPBS equilibrate.
- 저 산소 증 치료 세포를 수확 전에 약 1 h 1% O2 , 5% CO2equilibrated 되었습니다 글러브의 처리 챔버로 얼음을 포함 하는 얼음 상자를 놓습니다. 포함 하는 처리 챔버에 산소 subchamber에서 미리 equilibrated hypoxic DPBS 병을 전송 하 고 얼음에 두십시오.
- 저 산소 증 치료, 다음 4 h 1% O2 , 5% CO2미리 equilibrated 되었습니다 처리 챔버 hypoxia subchamber에서 셀 전송.
- 포부에 의해 문화 미디어를 제거 하 고 10 mL와 10 mL와 함께 차가운 미리 equilibrated hypoxic DPBS 플라스틱 일단 셀 린스.
- 5 mL와 함께 차가운 미리 equilibrated DPBS 플라스틱 및 셀 스 크레이 퍼와 된다고 하 여 세포를 꺼내 5 mL를 추가 합니다.
- 세포 배양 접시를 기울기 고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 분리 된 세포를 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브로 DPBS에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 얼음에 계속.
- 처리 및 버퍼 챔버는 글러브의 둘 다 1% o 2와 5% CO2미리 equilibrated 되었습니다 사이 문을 엽니다. 버퍼 실로 처리 실에서 산소 치료 세포를 포함 하는 얼음에 15 mL 원뿔 튜브를 전송 합니다. 버퍼 챔버의 문을 열고는 글러브에서 세포를 완전히 제거 합니다.
- 2.1에서 normoxic 세포와 2.2에서 hypoxic 세포 모두에서 1000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛
-
추출 물에서 전체 셀을 준비 합니다.
- Resuspend 얼음 라디오 immunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 50mm Trisaminomethane 염 산 염 (Tris HCl) pH 8.0, 150 m m 염화 나트륨 (NaCl), 1 %tergitol 형 NP-40 (NP-40), 0.5% 나트륨 deoxycholate, 포함 된의 500 µ L에서 셀 펠 릿 및 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1 보충 ( 재료의 표참조) 몇 번 위아래로 셀 펠 릿 pipetting으로.
- 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 세포 lysates 전송 및 가끔 vortexing와 함께 30 분 동안 얼음에 계속.
- 13000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포 lysates 원심
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의는 표면에 뜨는, aliquot 50 µ L를 수집 하 고-80 ° c.에 저장
-
핵 적 출을 사용 하 여 핵 추출 준비 키트 (재료의 표 참조).
- 부드럽게 위아래로 여러 번 셀 펠 릿 pipetting으로 세포의 용 해 버퍼 NL 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 0.1 m M dithiothreitol (DTT) x 1와 보충의 500 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend.
- 세포 현 탁 액 및 10에 대 한 소용돌이에 세제 솔루션 NP의 25 µ L를 추가 최대 속도에서 s.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 10000 x g 에서 원심 분리기
- 상쾌한 (세포질 추출 물), 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 상쾌한의 aliquot 50 µ L를 수집 하 고-80 ° c.에 저장
- 세포 세포의 용 해 버퍼 NL 5 vortexing에 의해 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 0.1 M DTT x 1와 보완의 500 µ L에 핵을 포함 하는 펠 릿 resuspend 최대 속도에서 s.
- 4 ° C에서 5 분 동안 10000 x g 에서 centrifuge 고 핵 펠 릿을 저장 합니다.
- 추출 버퍼 NX1 pipetting 여러 번 왔다 갔다 펠 릿에 의해 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1와 보충의 50 µ L에서 핵 펠 릿을 resuspend.
- 얼음에 30 분, 10 vortexing 품 어 s 최대 속도로 5 분 마다.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g 에서 원심 분리기
-
핵 추출 desalt
- 단위 당 100 µ L의 최대 볼륨 미니 투 석 장치에는 상쾌한 단계 2.5.9 및 전송에서 수집 합니다.
- 미니 투 석 장치 모자 하 고 부양 장치에 그들을 배치.
- 미리 냉장된 투 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 20% 글리세롤, 100 m m 염화 칼륨 (KCl), 0.2 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 0.2 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 및 0.5 mM DTT)의 500 mL를 포함 하는 비 커에 부양 장치를 넣어 그리고 부드러운 교 반으로 4 ° C에서 30 분 동안 품 어.
주의: PMSF 위험입니다. 흡입 또는 피부와 직접 접촉을 하지 마십시오. - 미니 투 석 장치의 코너에서 샘플을 수집 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송.
- 4 ° C, 1.5 mL microcentrifuge 관으로 각 상쾌한의 aliquot 25 µ L에서 10 분 동안 12000 x g 에서 centrifuge 그리고-80 ° c.에 저장
3. 단백질 표정 및 HIF 1α의 Subcellular 지 방화의 탐지에 의해 산소 치료의 평가
- 전체 셀의 단백질 농도 결정 또는 핵/세포질 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 실험 키트 제조 업체의 지침18따라 microplate 분석 결과 사용 하 여 추출.
- 1 x Laemmli 샘플 버퍼 5 %2-Mercaptoethanol을 포함 하는 세포 lysates 희석 하 고 5 분 동안 95 ° C에 종 기.
주의: 화상을 일으킬 수 있습니다 이후 난방 블록의 표면을 만지지 마십시오. -
나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 하 여 단백질을 분리 합니다.
- 분자량 마커의 3 µ L 함께 SDS 페이지 캐스트 그라데이션 젤 (4-20%)의 각 음에 동일한 양의 단백질 (25 µ g)를 로드 합니다.
- 2.5 m m 0.01 %SDS, 19.2 m m 글리신, 트리 스 PH8.3 200 V에서 30 분을 포함 하는 버퍼를 실행에 젤을 실행 합니다.
-
젤에서 단백질을 니트로 막에 전송 합니다.
- 양극 측에는 카세트의 음극 쪽에 막 젤으로 전송 샌드위치 (필터 종이-젤-멤브레인-필터 종이)를 조립.
- 2.5 m m trisaminomethane (트리 스), 19.2 m m 글리신과 20% 메탄올을 포함 하는 전송 버퍼가 가득 전송 탱크에 카세트를 넣습니다.
주의: 메탄올 가연성 이며 가연성 액체 스토리지 캐비닛 내부 저장 한다. - 추운 방에 100 V에 1 시간에 대 한 전송을 수행 합니다.
- 50 mM Tris-Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl, 0.1 트윈 20, 5% 비-지방 우유 통에 실 온에서 1 h 포함 된 10 mL 차단 버퍼에 오를 차단 합니다.
- 안티-HIF-1α 항 체 (1/500 희석) 4 ° c.에 하룻밤 같은 블로킹 버퍼에 함께 오를 품 어
- 워시 50ml TBS. 각 시간 3 시간 5 분 동안 오
- 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 오 품 어-실 온에서 1 h 10 mL TBS T 포함 5% 비 지방 건조 우유에 활용 된 이차 항 체 (1/1000 희석).
- 워시 50ml TBS. 각 시간 3 시간 5 분 동안 오
- 믹스 500 µ L 각 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 소용돌이 짧게 향상 된 chemilumescent (ECL) 시 약 A와 B의.
- 오 점 ECL 기판 적용 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.
-
전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 기반 이미징 시스템을 사용 하 여 chemiluminescent 신호를 캡처.
- 티슈 페이퍼와 막의 가장자리를 만져 초과 ECL 기판 배수와 시트 보호 대에 막 배치.
- 카메라 기반 이미징 시스템은 CCD의 샘플 트레이에 멤브레인을 놓습니다.
- 이미지 프로세싱 소프트웨어를 실행 ( 재료의 표참조) 다음 설정 사용 하 여 이미지 캡처: → 새로운 프로토콜 → 채널 → 프로토콜 설정 → 젤 영상 파일 (응용 프로그램: 화학; 이미지 영역: 생물 라 드 준비 젤; 이미지 노출: 소프트웨어 강렬한 밴드에 대 한 노출 시간을 최적화 자동으로 됩니다) → 실행 프로토콜
참고: 노출 시간 최적의 이미지를 달성 하기 위해 수동으로 설정할 수 있습니다.
4. Immunoprecipitation 및 Immunoprecipitated 단백질의 검출
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 TBS 버퍼의 500 µ L에서 단백질 A/G sepharose 구슬의 50 µ L를 세척 하 고 작은 공의 구슬 4 ° c.에 2 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여
- 삭제는 상쾌한 고 TBS 버퍼의 100 µ L에 구슬 resuspend.
- 마우스 안티 ARNT 단일 클로 널 항 체 (1.4 mg/mL) 또는 마우스 500 µ L TBS 버퍼에 0.7 mg 마우스 IgG를 재구성 하 여 준비 된 면역 글로불린 G (IgG) (1.4 mg/mL)의 2 µ L를 추가 합니다.
- 튜브 회전에서 구슬 포함 1.5 mL microcentrifuge 튜브 놓고 추운 방에 10 rpm에서 2 h에 품 어.
참고: 튜브를 부드럽게 처리 하 고 튜브의 하단에 비즈를 포함 하는 정지를 유지. - 4 ° C에서 2 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여 구슬을 펠 렛 하 고는 supernatants 삭제.
- 50 mM Tris HCl (pH 7.4), 180 m m NaCl, 20% 글리세롤, 0.2 %NP-40 및 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 구성 된 IP 버퍼의 단계 2.6.5에 800 µ L에서 얻은 핵 단백질 lysate의 200 µ g을 희석. 4.5 하룻밤 4 ° c.에 단계에서 얻은 항 체 결합 구슬과 lysate 품 어
- 작은 공의 구슬 4 ° C에서 2 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여, 삭제는 supernatants 및 세척 3 번 1 mL와 구슬 0.2%를 포함 하는 얼음 처럼 차가운 TBS NP-40.
- 5 분 동안 95 ° C에서 50 µ L Laemmli 샘플 버퍼에 비즈를 끓인 다.
- 10000 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 구슬 원심, 상쾌한, 수집 하 고 구슬 삭제.
참고:는 상쾌한 저장할 수 있습니다 짧은 기간에 대 한 또는-20 ° C에 4 ° C에서 긴 기간에 대 한. - 서쪽 오 점 이전 단계 3.3 이후에서 설명한에 의해 immunoprecipitated 단백질 복합물에서 HIF 1α의 존재를 감지 합니다.
참고: 단백질 부 량이이 단계에 대 한 필요 하지 않습니다. SDS 페이지 캐스트 그라데이션 젤 (4-20%)의 각 음에 각 샘플의 상쾌한의 전체 볼륨 (50 µ L) 로드
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hypoxia, 식에 세포질 응답을 평가 하는 수준 및 HIF 1 복잡 한 다음 산소 치료의 구성 요소의 subcellular 지 방화 시험 되었다. HEK293A 셀 4 h hypoxic 조건 하에서 경작 또는 normoxia 컨트롤로 유지. HIF 1α 및 ARNT 단백질 수준 전체 셀에 시험 되었다 또는 서쪽 오 점 여 핵/세포질 추출. 으로 예상, 총 HIF 1α 레벨 upregulated hypoxia, 여 총 세포 lysates ARNT 수준을 크게 없었던 반면 (그림 1A)를 변경 합니다. 또한, hypoxia HIF 1α 및 세포질 표현의 ARNT 테스트 셀 라인19의 일부에서 검색 되지 않습니다 있지만 이전 보고서와 일치는 HEK293A 셀 (그림 1B)에 ARNT의 핵 축적을 유도 한다.
다음, 우리 HIF 1α와 hypoxia 치료 따르는 ARNT 간의 상호 작용을 시연 했다. 핵 추출 물 normoxic에 노출 하는 HEK293A 세포에서 준비 했다 또는 4 h. 공동 immunoprecipitation 실험 hypoxic 조건 HEK293A 세포에서 핵 추출 물을 사용 하 여 수행 했다. 그림 2에서 같이, HIF 1α hypoxic HEK293A 세포의 핵 추출 물에서 ARNT 함께 공동 immunoprecipitated 했다.
함께 찍은, 설명 하는 프로토콜 성공적으로 사용할 수 셀에 hypoxic 응답을 유도 하 고 더 endogenously의 생리 단백질 바인딩 결정 하는 핵 내에서 HIF-1α/ARNT 단지 표현.
그림 1: 단백질 표정 및 hypoxia에서 HIF 1 부품의 subcellular 지 방화의. (A) HEK293A 셀에 총 HIF 1α 또는 ARNT 표현의 Immunoblot 분석. 셀 4 h (H)에 대 한 저 산소 증에 노출 또는 normoxia (N)에 보관. 전체 셀 추출 물에서 단백질 SDS-PAGE로 분리 되었고 immunoblotting 안티-HIF-1α, 안티 ARNT와 반대로 glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH) 항 체에 의해 분석. GAPDH는 로드 제어로 사용 되었다. (B) HEK293A 셀의 subcellular 분수에서 HIF 1α 및 ARNT 표현의 Immunoblot 분석. HEK293A 셀 4 h (H)에 대 한 hypoxic 조건 하에서 경작 또는 normoxia (N)에 보관. 핵 또는 세포질 추출에서 단백질의 25 µ g immunoblotting 안티-HIF-1α, 안티 ARNT, 반대로 음과 양 1 (YY1)를 사용 하 여 분석 했다 및 안티-GAPDH 항 체. YY1와 GAPDH는 핵과 세포질 분수에 대 한 컨트롤을 각각 로드로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Hypoxic 조건 ARNT 상호 작용 하는 HIF-1α. HEK293A 셀 4 h에 대 한 저 산소 증에 노출 또는 normoxia 컨트롤로 유지. HEK293A 세포에서 핵 추출 물 준비 하 고 immunoprecipitations 안티 ARNT 항 체를 사용 하 여 수행 했다. 핵 (입력)을 추출 하 고 immunoprecipitated 단백질 immunoblotting 안티-HIF-1α, 안티 ARNT 및 안티-YY1 항 체를 사용 하 여 분석 되었다. YY1 로드 제어 입력에 대 한 IgG co immunoprecipitation 실험에 대 한 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 솔루션 | 구성 요소 | 코멘트 |
| 투 석 버퍼 | 20 mM Tris HCl (pH 7.4), 20% 글리세롤, 100 m m KCl, 0.2 m m EDTA, 0.2 밀리미터 PMSF와 0.5 m m DTT | 사용 직전 PMSF DTT 추가 합니다. |
| 실행 버퍼 | 2.5 m m Tris-HCl (PH 8.3), 19.2 m m 글리신 및 0.01% SDS | 900 mL ddH2오 트리 스/글리신/SDS 버퍼 x 100 mL 10 혼합 |
| 전송 버퍼 | 2.5 m m Tris-HCl (PH 8.3), 19.2 m m 글리신과 20% 메탄올 | 200 mL 메탄올과 700 mL ddH2오 트리 스/글리신 버퍼 x 100 mL 10 혼합 |
| TBS 버퍼 | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6) 및 150 mM NaCl | 900 mL ddH2오 믹스 100 mL 10 x TBS 버퍼 |
| TBS-T 버퍼 | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl 및 0.1% Tween 20 | 900 mL ddH2O와 트윈 20의 1 mL 믹스 100 mL 10 x TBS 버퍼. |
| 블로킹 버퍼 | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20와 5% 비-지방 우유 | 100 mL TBS T 버퍼에 압 급 차단기의 5 g을 분해. |
| IP 버퍼 | 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.2 %NP-40 및 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 | 사용 직전 프로 테아 제 억제 물 칵테일을 추가 합니다. |
표 1: 솔루션 준비입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIF 1 복잡 한 세포 산소 항상성의 마스터 레 귤 레이 터 이며 hypoxia 다른 세포질 적응 응답에 관련 된 유전자의 과다를 조절 합니다. 소설 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별 hypoxic 신호 변환의 이해를 위해 중요 하다. Co immunoprecipitation 실험 세포 신호 변환 통로 윤곽을 그리 다 PPIs 연구 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 단백질 overexpression 여전히 널리 사용 되 고이 실험 부작용으로 이어질 수 있습니다. 또한, HIF 1α 매우 불안정 한 단백질 이며 그것은 다시 산소11동안에 급속 하 게 저하 된다. 또한, hypoxia 대부분 포유류 세포 라인 구성 요소 HIF 1의 핵 전 좌를 트리거합니다. 따라서, 기존의 공동-immunoprecipitation 프로토콜 산소 치료 다음과 순수 관련 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별을 위해 최적화 해야 합니다. 여기, 우리는 hypoxia에서 HIF 1α와 ARNT 간의 상호 작용을 설명 하는 데 사용 되는 수정 된 공동-immunoprecipitation 프로토콜을 설명 합니다.
다시 산소 중 HIF 1α의 저하를 방지 하려면 hypoxic 세포는 미리 equilibrated hypoxic 조건 하는 인큐베이터 글러브의 처리 챔버 내부 수확 했다. DPBS 워시 버퍼 사용 전에 hypoxic 조건에 equilibrated도 했다. 처리에 사용할 수 없습니다 hypoxia 워크스테이션은, hypoxic 세포를 미리 equilibrated hypoxic DPBS로 하 고 얼음에 그 후에 신속 하 게 수확 수 있습니다. Hypoxia HIF 1 구성의 핵 전 좌를 실행할 수 있습니다 그 단백질 overexpression artefactual 결과 일으킬 수 있습니다 고려, 내 생 핵 단백질이이 프로토콜에서 사용 되었다. Co immunoprecipitation 프로토콜에 핵 추출 물의 사용 되었습니다20다른 사람에 의해 보고. 그것은 전체 세포 단백질에 의해 희석되에서 핵 단백질의 기회를 최소화 하기 때문에 핵 단백질 사이 상호 작용의 연구에 대 한 기술적인 우위를 나타냅니다. 또한, 핵 추출의 사용에 대 한 노출을 최소화 하 여 매우 풍부한 없는 세포질 단백질에서 특히 일반적인 상호 작용의 감소와 핵 단백질 안정성의 향상을 위한 도움이 될 수 있습니다. 프로 테아 제는 세포질에 존재합니다. 우리만 HIF-1α와 GABPα 내 생 핵 추출 물을 사용 하 여 하지만 전체를 사용 하지 않는 간의 상호 작용을 검색할 수 있습니다 공동-immunoprecipitation에 대 한 전체 셀 추출 물 대신 생 핵 추출 물을 사용 하 여 상당한 기술 개선을 보여줍니다. 셀17을 추출합니다.
설명된 프로토콜에서 여러 조건 추가 개선 결과를 최적화할 수 있습니다. 우리 4 h에 대 한 1% 산소와 함께 그들을 치료 하 여 HEK293A 세포에서 hypoxia 유발. 그러나 산소 수준 및 산소 치료의 기간 다른 세포 유형에 대 한 다양 한 고 연구의 목적에 따라 조정. 예를 들어, HIF 1α 및 HIF 2α 조정할 수 있습니다 차동 산소에 의해 세포 유형 특정 방식으로, 다른 생물학 문맥에서 그들의 고유한 역할을 나타내는. 그것은 신경 세포에서 HIF 1α는 가장 적극적인 강렬한 hypoxia (1% O2)의 짧은 기간 동안 HIF 2α 또한 온화한 저 산소 증 (5% O2)에서 활성 이며 활동적 다음과 같은 만성 저 산소 증 치료 (48-72 h의 된다 반면 표시 되었습니다. hypoxic 노출)21. 0-5% O2 레벨은 일반적으로 사용 산소 치료 체 외에서 1-5% O2, 0.1-1% O2 와 0-0.1% O2 는 자주 순으로 정의 된 저 산소 증, 저 산소 증 및 anoxia, 각각22. 소금 농도 PPIs23에 이오니아 상호 작용에 대 한 중요 한 역할을 한다 그것 때문에 특히 최적화를 필요로 하는 다른 매개 변수입니다. 핵 추출 핵 단백질 일반적으로 소금의 높은 농도 포함 하는 버퍼를 사용 하 여 추출 된이 연구에 사용 되었다. 따라서, 핵 추출 물 co immunoprecipitation 실험 전에 desalted 해야 합니다. 여기, 우리는 100 m m KCl를 포함 하는 투 석 버퍼를 사용 하 고 IP 버퍼 180 mM NaCl 생리 비슷한 150 m m 가까이 마지막 소금 농도 달성 하기 위해 비례 포함 된 dialyzed 추출 물 혼합 핵 추출 물 desalted 세포내 PPIs 조건입니다. 마지막 소금 농도의 PPIs의 속성에 따라 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 GAPDH는 전체 셀 추출 물과 세포질 분수에 대 한 로드 제어로 사용 되었다. 우리는 어떤 중요 한 hypoxia 유발 규제 효과 HEK293A 세포에서 GAPDH 식에 관찰 하지 않았다. 그러나, GAPDH는 이전 upregulated 것이 특정 세포 유형24hypoxia 표시 되었습니다. 이 염두에서에 두고, 하나는 대체 적절 한 로드 컨트롤 필요할 때 사용 해야 할 수25. 별도로, 구슬 또는 현재 프로토콜에 사용 되는 항 체에서 형태소 분석 신호 배경의 상당한 수준을 관찰 합니다. 백그라운드를 줄이기 위해, 하나 세척 단계 (10-15 분)를 연장 하거나 수행 3 이상의 세척 (5-10 시간) 수 있습니다. 또는, 워시 버퍼의 이온 강도 또한 세척 중 500 m m 150에서 소금 농도 titrating 하 여 늘릴 수 있습니다. lysates 단백질 A/G sepharose 구슬 회전 4 ° C에서 1 시간 배양 하 여 사전 허가 수 있습니다 또한.
이 프로토콜 핵 추출 물에 제한 되며, 같은 미토 콘 드리 아 및 바인딩과 그물 같은 다른 세포질 구획 내의 PPIs의 연구에 적합 되지 않을 수 있습니다. 다른 기존의 공동-immunoprecipitation 프로토콜와 마찬가지로,이 방법을 사용할 수 없습니다 PPIs 실시간으로 공부를 하거나 경우는 PPIs는 직접 또는 간접 확인 하.
요약, 우리 소설 순수 관련 HIF 1 상호 작용 단백질의 id에 대 한 수정 된 공동-immunoprecipitation 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 hypoxic 조건 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용의 연구에 적합 하다. 이 프로토콜은 산소 조건 하에서 co immunoprecipitation 실험을 위해 특별히 설계 되었습니다, 비록 normoxia 컨트롤 셀에 대 한 설명된 프로토콜의 일부는 normoxia 조건 하에서 핵 PPIs를 공부 하도 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 hypoxia 워크스테이션의 사용에 대 한 assoc. 교수 죄 Tiong 옹 감사합니다. 이 작품은 다음에 의해 지원 되었다: 싱가포르의 교육부, 모 1T1-02/04 MOE2015-t 2-2-087 (Y.A.)를, 의학, 난 양 기술 대학 시작 하기 위해 그랜트를 M4230003 (P.O.B.)의 리 홍콩 Chian 학교 스웨덴 연구 위원회는 가족 Erling 페르손 재단, Novo Nordisk 기초, Stichting af Jochnick 재단, 스웨덴 당뇨병 협회, Scandia 보험 회사, 당뇨병 연구와 복지 재단, 정박 폰 Kantzow의 기초는 카롤 린스 카 Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단에서 당뇨병에 전략적 연구 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
