Summary
Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.
Abstract
Analyse van de eiwituitdrukking in glioma is relevant voor de verschillende aspecten in de studie van de pathologie. Talrijke proteïnen zijn beschreven als biomarkers met toepassingen in de diagnose, prognose, classificatie, staat van progressie van de tumor en cel differentiatie staat. Deze analyses van biomarkers zijn ook handig voor het karakteriseren van de tumor neurospheres (NS) gegenereerd op basis van glioma patiënten en glioma modellen. Tumor NS bieden een waardevolle in vitro model voor de beoordeling van de verschillende kenmerken van de tumor waaruit ze zijn afgeleid en kan nauwkeuriger spiegel glioma biologie. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om biomarkers in tumor NS te analyseren met behulp van immunohistochemistry (IHC) op paraffine-ingebedde tumor NS.
Introduction
Gliomas zijn primaire solide tumoren van het centrale zenuwstelsel door hun fenotypische en genotypische kenmerken volgens de World Health Organization1ingedeeld. Deze indeling bevat de aanwezigheid of afwezigheid van bestuurder mutaties, die een aantrekkelijke bron van biomarkers2 vormen. Biomarkers zijn biologische kenmerken die kunnen worden gemeten en geëvalueerd om aan te geven van de normale en pathologische processen, evenals farmacologische reacties op een therapeutische interventie3. Biomarkers kunnen worden opgespoord in de tumor weefsel en cellen afgeleid van glioma, waardoor haar biologische karakterisering in verschillende aspecten. Enkele voorbeelden van glioma biomarkers gemuteerde isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1), een mutant enzym die kenmerkend zijn voor lager-grade gliomen betere prognose4is gekoppeld. Gemuteerde IDH1 wordt vaak uitgedrukt in combinatie met TP53 en alpha-thalassemie/mentale retardatie syndroom X-gebonden (ATRX)-inactiveren mutaties, vaststelling van een specifieke glioma subtype4,5. ATRX-inactiveren mutaties ook optreden in 44% van de pediatrische hoogwaardige gliomen2,6 en zijn geassocieerd met agressieve tumoren en instabiliteit van het genoom6,7. Daarnaast worden de pediatrische diffuus intrinsiek pontine gliomen (DIPG) onderscheiden in subgroepen volgens de aanwezigheid of afwezigheid van een K27M mutatie in gen H3F3A H3 Histon, of in de HIST1H3B/C gen1,6. Derhalve de invoering van moleculaire karakterisering vergunningen de Subdivisie studie en de behandeling van gliomen als afzonderlijke entiteiten, waardoor de ontwikkeling van meer meer gerichte therapieën voor elk subtype. Bovendien, kan de analyse van biomarkers worden gebruikt om te evalueren van de verschillende biologische processen zoals apoptosis8, autophagy9, celcyclus progressie10, cel proliferatie11en celdifferentiatie12 .
Genetisch gemanipuleerde dierlijke modellen die de genetische laesies aanwezig in menselijke kankers haven zijn essentieel voor de studie van signalering van trajecten die bemiddelen van progressie van de ziekte. Ons laboratorium heeft het gebruik van het Sleeping Beauty (SB) transposase systeem voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde Muismodellen van glioma herbergen specifieke mutaties die menselijke glioma subtypen13,14recapituleren geïmplementeerd. Deze genetisch gemodificeerde Muismodellen worden gebruikt voor het genereren van tumor-afgeleide NS, waarmee in vitro studies in een 3D systeem, mirroring salient eigenschappen presenteren in de tumoren in situ15. Ook kan de transplantatie van de orthotopical van NS in muizen secundaire tumoren die functies van de primaire tumor behouden en bootsen de histopathologische genomic en fenotypische eigenschappen van de overeenkomstige primaire tumor15genereren.
In serumvrij cultuur, tumor hersencellen met eigenschappen van de cel van de stam kunnen worden verrijkt en in aanwezigheid van epidermale groeifactoren (EGF) en fibroblast groeifactoren (FGF), kunnen ze worden geteeld als één cel-afgeleide kolonies zoals NS culturen. In dit systeem van selectieve cultuur sterven meeste onderscheidende of gedifferentieerde cellen snel, overwegende dat stamcellen verdelen en vormen van de cellulaire clusters. Hierdoor is de generatie van een NS-cultuur die glioma tumor functies16,17,18 onderhoudt. Glioma NS kan worden gebruikt om verschillende aspecten van de biologie van de tumor, met inbegrip van de analyse van biomarkers die toepassingen in de diagnose, prognose, classificatie, staat van progressie van de tumor en cel differentiatie staat hebben. Hier, we detail een protocol voor het genereren van glioma NS en de 3D culturen inbedden in paraffine worden gebruikt voor de kleuring van IHC. Een voordeel van vaststelling en glioma NS insluiten is dat de morfologie van de NS beter wordt gehandhaafd ten opzichte van de conventionele cytospin methode19, in welke glioma NS worden stressvolle manipulatie voor cel dissociatie en worden afgevlakt. Bovendien lest insluiten een endogene fluorophore expressie van genetisch gemanipuleerde tumor NS, waardoor over de fluorescerende spectra kleuring. Het algemene doel van deze methode is om te behouden de 3D structuur van glioma cellen door een proces te embedding paraffine en karakterisering van glioma neurospheres met behulp van immunohistochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. generatie van Brain Tumor Neurospheres afgeleid van een muismodel
- Vóór de dissectie-procedure, bereiden media van neurale stamcellen (NSC Media: DMEM/F12 met 1 x B27 supplement, 1 x N2 supplement, 1 x normocin en 1 x antibiotica/antimycotic aangevuld met menselijke recombinante EGF en basic-FGF bij concentraties van 20 ng/mL elk). Vullen van een tube 1,5 mL met 300 µL van NSC media en reserveren voor later.
- Selecteer een muis met een grote tumor.
Opmerking: De grootte van een tumor kan worden gecontroleerd door bioluminescentie als de plasmide of virus geïnjecteerd wordt gecodeerd luciferine. Meestal heeft een grote tumor een bioluminescentie van > 106 fotonen/s/cm2/sr. - De muis met een overdosis van Isofluraan euthanaseren: infusie van een papieren zakdoekje met Isofluraan en de invoering van het weefsel in een euthanization kamer, het vermijden van rechtstreeks contact met de muizen ter voorkoming van irritatie. Wacht totdat de muizen geen een pedaal reflex (gewoonlijk 5-10 min vertonen). Decapitate van de muis en het ontleden van de hersenen, zoals beschreven in Calinescu et al. 13.
- Als de tumoren TL, gebruikt u een ontleden Microscoop voorzien van een TL-lamp te identificeren van de massa van de tumor in de hersenen. Met een fijne Tang, ontleden de tumor (gewoonlijk 5-7 mm diameter) van de normale hersenweefsel.
- Plaats de ontleed tumor in de 1,5 mL tube met NSC media (stap 1.1). Meng de tumor met een disposable plastic stamper die in de muren van de microcentrifuge-buis past door zachte druk uit te oefenen.
- Te distantiëren van de cel bosjes, voeg 1 mL dissociatie van het enzym-vrije media en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Filtreer de celsuspensie door een 70 µm cel zeef en wassen van de zeef met 20 mL NSC media.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min, giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 6 mL of 15 mL NSC media, afhankelijk van de grootte van de pellet.
- Plaat de celsuspensie van de tumor in een kolf van T-25 of T-75 cultuur en cultuur bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met een sfeer van 95% lucht en 5% CO2.
- Na 3 dagen, breng de gezonde geschorste NS en plaat hen opnieuw in een maatkolf weefselkweek van T-25 of T-75. Voeg desgewenst meer NSC media toe aan de cultuur.
Opmerking: Meestal zal er een gemengde bevolking van cellen, sommigen zullen dood enkele zal hebben gehouden en sommige zullen vormen NS die zal worden gedreven in de media
2. behoud en Passaging van de NS
Opmerking: Voorkomen van begroeiing en onderhouden van cellen bij relatief hoge dichtheid. Samenvloeiing wordt bepaald door de grootte van de bollen (zwarte centra van grote bollen gemiddelde begroeiing). Het groeitempo op jaarbasis van de NS zal afhangen van de oncogenen gebruikt voor het genereren van tumoren.
- Zodra de NS cultuur stand confluentie gekomen tot, het verzamelen van de cultuur in een steriele centrifugebuis- and -pellet de NS bij 300 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 mL van de mobiele-detachement oplossing en Pipetteer om resuspendeer de pellet.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten, de buis flicking iedere 2 minuten om te helpen cel dissociatie.
Opmerking: Wanneer NS confluentie bereiken, ze kunnen worden meestal gezien macroscopisch als kleine witte bollen. Verzekeren cel dissociatie, ten minste alle de zichtbare NS moet zijn verdwenen. - Voeg 5 mL HBSS 1 x en Pipetteer meerdere malen. Pellet cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 5 mL NSC media aangevuld met recombinant EGF en basic-FGF.
- Voeg 1 mL cellen tot 15 mL NSC media en cultuur in een T-75 kolf bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met een sfeer van 95% lucht en 5% CO2.
- Toevoegen van groeifactoren (EGF en basic-FGF) om de 3 dagen. Als de media draait licht oranje en de cellen zijn nog niet confluente, wijzigen van de media. Om dit te doen, de NS bij 300 x g gedurende 4 min centrifugeren en resuspendeer in NSC media aangevuld met groeifactoren.
Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de pellet gevormd, cellen wellicht meer kolven worden gesplitst.
3. het bevriezen van NS voor langdurige opslag
- Zodra de NS cultuur confluente, distantiëren de cellen zoals beschreven in stappen 2.1-2.4. Zodra de pellet is opnieuw onderbroken in HBSS, een aliquoot gedeelte verwijderen en de cellen tellen.
- Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 4 minuten en verwijder zoveel mogelijk van de bovendrijvende substantie.
- Resuspendeer de pellet in de bevriezing van de media (warmte-geïnactiveerd FBS, 10% DMSO). Het is aanbevolen om bevriezen tussen 1 x 106 en 3 x 106 cellen per flacon per mL.
- Het opnieuw gesuspendeerde cellen in zoveel cryovials als nodig en langzaam afkoelen van de flesjes te delen door de eerste overdracht van hen aan ijs, dan tot-20 ° C, dan tot-80 ° C, en tot slot de volgende dag naar een opslagcontainer vloeibare stikstof.
4. fixatie van Tumor NS
- Cultuur tumor NS in een T-25 kolf gedurende 2-3 dagen tot cellen confluente worden (~ 3 x 106 cellen). Tumor NS in een conische tube van 15 mL van een ten minste één T-25 confluente kolf verzamelen. Pellet bij 300 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de pellet in 1 mL 10% formaline en houden bij kamertemperatuur (RT) voor 10 min. Voeg 5 mL van de 1 x HBSS pellet de cellen zoals gedaan in stap 3.2. Herhaal deze stap één meer tijd.
- Plaats de conische tube van 15 mL, met de pellet op ijs.
5. paraffine inbedding van Tumor NS
- Resuspendeer de pellet NS gewassen in 500 µL van 2% warme vloeibare agarose en meng zachtjes door pipetteren.
- Onmiddellijk plaatst de NS agarose-embedded op ijs totdat de agarose polymerizes. Verwijder het agarose stuk herbergen van de NS. Plaats de gepolymeriseerde agarose stuk met de NS in de cassette voor weefsel verwerkt (Figuur 2).
- Doorgaan met de bewerking (met behulp van een automatische paraffine-processor) en paraffine insluiten (met behulp van een insluiten station).
6. afdelen van paraffine-ingebedde NS
- Instellen van het waterbad tot 42 ° C en plaats het mes op de microtoom zorgvuldig gebruik te maken van twee verf penselen om ervoor te zorgen dat het wordt herverdeeld. Gebruik dit blad alleen voor trimmen.
- Plaats de paraffine blok op de microtoom. Met de niet-dominante hand, druk naar beneden op de hendel op de linkerkant, waarmee de dikte van elke sectie. Druk op om de tweede halte die een dikte 30 µm aangeeft.
- Beginnen met het knippen van het blok (dwz., het verwijderen van overtollige paraffine) door te draaien aan de grof handwiel met de rechterhand totdat het oppervlak van de steekproef is bereikt. Op dit moment laat de hendel waarmee de trim dikte 10 μm of 5 μm. Stop inkorten als het oppervlak van de steekproef is bereikt.
- Vul een koelbox met ijs en net genoeg water toe te voegen, zodat wanneer de paraffine blok is geplaatst op ijs, het water als een film rond de blok van paraffine fungeert, bescherming van het direct aanraken van het ijs. Incubeer de paraffine-blok op het ijs gedurende 20 minuten.
- Verwijderen van het oude blad en invoegen van een nieuwe transactie voor het segmenteren. Dry Block Kalibrator met behulp van gaas, dan plaatst u deze op de microtoom.
- Met de niet-dominante hand, een paar van gebogen verlostang die zal worden gebruikt voor het trekken van de paraffine lint te verkrijgen. Het houden van een vochtige kwast in de buurt van de rechterhand, die zal worden gebruikt om het lint paraffine overbrengen in het waterbad. Aan sectie beginnen door te draaien aan de grof handwiel met de rechterhand in een snel tempo. Gebruik het pincet in de linkerhand te houden van het lint van paraffine.
- De vochtige kwast gebruiken het lint paraffine overbrengen naar het waterbad.
- Gebruik de curve van de verlostang om te splitsen de secties door oppervlakkig plaatsen van de verlostang tussen twee paraffine secties en vervolgens voorzichtig de twee secties weg te duwen.
Opmerking: Deze resolutie moet volledig op het oppervlak van het gedeelte van de paraffine. Niet druk naar beneden op de sectie. - De vochtige kwast te duwen de gescheiden paraffine secties in positief geladen hechting Microscoop dia's gebruiken
- Laat de dia's te droog 's nachts binnen een chemische kap alvorens ze op te slaan in dia vakken. De opslag van dia's, is afhankelijk van het soort vlek uitgevoerd.
7. op grond van Immunohistochemistry (IHC) van paraffine-ingebedde NS
- Paraffine smelten door de dia's in een metalen rek en broeden ze op 60 ° C gedurende 20 minuten.
- De dia's door incubatie in een trein rehydratie bij RT deparaffinize: 3 x xyleen voor 5 min, 100% 2 x ethanol voor 2 min, 2 x ethanol van 95% voor 2 min, 70% 1 x ethanol voor 2 min en 1 x gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten Hereon, houd de dia's in leidingwater tot antigeen ophalen , als het uitdroogt zal leiden tot niet-specifieke antilichaam binding.
- Incubeer de dia's in de buffer van de citraat (citroenzuur van 10 mM, 0,05% niet-ionogene wasmiddel, pH 6) bij 125 ° C gedurende 30 s en bij 90 ° C gedurende 10 s. Laat ze afkoelen en spoel de dia's 5 keer met gedestilleerd water.
- Laat dia's op RT in 0,3% H2O2 gedurende 30 minuten inwerken.
- Wassen van de dia's 3 keer in de buffer (0,025% wasmiddel in TBS) voor 5 min met zachte agitatie wassen.
- Incubeer de dia's op RT met oplossing (10% paard serum, 0,1% BSA in TBS) gedurende 30 minuten geblokkeerd.
- Incubeer de dia's 's nachts bij 4 ° C in een bevochtigde kamer met primair antilichaam bereid in verdunning oplossing (0,1% BSA in TBS). Wassen van de dia's 3 keer in de buffer voor 5 min met zachte agitatie wassen.
- Incubeer de dia's op RT voor 1 h met biotinyleerd secundair antilichaam bereid in verdunning oplossing. Wassen van de dia's 3 keer in de buffer voor 5 min met zachte agitatie wassen.
- Incubeer de dia's op RT in het donker voor 30 min met mierikswortelperoxidase avidin-biotinyleerd complex. Wassen van de dia's 3 keer in de buffer voor 5 min met zachte agitatie wassen.
- Incubeer de dia's met DAB-H2O2 substraat merken hier voor 2-5 min op RT.
- 3 keer spoelen met kraanwater. Doop (1-2 s) dia's in de Haematoxyline oplossing voor counterstain, en spoel ze grondig in leidingwater tot verrekening.
- Uitdrogen van de dia's als volgt: broeden in gedestilleerd water gedurende 2 min 3 keer duik in 80% ethanol, incubeer in 95% ethanol 2 keer voor elke 2 min, incubeer in 100% ethanol 2 keer voor 2 minuten elk, en ten slotte in xyleen 3 keer voor elke 3 min.
- Dekglaasje aan de dia's met een medium xyleen gebaseerde montage en laat ze drogen op een vlakke ondergrond op RT totdat ze klaar voor de beeldvorming zijn. Opmerking: Als het uitvoeren van 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) kleuring, kunnen de dia's worden opgeslagen op RT. Als echter immunofluorescentie kleuring wordt uitgevoerd, dia's moeten worden opgeslagen in het donker bij-20 ° C om de foto-bleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We geanalyseerd om te controleren van de ontwikkeling van de tumor en beoordelen of de tumor de nodig voor het genereren van NS grootte heeft bereikt, de luminescentie uitgestoten door tumoren met bioluminescentie. Hierdoor is de studie van signaaltransductie doelmatigheid in de pups en de progressie van de tumor door het signaal van de luminescentie van luciferase (Figuur 1A en 1B). Wanneer de grootte van de tumor bereikt een signaal van 1 x 107 fotonen/s/cm2/sr (Figuur 1B), kan de hersenen verwerkt worden voor NS generatie. Een ander voordeel van dit systeem is dat de codering opeenvolging van verschillende fluorescente proteïnen kan worden toegevoegd aan de plasmiden gebruikt voor de levering en tumor generatie gen. We kunnen vervolgens de expressie van de genetische, ingevoegde wijzigingen bevestigen met behulp van een ontleden Microscoop voorzien van een TL-lamp (Figuur 1C). De NS gegenereerd op basis van wt-IDH1 (Figuur 1D) en mIDH1 (Figuur 1E) tumoren worden geïdentificeerd door de kenmerkende sferische morfologie, en de expressie van fluorophores gekoppeld aan de specifieke genetische laesie ( dwz., GFP geassocieerd met shATRX en shp53 en Katushka gekoppeld aan mIDH1; Figuur 1 D en 1E). Om verder te gaan met het IHC op NS, zijn cellen vastgesteld, dan ingebed in agarose en paraffine (Figuur 2). De NS in de paraffineblokken te Embedding heeft verschillende voordelen, met inbegrip van het behoud van 3D-structuren van de NS en waarbij voor langdurige opslag. De ingesloten NS kan worden gekleurd voor specifieke glioma biomarkers. Met behulp van deze techniek, we de expressie van ATRX, Ki67 en OLIG2 geanalyseerd (Oligodendrocyt differentiatie marker) (Figuur 3A-3_C). We hebben bevestigd dat de niveaus van de lage expressie van ATRX eiwitten in onze NS culturen (Figuur 3A), die een functie van de LGG glioma is subtype momenteel wezen studeerde4. Ki-67, een goed beschreven biomarker van celproliferatie, was ook positief in de mIDH1 NS (Figuur 3,B), demonstreren actieve proliferatie, dat een belangrijk kenmerk van tumorcellen is. Interessant, waren cellen gelokaliseerd in het midden van de grotere glioma NS clusters negatief voor Ki-67 (Figuur 3,B), die aangeeft dat zij niet prolifererende waren, in tegenstelling tot de Ki-67 positieve cellen gelokaliseerd aan de periferie. Dit fenomeen kan worden wijten aan het feit dat de perifere cellen hebben geen toegang tot voedingsstoffen uit de media groei. Wanneer zij deze grotere grootte hebt bereikt, moet de glioma NS worden losgekoppeld en gepasseerd. Ten slotte waren wt-IDH1 NS positief voor Olig2, een transcriptiefactor deelnemen aan Oligodendrocyt differentiatie (Figuur 3C).
Figuur 1 : Glioma neurospheres van GFP - en Katushka-positieve sleeping beauty (SB) hersentumor gegenereerd. (A) verlichte signaal van een pasgeborene muis geïnjecteerd met SB-transposase plasmide in combinatie met plasmiden herbergen genetische laesies ertoe glioma (NRI's / shP53/shATRX/IDH1-R132H). (B) luminescentie die aangeeft van de ontwikkeling van de tumor op 132 dagen na injectie (DPI). (C) een lichte-veld en fluorescerende beeld van een hersenen geoogst van een muis die het eindpunt stadium bereikt. Het gebied van de tumor is afgebakend door de stippellijn en positief voor de fluorescerende verslaggevers, GFP en Katushka. (D en E) Tumor neurospheres gegenereerd op basis van SB hersentumoren uiten GFP geassocieerd met shP53 en shATRX; en Katushka gekoppeld aan IDH1-R132H. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Vertegenwoordiging van de workflow voor paraffine-ingebedde glioma NS. NS zijn verzameld uit de kolf van een T-25 in een conische tube van 15 mL en vastgesteld in 10% formaline. Vervolgens zijn de NS gewassen met HBSS en ingebed in de 2% agarose. Gepolymeriseerde agarose met glioma NS worden geplaatst in een cassette voor weefsel verwerking en paraffine insluiten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatieve resultaten van immunohistochemistry met HRP-DAB detectie van biomarkers. (A-C) IHC uitgevoerd op paraffine-ingebedde mIDH1 glioma NS gekleurd voor ATRX (A) en Ki67 (B), en wt-IDH1 glioma NS gekleurd voor OLIG2 (C). Rode pijlen geven aan positieve cellen voor de biomerker kleuring. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel, we in detail te beschrijven een veelzijdige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van immunohistochemistry op paraffine-ingebedde glioma NS, die houden van de karakteristieke 3D structuur van tumorcellen in de hersenen in situgroeien. Deze techniek beschikt over de volgende voordelen ten opzichte van cuvetten verguld op glas of kunststof oppervlakken: ik) behoud van de 3D structuur van NS; II) voorkomen van stress van cel dissociatie vóór de analyse van eiwit expressie; III) het blussen van een endogene fluorophore expressie van genetisch gemanipuleerde tumor NS, waardoor kleuring over de fluorescerende spectra; en iv) langdurige opslag.
Een kritieke stap van deze techniek is om ervoor te zorgen dat de cellen opnieuw gesuspendeerde goed in de agarose om ervoor te zorgen dat zij worden homogeen verdeeld en niet samengeklonterd samen. Een beperking van deze techniek is de tijdrovende stappen in verband met het kweken van de cel en NS verwerking vóór het IHC kleuring van de procedure. Een tweede beperking is het hoge aantal cellen die nodig zijn om deze methode uit te voeren. Als het aantal cellen minder dan 1 x 106 cellen is, zal er te weinig cellen per gezichtsveld NS clusters in elke sectie. Het zou derhalve moeilijk te bereiken het ideale aantal cellen als de celcultuur glioma langzaam groeiende is. We gebruikten een confluente T-25 kolf met ten minste 3.0 x 106 cellen. Het aantal cellen die gebruikt kan worden gewijzigd als gewenst; het is echter nodig zijn om een NS-pellet van passende omvang voor het insluiten van de procedure. Na dit, de ingesloten NS kan worden behandeld als een reguliere paraffine-ingebedde blok, en het kan dan verder te segmenteren en IHC kleuring om eiwituitdrukking te analyseren met immunofluorescentie of IHC met DAB kleuring.
Na het segmenteren van de blokken en na het protocol voor IHC, moeten secties worden counterstained met haematoxyline (blauw). Als weefsel het doel-eiwit brengt, moet een bruin signaal zichtbaar (Figuur 3). Als na IHC de secties ook bruin zijn (hoge achtergrond), dit kan te wijten zijn aan 1) aspecifieke afwachtte van het secundaire antilichaam, 2) een onvolledige blussen van de endogene peroxidase, of 3) onvoldoende afscherming. Deze problemen kunnen worden opgelost door 1) met behulp van een dia van de negatieve controle (geïncubeerd alleen met een secundair antilichaam) te controleren van niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam, 2) de verbetering van de peroxydase blussen van tijd of 3) verbetering van de blokkerende incubatietijd. Aan de andere kant, als geen signaal wordt gevonden, is het mogelijk dat de epitopes nog worden gemaskeerd, die kan worden gerelateerd aan de aard van de buffer die wordt gebruikt voor het ophalen van het antigeen. In onze ervaring, kan we hebben bevredigende kleuring met citraat buffer, maar dit weefsel - en antilichaam-afhankelijke, en verschillende formuleringen voor antigeen ophalen buffers kunnen worden gebruikt zoals 0,1 M Tris-HCl (pH 8.0) buffer21. Dit zijn enkele van de meest voorkomende kwesties met betrekking tot IHC kleuring, maar als andere problemen zich voordoet, oplossen van problemen moet worden uitgevoerd als met elke andere IHC (dwz., proberen verschillende verdunningen van de primaire en secundaire antilichamen, verschillende blokkeren reagentia, blokkerende onverpakt, enz.).
Een alternatieve methode om eiwituitdrukking cuvetten met paraffine-ingebedde werd eerder beschreven door Hasselbach et al. 20. deze methode omvat niet de agarose stappen, waarmee in dit protocol voldoende speciale verdeling van de 3D-cel-clusters. Ook beschrijven we een nauwkeurige methode voor NS kweken, passaging en bevriezing voor langdurige opslag. Deze methode wordt ook geïllustreerd hoe verzamelen, bevestigen en het insluiten van NS zonder het wijzigen van 3D-structuur (Figuur 2).
Aangezien de NS kan worden gegenereerd vanuit glioma weefsel verkregen van patiënten en glioma diermodellen, vormt deze techniek een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het analyseren van biomerker expressie in verschillende glioma suptypes en valideren van de originele modellen. Hier beschrijven we de techniek met NS afkomstig is van genetisch gemodificeerde muizen met behulp van de SB transposase systeem (Figuur 1). Deze techniek kan echter ook worden gebruikt voor het analyseren van eiwitten in paraffine-ingebedde menselijke glioma cellen die als 3D culturen zonder wijzigingen in het protocol, dan de kweekomstandigheden cel groeien. Dus, deze methode kan ook worden toegepast op 3D culturen verkregen transplanteerbaar diermodellen, menselijke PDX-modellen en andere genetisch gemanipuleerde modellen. Tot slot, deze methode kan worden gebruikt met andere vormen van kanker, Muismodellen zowel menselijke kankers, naast gliomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders & beroerte (NIH/NINDS) subsidies R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 naar M.G.C.; NIH/NINDS verleent R01-NS076991, R01-NS082311 en R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; de Afdeling Neurochirurgie; De Happy Hearts Leahs M.G.C. en P.R.L.; en RNA biogeneeskunde Grant F046166 aan M.G.C. F.M.M. wordt ondersteund door een F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. werd gesteund door een Fulbright-Argentijnse ministerie van sport en onderwijs Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
