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Imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida

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DOI:

10.3791/61679

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4 de diciembre de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos protocolos para realizar imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores quimioatrayentes en neutrófilos de pez cebra

Resumen

La guía de leucocitos por gradientes químicos es esencial para las respuestas inmunes. Los neutrófilos son las primeras células en ser reclutadas en sitios de daño tisular donde ejecutan funciones antimicrobianas cruciales. Su tráfico a estos loci está orquestado por varios quimioatrayentes inflamatorios, incluidas las quimiocinas. A nivel molecular, la señalización quimioatrayente está regulada por el tráfico intracelular de los receptores correspondientes. Sin embargo, no está claro cómo los cambios subcelulares en los receptores de quimiocinas afectan la dinámica de migración de leucocitos a nivel celular y tisular. Aquí describimos una metodología para imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante las respuestas inflamatorias al daño tisular. Estas herramientas han revelado que el tráfico diferencial de receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra coordina la agrupación y dispersión de neutrófilos en sitios de daño tisular. Esto tiene implicaciones para nuestra comprensión de cómo las respuestas inflamatorias se auto-resuelven. Las herramientas descritas podrían utilizarse para comprender los patrones de migración de neutrófilos en una variedad de entornos fisiológicos y patológicos y la metodología podría ampliarse a otros receptores de señalización.

Introducción

La migración de leucocitos es de suma importancia para las respuestas inmunes. Las células inmunes son células migratorias prototípicas, que son notablemente capaces de atravesar tejidos y vasos sanguíneos y detectar una serie de señales de guía química para migrar direccionalmente hacia microbios u otras células huésped de importancia. La orientación correcta se basa en el reconocimiento de quimioatrayentes, entre los cuales las quimiocinas representan la categoría1 más prominente. Las quimiocinas son reconocidas por receptores altamente específicos acoplados a la proteína G de siete transmembranas. Tras la unión a quimiocinas, los receptores de quimiocinas cambian la conformación, lo que lleva a la activación de las proteínas G triméricas asociadas y su disociación en subunidades de señalización funcional que promueven cambios citoesqueléticos y migración dirigida1. Secundariamente, los receptores de quimiocinas están fosforilados, y esta modificación conduce a la desensibilización al atrayente, que puede ser seguida por una rápida resensibilización / reciclaje o degradación intracelular y regulación descendente de la superficie celular2. Esta dinámica de los receptores influye en la duración y la dosis de señalización recibida por las células, pero la forma en que afectan el comportamiento de migración de leucocitos ha sido difícil de dilucidar in vivo.

El seguimiento de la dinámica de los receptores en leucocitos vivos en sistemas tradicionales de mamíferos se enfrenta a varios desafíos. Para los estudios en vivo, las fusiones de receptores con proteínas fluorescentes deben expresarse en las células. Esto es un desafío en los leucocitos primarios, particularmente en neutrófilos, y los estudios hasta ahora han utilizado líneas celulares de neutrófilos sustitutos para expresar los receptores de quimiocinas 3,4. La generación de modelos de ratón transgénico, en los que los leucocitos expresan un receptor fluorescente o receptores mutantes con defectos de tráfico informativos 5,6, conlleva una considerable inversión de tiempo y recursos. Incluso en estos casos, la resolución de imágenes y el contraste para la dinámica de los receptores de imágenes en el animal vivo pueden ser limitados y los estudios han utilizado inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo5. Dados estos desafíos técnicos, nuestra comprensión de cómo la dinámica de los receptores quimioatrayentes afecta el comportamiento celular en un entorno de tejido vivo es actualmente limitada.

Aquí proporcionamos una metodología para monitorear el tráfico de receptores en neutrófilos de pez cebra. Los peces cebra son genéticamente tratables, como los ratones, pero la transgénesis es relativamente más sencilla mediante el uso de sistemas de transposones eficientes y la manipulación directa decigotos 7. La larva transparente es idealmente susceptible de imágenes. La dinámica del receptor de quimiocinas se ha visualizado en células germinales primordiales y en la línea lateral primordium mediante la expresión de fusiones correspondientes con reporteros fluorescentes 8,9,10. Las larvas de pez cebra están equipadas con neutrófilos maduros que tienen propiedades genéticas y celulares altamente conservadas con respecto a los neutrófilos de mamíferos. La dinámica de señalización subcelular como la dinámica citoesquelética y los reguladores de polaridad se han visualizado en estas células mediante la generación de las líneas transgénicas correspondientes 11,12,13. Recientemente, visualizamos y analizamos funcionalmente la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante el curso de las respuestas inflamatorias al daño tisular14. Aquí, describimos la generación de líneas reporteras transgénicas para la señalización de quimiocinas en neutrófilos, la preparación de embriones para imágenes en vivo, un ensayo de heridas para el estudio de la señalización de neutrófilos y el protocolo para la adquisición y análisis de imágenes. También proporcionamos un protocolo lateral para probar las respuestas de los receptores de quimiocinas a los ligandos candidatos, que es útil cuando se trata de establecer patrones de reconocimiento de ligandos en receptores no caracterizados. Estas técnicas se pueden utilizar en combinación con otras manipulaciones genéticas, como la inhibición de la expresión endógena de quimiocinas o la generación de receptores mutantes con tráfico alterado inducido por ligandos, para interrogar cómo la dinámica de señalización específica afecta el comportamiento de los leucocitos in vivo. Las líneas transgénicas que expresan receptores de quimiocinas marcados fluorescentemente también se pueden usar como reporteros para gradientes endógenos de quimiocinas, que de otro modo son difíciles de detectar por tinción directa de anticuerpos. La metodología descrita proporciona un margen para ampliar la generación de reporteros a otros receptores de inmunocopuntía.

Protocolo

NOTA: Todos los peces cebra se mantuvieron de acuerdo con las pautas de ARRIVE y las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido, la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986.

1. Generación de larvas de pez cebra reportera transgénica para el tráfico de receptores de imágenes en leucocitos

  1. Generar constructo basado en Tol2 para la expresión específica del tejido del receptor de interés marcado fluorescentemente. Para los neutrófilos, utilice secuencias promotoras de la lisozima C15 y el gen16 de la mieloperoxidasa. El constructo puede diseñarse como una fusión con una sola proteína fluorescente (por ejemplo, GFP), un temporizador fluorescente en tándem (por ejemplo, un GFP de plegamiento rápido y un tagRFP de maduración más lenta 8,14,17) o una expresión bicistrónica del informador GFP y un marcador de membrana de control9 (consulte Discusión para consideraciones al elegir el enfoque).
    NOTA: Este constructo no recapitula los niveles endógenos de expresión del receptor, pero es útil para obtener un alto nivel de expresión del receptor en el tipo celular de interés. Consultar la literatura sobre receptores similares 3,5,6,8,9,10,14 para decidir la posición de la etiqueta fluorescente.
  2. Instale un tanque que contenga machos y hembras adultos de tipo salvaje siguiendo las prácticas de cría estándar18, separados por una barrera el día antes del desove de los huevos.
  3. El día del desove de huevos, prepare la mezcla de transgénesis para la microinyección que contenga 12,5 ng/μL de construcción de ADN Tol2 y 17,5 ng/μL de ARNm7 de transposasa. Levante las barreras de las peceras poco después de que lleguen las luces por la mañana (esto puede variar en diferentes instalaciones de pesca) y recoja los huevos dentro de los 15 minutos para la inyección de ARNm.
    NOTA: Asegúrese de que la solución de ADN esté libre de RNasa para evitar la degradación del ARNm de la transposasa en la mezcla. Una opción para eludir esto es inyectar huevos con soluciones separadas de Tol2 construct y transposasa.
  4. Siga los protocolos estándar para la transgénesis y microinyección de huevos de pez cebra19.
  5. Inyecte 1 nL de la solución en la célula de embriones en etapa de una célula.
    NOTA: Los resultados de la expresión son más consistentes cuando se inyecta dentro de la célula y se descartan las inyecciones que pueden no estar claramente dentro de la célula. Los embriones en etapa de una célula están dirigidos debido a la variabilidad de la inyección de volumen por célula cuando se inyectan embriones en etapa de 2-16 células. Una opción sería separar las inyecciones en etapa de una célula de los lotes de inyecciones posteriores, en caso de que estas tengan diferentes eficacias.
  6. Revise los embriones inyectados más tarde en el día y retire los huevos no fertilizados o muertos para mantener la puesta sana.
  7. A los 3 días después de la fertilización (dpf), cribe a las larvas bajo un microscopio fluorescente. El marcador será visible en neutrófilos, particularmente en el tejido hematopoyético caudal (CHT), que es rico en estas células.
    NOTA: El porcentaje de células marcadas varía con diferentes construcciones, pero generalmente se espera que el 20-60% de los neutrófilos expresen la construcción. Los porcentajes más bajos generalmente predicen más exámenes de detección en la etapa adulta. Es una buena práctica verificar también la correcta localización del receptor en la membrana, con un enfoque de imagen de mayor resolución, en una muestra de estos embriones antes de cultivar los peces.
  8. Cultivar larvas positivas siguiendo las prácticas de cría estándar20. Estos representan la generación F0.
  9. A los 3 meses de edad, cribe F0 de pescado para fundadores. Cruce peces individuales con un tipo silvestre no transgénico y examine a su descendencia a 3 dpf para la expresión del receptor mediante la visualización bajo el alcance de disección. Dependiendo del éxito de la transgénesis, que varía con cada constructo, observe un porcentaje de descendencia positiva en un subconjunto de los cruces.
    NOTA: Para una buena transgénesis, alrededor de un tercio a la mitad de los adultos darán descendencia positiva. El porcentaje de descendencia que es positiva en un embrague varía con el número de copias de los transgenes insertados y, puede estar entre el 10-60%. Es útil realizar un seguimiento de las proporciones mendelianas dentro de las nidadas para identificar transgénicos de inserción única (estos se identifican más fácilmente en las nidadas F2 buscando una proporción del 50% de larvas positivas)20.
  10. Hacer crecer la descendencia positiva, que representa la generación F1.
  11. A los 3 meses de edad, evalúe a los adultos F1 de la misma manera para establecer una línea transgénica F2 estable.
  12. Realizar experimentos en larvas F2 después de validar la expresión específica de neutrófilos del transgén.
    NOTA: Durante la transgénesis, se pueden observar diferentes niveles de expresión del receptor y es aconsejable mantener diferentes nidadas transgénicas para obtener el nivel de expresión más adecuado para las cuestiones biológicas. Los resultados iniciales se pueden obtener en larvas F0 o F1.

2. Recolección de embriones de pez cebra para evaluar las respuestas de las heridas leucocitarias

  1. Después de haber establecido una línea estable de reporteros transgénicos, establezca un cruce entre peces transgénicos adultos y hembras y recoja huevos a la mañana siguiente.
  2. Cultivar embriones a 28,5 °C en medio E3 (o agua de huevo18).
  3. Opcionalmente, a 24 hpf, incubar embriones en un tubo de centrífuga que contenga 50 ml de medio E3 suplementado con lejía al 0,003% durante 5 min. Posteriormente enjuague 3 veces en medio E3 dejando reposar el tubo durante un par de minutos para permitir que los embriones se asienten en el fondo y luego decantando y reemplazando el medio.
    NOTA: Esto proporciona un nivel de control sobre la exposición a la infección de las larvas, lo que puede afectar el comportamiento de los leucocitos durante la herida.
  4. Después del blanqueamiento, mantenga los embriones en medio E3 suplementados con 0.003% de 1-fenil-2-tiourea para prevenir la síntesis de melanina. El azul de metileno, que a menudo se usa para prevenir infecciones por hongos, no se agrega aquí, para minimizar la autofluorescencia tisular.
  5. Permita que las larvas eclosionen naturalmente y use a 3 dpf cuando los neutrófilos son abundantes21.

3. Heridas ventrales de larvas

  1. Prepare las larvas para las heridas. Use larvas a 2.5-3.5 dpf, cuando se observen abundantes neutrófilos. Transferir larvas a medio E3 suplementado con 160-200 mg/L de tricaína MS222.
    NOTA: Las soluciones concentradas de tricaína deben prepararse y congelarse en alícuotas con anticipación y descongelarse en el día.
  2. Deje las larvas en medio E3 + tricaína durante 15 minutos para asegurarse de que estén anestesiadas. Verifique sus respuestas tocando suavemente con un pincel pequeño o una herramienta similar.
  3. Seleccionar larvas con expresión de receptores transgénicos bajo un endoscopio de disección fluorescente.
  4. Transferir larvas a una placa de Petri de 120 mm en E3 + tricaína para heridas. Usando un bisturí estéril se corta la aleta ventral de la larva, mientras se observa bajo el endoscopio de disección (Figura 1).
    NOTA: La idea es realizar un corte lo suficientemente profundo como para causar un reclutamiento sustancial de neutrófilos, pero sin cortar los vasos de la CHT. El corte se realiza perpendicular al eje CHT de tal manera que la incisión casi alcanza los vasos del CHT. Esto requiere algo de práctica y primero debe realizarse con supervisión sobre larvas que no se generan para este propósito (por ejemplo, exceso de larvas de otro experimento).

4. Preparación de larvas para imágenes vivas

  1. Disolver la agarosa de bajo punto de fusión (LMP) en medio E3 calentando para obtener una solución líquida de agarosa al 2%.
  2. Deje que esta solución se enfríe a 60 °C.
    NOTA: Mantenga un matraz o tubo con agarosa en una incubadora a 60 °C para evitar el fraguado de agarosa entre el montaje de diferentes larvas.
  3. Pipete 0,5 mL del líquido LMP + E3 en una placa con fondo de vidrio para imágenes de microscopía.
  4. Pipetea una larva de pez cebra herida y anestesiada junto con 0,5 ml de E3 + 2x Tricaine en el plato con fondo de vidrio.
  5. Mezclar suavemente las dos soluciones para obtener una solución de Agarosa/E3 de Tricaína al 1%, evitando la generación de burbujas. Oriente el embrión lateralmente y empuje suavemente hacia abajo para que la parte caudal del pez esté lo más cerca posible del vaso.
    NOTA: El tejido que se va a tomar como imagen debe estar lo más cerca posible del fondo de vidrio cuando se toman imágenes con un microscopio invertido. El ajuste de la orientación para la larva debe ser rápido para que la agarosa no se fije antes de que la larva se coloque.
  6. Deje que la solución de agarosa se enfríe y solidifique durante 5-10 min. Pruebe si la agarosa se fija tocando suavemente el gel de agarosa con un pequeño pincel o punta.
  7. Una vez que la agarosa esté sólida, agregue 2 ml de E3 suplementado con 0,2 mg / ml de tricaína a la placa de imágenes.

5. Imágenes confocales en vivo

NOTA: Imagen de embriones en un microscopio confocal de disco giratorio o equivalente (Figura 2). También se puede utilizar un microscopio de barrido láser, pero la resolución temporal de la dinámica será más limitante. Prepare los ajustes de imagen antes de traer la larva herida, para que la respuesta se pueda obtener la imagen lo más rápido posible después de la herida. Los neutrófilos llegan a la herida en 5 minutos y los receptores en las primeras células que llegan pueden internalizarse dentro de este período de tiempo. Con la práctica es posible obtener imágenes tan pronto como 15 minutos después de la herida.

  1. Encienda el microscopio: láser, cámara y computadora según las instrucciones del fabricante.
  2. Utilice el software de adquisición para configurar la configuración de imágenes. Elija láseres para los fluoróforos apropiados y tiempos de exposición aproximados basados en experimentos anteriores (adquiera GFP con 488 nm y tagRFP con láser de 561 nm).
  3. Transfiera la placa con el embrión montado, tan pronto como sea posible después de los juegos de agarosa, a la plataforma de disco giratorio de imágenes confocales.
  4. Use el ocular del microscopio para encontrar el pescado en el plato usando el joystick del escenario.
  5. Concéntrese en el área de la herida, usando la perilla de enfoque.
    NOTA: Para encontrar el área de interés puede ser más fácil utilizar un objetivo de aire de bajo aumento (10x).
  6. Seleccione el campo que desea obtener una imagen alrededor de la herida. Utilice un objetivo de 30x/40x con alta apertura numérica para obtener una resolución suficiente.
  7. Utilice los botones del software para ajustar el tiempo de exposición de modo que el marcador fluorescente se pueda ver con buen contraste pero sin saturar la señal.
    NOTA: El tiempo de exposición debe ser lo más bajo posible para minimizar la exposición fluorescente y maximizar la resolución temporal en el lapso de tiempo. La potencia del láser depende de la condición del láser, pero debe ajustarse a un nivel que permita un tiempo de exposición lo suficientemente bajo para la obtención de imágenes dinámicas.
  8. Utilice los botones del software para seleccionar el volumen a la imagen como una pila z
  9. Configure un lapso de tiempo cada 30 s durante la duración deseada.
    NOTA: Para heridas de aleta ventral estériles, el reclutamiento máximo se observa por 2-3 h.
  10. Antes de iniciar el lapso de tiempo, tome una instantánea de campo brillante para documentar el campo de visión. Si es posible, adquiera un campo brillante dentro de la película de lapso de tiempo.

6. Cuantificación de la internalización del receptor en neutrófilos de pez cebra

  1. Registre el intervalo de tiempo de adquisición de la imagen y el tamaño de píxel de la imagen. Mantenga un registro de cuántos minutos después de la herida comenzó la imagen.
  2. Abra los conjuntos de datos de imágenes utilizando Fiji arrastrando la imagen a la interfaz del software, seleccione un marco de interés representativo para cada conjunto de datos utilizando el control deslizante de tiempo, por ejemplo, a las 1-1,5 h después de la herida, y guárdelo.
  3. Continúe con MATLAB para procesar el dataset de imágenes.
  4. Cree un nuevo script e incluya funciones para la lectura de imágenes (línea 6 en el script llamado 'select_neutrophils.m' para la definición de centroide en el archivo suplementario 1), apertura (línea 11 en el archivo complementario 1) y selección manual de puntos en la imagen (línea 12 en el archivo complementario 1).
  5. Abra el marco de interés ejecutando este script (Archivo complementario 1), identifique los neutrófilos a analizar mediante inspección visual, haga clic en ellos y registre una estimación de sus centroides, tanto en la herida de la aleta ventral como en el CHT.
    NOTA: Los neutrófilos no movilizados en el CHT sirven como referencia interna para los neutrófilos cuya distribución de receptores permanece constante. Esto permite la normalización de los valores de contraste de las células en la herida a una referencia interna.
  6. Proceda con la segmentación de los neutrófilos en cada fotograma utilizando la técnica de contornos activos22 como se describe en los pasos a continuación.
  7. Cree una función para incluir los metadatos necesarios para la segmentación por contornos activos (es decir, número de iteraciones, sesgo de contorno, centroide estimado, etc.) 22 (véanse los «datos de heridas.m» en el expediente complementario 2).
  8. Cree un script que llame a la función 'wound_data.m' para ingresar la información necesaria para la segmentación de cada neutrófilo (línea 28 en script llamado 'calc_contrast.m' en el Archivo Suplementario 3).
  9. Incluya en el script comandos para la lectura de imágenes (línea 32 en el archivo complementario 3).
  10. Agregue la generación de una imagen negra (es decir, una imagen donde los valores de píxeles son ceros) con un tamaño igual a la imagen de entrada (línea 44 en el archivo complementario 3) y la definición de un cuadrado de 10 × 10 píxeles alrededor del centroide de cada neutrófilo (línea 45 en el archivo complementario 3).
  11. Incluir la segmentación de neutrófilos mediante contornos activos (líneas 48-49 en el archivo complementario 3) y la eliminación de pequeños objetos falsos detectados (línea 52 en el archivo complementario 3).
    NOTA: El contorno de segmentación inicial es el cuadrado alrededor del centroide, que evoluciona mediante la técnica de contorno activo en función de las intensidades de píxeles, el número de iteraciones y el sesgo del contorno. El resultado de la segmentación es una máscara binaria donde todos los píxeles tienen valor 0 excepto el área de neutrófilos cuyos píxeles tienen valor 1.
  12. Incluir la multiplicación de la imagen binaria segmentada con la original para obtener las intensidades de píxeles del neutrófilo solamente, siendo el resto de la imagen no-un-número, por lo que no contribuye a los cálculos (líneas 56-57 en el Archivo Complementario 3).
  13. Agregue el cálculo de la matriz de co-ocurrencia de nivel de gris para cada neutrófilo (GLCM)14,23 (línea 61 en el Archivo Suplementario 3). GLCM es otra representación de la imagen que muestra la posición relativa de los píxeles en términos de intensidad de píxeles.
  14. Incluir el cálculo del contraste del neutrófilo basado en el GLCM (líneas 62,65 en el Expediente Complementario 3). La métrica de contraste mide las diferencias de intensidad entre los píxeles vecinos. Los píxeles se comparan con píxeles a cierta distancia, que se pueden ajustar empíricamente en función del tamaño de los picos locales en intensidad. Como indicación, para las imágenes, con un tamaño de píxel de 0,389 μm, cuando el receptor mostró distribución vesicular, cada punto brillante estaba en el rango de 5 píxeles. Por lo tanto, las intensidades se compararon en píxeles espaciados 5 píxeles de distancia.
  15. Agregue comandos para guardar los valores por separado para neutrófilos individuales en la aleta ventral (línea 68 en el archivo complementario 3).
  16. Incluya el cálculo del valor medio de contraste de neutrófilos de todos los neutrófilos CHT de la misma manera que para los neutrófilos en la herida (líneas 72-119 en el archivo complementario 3). Para los neutrófilos CHT, llame a la función 'cht_data.m' (línea 77 en el archivo complementario 4).
  17. Incluir la normalización del valor de contraste de neutrófilos individuales en la herida al contraste medio de neutrófilos CHT calculado anteriormente en el paso 6.16 (es decir, división) (línea 122 en el Archivo Complementario 3). Esto da un contraste normalizado que refleja cuán "puntiaguda" es la apariencia del receptor en las células que responden individualmente en relación con las células de control que no responden (Figura 3 y Figura 4).
  18. Ejecute el script (archivo complementario 3) haciendo clic en el símbolo de ejecución en el software.
  19. Repita todos los pasos para diferentes condiciones.
  20. Utilice software estadístico (consulte la Tabla de materiales) para importar los resultados de las diferentes condiciones mediante la creación de una tabla de columnas, trazar los resultados y realizar pruebas estadísticas para verificar la significación de la diferencia entre los valores medios.
    NOTA: Los códigos para el análisis también se pueden encontrar en GitHub en https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic

7. Ensayos de respuesta a quimiocinas en embriones tempranos

NOTA: Este es un experimento secundario opcional que permite probar los cambios en la distribución del receptor en respuesta a una quimiocina candidata y es independiente de los experimentos descritos anteriormente con respecto a la expresión de neutrófilos de las construcciones del receptor. Las diferencias en el tráfico inducido por ligandos entre receptores son difíciles de establecer con esta técnica ya que los niveles de ligandos están saturando14. Sin embargo, si uno ve la internalización del ligando de un receptor en este sistema, esto puede ser una indicación de que el ligando es reconocido por el receptor en los casos en que la identidad del ligando no está clara. Esto es útil, porque la expresión de los receptores de quimiocinas en líneas celulares establecidas como las células HEK293T14 puede ser engorrosa.

  1. Coloque una cruz de peces de tipo salvaje (por ejemplo, AB) y recoja los huevos a la mañana siguiente poco después de levantar los separadores (como se describió anteriormente).
  2. Inyecte 100 pg de ARNm del receptor marcado fluorescentemente (por ejemplo, Cxcr1-FT), junto con 100 pg de ARNm para un marcador de membrana (por ejemplo, CFP de membrana). Incluya en la mezcla dosis variables de ARNm para el ligando de quimiocinas.
    NOTA: Como indicación, el ARNm Cxcl8a de 150 pg dio una internalización prominente del Cxcr1-FT fluorescente (ver Figura 5).
  3. Enjuague los embriones con medio E3 e incube a 28°C.
  4. A aproximadamente 7 hpf, pruebe la expresión del ARNm en un endoscopio de disección fluorescente y seleccione los embriones a los que desea obtener una imagen.
  5. Preparar con antelación la agarosa LMP al 0,8 % y conservar en tubo de vidrio en un bloque térmico a 60 °C. Use una pipeta de vidrio para manipular los embriones. Descoria suavemente los embriones usando un par de fórceps en cada mano.
  6. Aspire un embrión individual dechorionado con la pipeta de vidrio asegurándose de que no haya burbujas en la punta. Libere suavemente el embrión en el tubo de agarosa permitiendo que se hunda en el tubo.
  7. Aspirar el embrión desde el tubo de agarosa, recogiendo un poco de agarosa líquida en el camino. Libere suavemente el embrión en el centro de un plato de imágenes con fondo de vidrio. Gire rápidamente el embrión para que el polo del animal esté mirando hacia el fondo del plato (este lado debe estar más cerca del objetivo cuando se usa un microscopio invertido).
    NOTA: Es posible que sea necesario reajustar la orientación de los embriones mientras la agarosa aún se está estableciendo.
  8. Después de que se establece la agarosa, complemente con 2 ml de medio E3.
    NOTA: Los embriones en esta etapa son muy frágiles en comparación con las larvas y se necesita algo de práctica para descorar y montar. Es importante aspirar y liberar lo más suavemente posible, para evitar la ruptura embrionaria.
  9. Repita el proceso con el objetivo de cargar de 3 a 5 embriones por plato.
  10. Imagen de embriones en un microscopio confocal invertido (ver Tabla de Materiales). Utilice un objetivo de aceite de 40x/1.3 NA para obtener una resolución lo suficientemente alta. Visualice mCFP, sfGFP y tagRFP con 405, 488 y 552 nm, respectivamente, en el ámbito. Ajuste los filtros y la configuración para tener un alto contraste mientras evita la saturación y minimiza las fugas entre los canales.
  11. Repita el montaje y la obtención de imágenes para diferentes condiciones.

Resultados

La herida de la aleta ventral es seguida por una rápida movilización de neutrófilos desde el CHT hacia la aleta ventral y la agrupación en el margen de la herida, dentro de los 30-60 min (Figura 1). Visualizamos la distribución de dos receptores de quimiocinas, Cxcr1 y Cxcr2, que son expresados por los neutrófilos de pez cebra24 y reconocen Cxcl8a y Cxcl8b14, utilizando microscopía confocal de disco giratorio. Generamos dos líneas transgénicas correspondientes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) y Tg(lyz:Cxcr2-FT), en las que los neutrófilos expresan un constructo de temporizador fluorescente (FT) del receptor, es decir, una fusión con un tándem de sfGFP y tagRFP (Figura 2 y referencia14). El uso de los dos fluoróforos estaba destinado a permitir el monitoreo de una amplia gama de destinos de receptores y proporcionar estimaciones del tiempo de renovación de proteínas en la membrana plasmática, ya que los receptores recién sintetizados fluorescen en verde y progresivamente se volverían rojos a medida que envejecen 8,14. Sin embargo, se encontró que estos receptores tenían un rápido recambio constitutivo en la membrana plasmática de neutrófilos y que el tiempo de residencia era más corto que el tiempo de maduración de tagRFP, con sfGFP mostrando localización de membrana y tagRFP mostrando localización vesicular en estado estacionario (Video suplementario 1 y ref14). Por lo tanto, nos centramos en la distribución de sfGFP para monitorear la internalización inducida por ligandos en sitios de daño tisular. El patrón de distribución del receptor se cuantificó utilizando la métrica de contraste, que informa las diferencias de intensidad entre los píxeles vecinos. La razón es que cuando la distribución del receptor es membranosa y suave, el valor de contraste es bajo. Cuando la distribución del receptor es vesicular y más punteada, entonces el valor de contraste es alto (Figura 3).

Un método alternativo es cuantificar la relación entre los niveles de receptores (intensidad de sfGFP) sobre los niveles de un marcador de membrana de control, por ejemplo, CFP de membrana (mCFP) (Figura 3). Ambos métodos podrían detectar la internalización del receptor, como lo indica un patrón de distribución de receptores vesiculares más globalmente en la célula (mayor valor de contraste) o niveles más bajos de receptores en la membrana (menor relación sfGFP / mCFP). Sin embargo, la métrica de contraste también pudo detectar la internalización del receptor en grupos de neutrófilos en la herida, en los que la segmentación de la membrana fue menos precisa y no aplicable (Figura 3). Utilizando esta métrica, pudimos cuantificar las diferencias visibles entre el tráfico de Neutrófilos en las heridas de Cxcr1 y Cxcr2 (Figura 4 y Video Complementario 2). Cxcr1-FT internalizado en células localizadas en la herida, mientras que Cxcr2-FT permaneció membranoso en neutrófilos en la herida (Figura 4A-C, Video Suplementario 2 y Video Suplementario 3). La supresión de Cxcl8a y Cxcl8b, mediante tratamiento con morfolino, afectó diferencialmente la internalización de Cxcr1-FT en las heridas (Figura 4C,D). Para validar aún más que Cxcr1-FT responde a Cxcl8a, realizamos ensayos de respuesta de quimiocinas en embriones tempranos. Encontramos que Cxcr1-FT se interiorizó marcadamente en embriones en los que Cxcl8a fue coexpresado (Figura 5). En conjunto, estos resultados indican que los métodos descritos se pueden implementar para medir la internalización del receptor inducida por quimiocinas en neutrófilos y establecer la identidad del ligando que media estos efectos.

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Figura 1: Migración de neutrófilos a heridas de aleta ventral. (A) (Izquierda) Caricatura de larva de 3 dpf que muestra la ubicación del tejido hematopoyético caudal (CHT), la circulación de venus (VC, azul), la aleta ventral (VF) y el sitio de la herida. (Derecha) Caricatura que representa el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT y se agrupan en la herida. El plexo de la vena caudal (CVP) del tejido CHT se dibuja en azul. (B) Imagen de campo brillante (izquierda) y proyección confocal (derecha) que muestra la herida de la aleta ventral y la distribución de neutrófilos en larvas de Tg (mpx: GFP) a las 2 h después de la herida. Las líneas discontinuas muestran los contornos vf y CHT. Barra de escala = 25 μm. Caricatura e imagen fluorescente modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas en neutrófilos. (A) Constructos utilizados para la expresión transgénica específica de neutrófilos de Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) y Cxcr2-FT. Proyecciones confocales de neutrófilos en la cabeza de una larva transgénica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), arriba; Tg(lyz:Cxcr2-FT), abajo) mostrando los canales tRFP (magenta) y sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatómico de larva de 3 dpf como en la Figura 1A. Debajo de la larva hay esquemas que representan el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT (parte superior) o realizan quimiotaxis al ingresar a la aleta ventral (abajo). El cuadrado discontinuo indica el área fotografiada en instantáneas a la derecha. (C) Neutrófilos en larvas de Tg(lyz:Cxcr1-FT) (se muestra sfGFP) al movilizarse desde el CHT (paneles superiores) o quimiotaxis hacia la herida (paneles inferiores). Las flechas muestran las mismas celdas a lo largo del tiempo. Los puntos de tiempo en la imagen de la derecha son minutos transcurridos después de la imagen de la izquierda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representación esquemática del enfoque experimental para la obtención de imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas. Paneles A-C modificados de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ejemplos de cuantificación de la dinámica de los receptores. Los neutrófilos individuales (azules) o agrupados (verdes) en las heridas o los neutrófilos no movilizados en el CHT (rojo, naranja) fueron segmentados y analizados por diferentes métodos para comparar los resultados. Las mismas celdas de ejemplo mostradas fueron analizadas con dos métodos para relacionar lo que se ve en la imagen con el rango de valores extraídos. (A) La superficie de las celdas de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal sfGFP. (B) El contraste se calculó a partir de las células de ejemplo que se muestran en A. (C) La membrana de las células de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal CFP. Se siguió un análisis ratiométrico de sfGFP/CFP. (D) La relación sfGFP/CFP se calculó sobre las celdas de ejemplo que se muestran en C. Las barras de error representan S.E.M. a partir de celdas individuales, en casos de n>1, los valores aquí no se utilizaron para el análisis estadístico sino simplemente para ejemplificar las mediciones obtenidas con los diferentes métodos de cuantificación. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Dinámica diferencial de Cxcr1 y Cxcr2 en respuesta a heridas. (A) Proyección confocal de neutrófilos en larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) en la herida a los 80 min post-herida (se muestra el canal sfGFP). Barra de escala = 10 μm.  (B) Neutrófilo Cxcr1-FT magnificado (izquierda) y Cxcr2-FT (derecha) en la herida. El receptor verde se muestra en gris. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado al contraste medio de células no movilizadas en el CHT). cxcl8a se refiere a la inyección de un bloqueo de empalme junto con un morfolino que bloquea la traslación para cxcl8a. cxcl8b se refiere a la inyección con un morfolino que bloquea el empalme para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (herida) de 8 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) y n=20 células (herida) de 3 larvas. Los datos se agruparon a partir de larvas independientes adquiridas en 1-5 sesiones de imágenes. Prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn para Tg(lyz:Cxcr1-FT), prueba de Mann-Whitney de dos colas sin aparear para Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Proyección confocal de neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) tratadas con cxcl8a morfolino (MO) (izquierda) y cxcl8b MO (derecha) respondiendo a heridas en las aletas (canal sfGFP mostrado en verde). Instantánea tomada en puntos de tiempo de acumulación equivalente de neutrófilos (85 min post-herida en la imagen izquierda y 45 min post-herida en la imagen derecha). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Ensayo de respuesta a quimiocinas en embriones tempranos. Se inyectaron cortes confocales de barrido láser de embriones gastrulatantes que muestran expresión y distribución de Cxcr1-FT. Se inyectaron 100 pg de ARNm Cxcr1-FT en un óvulo en etapa celular con o sin ARNm Cxcl8a de 150 pg. Los receptores verde y rojo se muestran en canales separados. El marcador CFP de membrana de control (mCFP) se muestra en el canal cian. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película suplementaria 1: Neutrófilos transgénicos en la cabeza de una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para descargar este video.

Película complementaria 2: Neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) que responden a heridas en las aletas. La película comienza dentro de los 10 minutos posteriores a la herida y dura 60 minutos sfGFP (verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 10 fps. CHT = tejido hematopoyético caudal. VF = aleta ventral. Barra de escala = 25 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para descargar este video.

Película suplementaria 3. Ejemplos adicionales de neutrófilos de una larva transgénica Tg(lyz:Cxcr1- FT) herida (larva diferente a la que se muestra en el Video 2), adquirida a mayor resolución, mostrando internalización del receptor (canal sfGFP mostrado en verde) al movilizarse en el CHT o al ingresar y quimiotaxis en la aleta ventral. El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para descargar este video.

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Discusión

El método descrito permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los receptores en respuesta a ligandos endógenos in situ durante una respuesta inflamatoria al daño tisular. El uso de reporteros de neutrófilos Cxcr1/Cxcr2 podría ampliarse a otros entornos fisiológicos, como infecciones, modelos tumorales u otros tipos de daño tisular 14,25,26,27. Además, las líneas de rescate transgénico, en las que el receptor endógeno es suprimido y rescatado por un receptor mutante exógeno, podrían proporcionar herramientas útiles para diseccionar la importancia de los patrones específicos de migración de neutrófilos en las respuestas inmunes. Por ejemplo, los mutantes del receptor Cxcr1 que tienen una desensibilización deteriorada causan agrupamiento de neutrófilos más prominente en los sitios inflamatorios14. Esta ganancia de fenotipo de función podría usarse para comprender el papel de la congregación de neutrófilos en diferentes procesos fisiológicos, por ejemplo, reparación de heridas, enfermedades infecciosas o evolución tumoral, y experimentos de derribo / eliminación de receptores del complemento. La metodología también proporciona una base para ampliar la gama de reporteros disponibles. La elección del reportero fluorescente es importante de considerar y depende de la cuestión biológica. Encontramos que el recambio constitutivo de estos receptores de quimiocinas en neutrófilos fue alto, en comparación con las células epiteliales, y que los reporteros con maduración rápida (p.ej., sfGFP) debían informar los niveles de membrana en estado estacionario y resolver las diferencias tras la estimulación de neutrófilos 8,14. Por lo tanto, las proporciones de membrana de sfGFP / tagRFP no son aplicables para medir la internalización inducida por ligandos en este tipo de célula, pero el patrón de tagRFP permite el seguimiento de los destinos intracelulares del receptor, lo que podría ser útil en algunos estudios. También encontramos que la señal intracelular más concentrada de tagRFP es útil para la detección de larvas individuales. Un enfoque alternativo para medir los niveles de receptores en la membrana plasmática sería coexpresar un marcador de membrana fluorescente en neutrófilos, ya sea en el mismo transgén9 o en un transgén14 independiente. En el primer escenario, el transgén proporcionaría un medio adicional para examinar a los peces y los niveles de expresión serían comparables entre el marcador y el receptor. Este último enfoque sería más modular, ya que una línea de pez cebra con un reportero receptor podría combinarse con diferentes líneas de reportero. En cualquier caso, vale la pena señalar que la cuantificación de la membrana de los niveles del receptor es un desafío en los neutrófilos agrupados (ver más abajo). Finalmente, observamos que una posible extensión de este protocolo sería hacer un seguimiento de las imágenes en vivo por inmunohistoquímica para análisis de localización más detallados.

El sistema de transgénesis Tol2 está bien establecido7 y el promotor de lisozima C se ha utilizado ampliamente para la expresión de neutrófilos11,15. El enfoque de transgénesis es, por lo tanto, relativamente sencillo y el nivel de expresión alcanzado con este promotor es lo suficientemente alto como para proporcionar suficiente contraste para el análisis de la dinámica del receptor. Una posible limitación es que el nivel de expresión no recapitula los niveles de expresión del receptor endógeno. Se podrían implementar nuevas tecnologías CRISPR para establecer líneas de llamada para receptores de particular interés28. Estas tecnologías siguen siendo engorrosas y pueden no garantizar los niveles de expresión requeridos para las imágenes subcelulares, pero su desarrollo exitoso sería un avance importante para comprender la dinámica de señalización endógena. Las validaciones funcionales son importantes para interpretar los datos con construcciones de receptores transgénicos. Por ejemplo, los ensayos de reconocimiento de ligandos se pueden utilizar para establecer que la proteína de fusión fluorescente es funcional y el rescate de fenotipos knockout podría utilizarse para establecer que los niveles de expresión de neutrófilos transgénicos son compatibles con la funcionalidad14. Finalmente, una forma más directa de validar la fusión del receptor sería utilizar un ensayo funcional in vitro con receptor etiquetado junto con las versiones no marcadas14.

El enfoque de cuantificación aborda dificultades específicas en la segmentación precisa de la membrana en neutrófilos in vivo. En células de naturaleza epitelial, la cuantificación de los niveles de receptores se puede ejecutar automáticamente normalizando los niveles de receptores de membrana a un marcador de control, que se puede expresar en tándem o por separado9. De hecho, hemos aplicado este enfoque, al utilizar el ensayo de reconocimiento de ligandos en embriones gastrulatantes14. Sin embargo, los neutrófilos experimentan cambios complejos y rápidos en la forma de la célula in vivo, lo que dificulta la segmentación de la membrana tanto en 2D como en 3D14. Esto es aún más difícil cuando los neutrófilos se agrupan, lo que ocurre en muchos entornos fisiológicos29. La métrica de contraste supera esta limitación, ya que no requiere segmentación de membrana, sino que refleja el estado general de distribución del receptor en la célula (membranoso / liso vs vesicular / puntiagudo). Es importante tener en cuenta que la métrica de contraste puede verse afectada por el contraste general de la imagen, por lo que se requiere la normalización de los valores celulares individuales a una referencia interna para tener en cuenta la variabilidad de la señal en diferentes embriones / muestras. Por ejemplo, utilizamos el valor medio de contraste celular de neutrófilos no sensibles en la CHT (es decir, neutrófilos que permanecen estacionarios y no migran a la aleta ventral)14. Una posibilidad adicional sería normalizar con valores de contraste de un marcador de control en la misma celda. Esto proporcionaría una solución cuando no se dispone de una referencia interna de células que no responden y es probable que resuelva diferencias cuantitativas más finas en la dinámica del receptor entre diferentes afecciones.

La ubicación de las imágenes es otra variable a considerar. La razón para elegir la herida de la aleta ventral aquí, a diferencia del modelo de herida de la aleta caudal más comúnmente utilizado16,30, es porque el sitio de la herida está cerca del sitio de residencia de neutrófilos / origen migratorio. Esto acelera la línea de tiempo del ensayo, ya que los neutrófilos tardan relativamente poco tiempo en llegar. Además, brinda la oportunidad de capturar el comportamiento celular tanto en el origen de la migración (CHT) como en la ubicación objetivo de interés (herida). Esto es relevante aquí, porque la resolución espacial y temporal requerida para las imágenes subcelulares es difícil de combinar con un gran campo de visión o escaneo de múltiples posiciones. Así, el ensayo de herida de aleta ventral permite rastrear la evolución de la respuesta migratoria desde el origen migratorio y la captura simultánea de fluctuaciones inespecíficas del receptor en células que no responden. Como se mencionó anteriormente, este último es útil para fines de cuantificación, ya que proporciona una referencia interna para dinámicas inespecíficas. En otros sistemas, puede que no sea posible disponer de una referencia interna de este tipo, en cuyo caso los valores de contraste de un marcador de membrana coexpresado proporcionarían un control alternativo.

En resumen, anticipamos que la metodología es aplicable a otros sistemas y se puede implementar para una variedad de propósitos. Por ejemplo, los mismos reporteros podrían utilizarse en otros entornos inflamatorios, como entornos de infección u otros modelos de enfermedad. El repertorio de líneas reporteras de receptores de pez cebra podría ampliarse a otros receptores de señalización, para comprender los mecanismos de señalización o informar sobre la dinámica del ligando in vivo. El enfoque se puede combinar con técnicas de derribo / nocaut para interrogar la base mecanicista de la dinámica observada. Por ejemplo, la perturbación de la expresión del ligando puede indicar la dependencia del ligando para la dinámica del receptor observada. En el futuro, prevemos que el sistema podría perfeccionarse aún más para incorporar la inserción de reporteros. En última instancia, los hallazgos que utilizan esta metodología proporcionarían nuevos conocimientos valiosos más allá de la comunidad del pez cebra, dada la conservación de estos receptores de señalización en mamíferos y el desafío relativo de realizar estos estudios en organismos más grandes.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflicto de intereses

Agradecimientos

Agradecemos a Christine Holt y Bill Harris por su ayuda con la microscopía confocal. Agradecemos a Darren Gilmour por las construcciones de la columna vertebral del temporizador fluorescente y a Anna Huttenlocher por el vector de la columna vertebral Tol2-Lyz. Agradecemos a Steve Renshaw por la línea Tg(mpx:GFP)i114 . Esta labor contó con el apoyo del MRC (MR/L019523/1), el Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y una subvención de Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. contó con el apoyo de una beca de MRC DTP y en parte del Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvención. H.W. fue apoyado por un MRC DTP Studentship. H.P. fue apoyado por una beca de doctorado de Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) y en parte por un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Subvención del Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y el MRC (MR/L019523/1).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-fenil-2-tioureaSigma-AldrichP7629-25G
50mL Tubo de centrífugaCellStar Grenier Bio-One Limited210270
Clark vidrio capilarApparatus30-0020
Cleanline ThinBleach Suministros de laboratorio científicoCLE0301
Visor de disecciónNikonSMZ645
Calentador de bloque DriTechne FDB02AD
FijiInstitutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD
Pinzas, Joyeros Dumont No. 5Sigma-AldrichF6521
Platos de micropocillos con fondo de vidrioMatTekP35G-1.5-14-C
Pipeta pasteur de vidrioFisherbrand11795098
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripciónInvitrogen10391175
Microscopio confocal Leica SP8LeicaN/A
Agarosa de bajo punto de fusiónInvitrogen16520-100
Soporte magnéticoNarishigeGJ-1
MATLABThe MathWorks, Inc., Natick, MA
Azulde metilenoSigma-AldrichM9140-25G
MgSO4Sigma-AldrichM-2643
Sistema de microinyecciónParkerPicospritzer III
Puntas de pipeta con microcargadorEppendorf
NarishigeM-152
Extractor de micropipetasSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97
Portaobjetos de microscopioThermo-ScientificJ1800AMNZ
PerkinElmer Disco giratorio UltraVIEW ERS, Olympus IX81 Disco giratorio Microscopio confocalOlympusN/A Placa
Petri (120mm)Grenier Bio-One Limited632180
Rojo de fenolSigma-AldrichP0290-100ML
Poly(A) Tailing KitInvitrogenAM1350
PrismaSoftware
Pincel pequeñoN/A
Spectral Applied Research MóduloN/A
Hoja de bisturí quirúrgico Nº 23Swann-Morton233-5528
Tricaine MS222Sigma-AldrichE10521-50G
Software VolocityN/A
Yokogawa CSU10 escáner confocal de disco giratorioYokogawa N/A
Harvard Micromanipulador 5242956003 deGraphPad láser LMM5

Referencias

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