Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקולים לביצוע הדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקת קולטן כימותרפיה בנויטרופילים של דגי זברה
Abstract
הדרכת לויקוציטים על ידי שיפועים כימיים חיונית לתגובות חיסוניות. נויטרופילים הם התאים הראשונים שגויסו לאתרים של נזק לרקמות שבהם הם מבצעים פונקציות מיקרוביאלית קריטיות. הסחר שלהם בלוקים אלה מתוזמר על ידי כמה כימותרפיה דלקתית, כולל כימותרפיה. ברמה המולקולרית, איתות כימותרפי מוסדר על ידי סחר תאי של הקולטנים המתאימים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים תת-תאיים בקולטני כימוקין משפיעים על דינמיקת נדידת לויקוציטים ברמת התא והרקמות. כאן אנו מתארים מתודולוגיה להדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקה קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות. כלים אלה חשפו כי דיפרנציאל chemokine קולטן סחר נויטרופילים נויטרופילים מתאם קיבוץ נויטרופילים ופיזור באתרים של נזק לרקמות. יש לכך השלכות על הבנתנו כיצד תגובות דלקתיות נפתרות מעצמן. הכלים המתוארים יכולים לשמש להבנת דפוסי נדידת נויטרופילים במגוון הגדרות פיזיולוגיות ופתולוגיות וניתן להרחיב את המתודולוגיה לקולטנים אחרים של איתות.
Introduction
נדידת לויקוציטים היא בעלת חשיבות עליונה לתגובות חיסוניות. תאי מערכת החיסון הם תאי נדידה טיפוסיים, המסוגלים להפליא לחצות רקמות וכלי דם ולחוש מגוון של רמזי הדרכה כימיים לנדוד לכיוון חיידקים או תאים מארחים אחרים בעלי חשיבות. הדרכה נכונה מסתמכת על ההכרה של כימותרפיה, ביניהם כימותרפיה מייצגת את הקטגוריה הבולטת ביותר1. כימותרפיה מזוהה על ידי קולטנים ספציפיים מאוד של חלבון 7 transmembrane G. עם כריכת כימוקין, קולטני כימוקין משנים קונפורמציה המובילה להפעלה של חלבוני G טרימריים הקשורים ואת הניתוק שלהם לתת-יחידות איתות פונקציונליות המקדמות שינויים ציטו-שלדיים ונדידה מכוונת1. משנית, קולטני chemokine הם זרחן, ושינוי זה מוביל desensitization למשוך, אשר יכול להיות ואחריו רגישות מחדש מהירה / מיחזור או השפלה תאית ורגולציה למטה מפני השטח של התא2. דינמיקה קולטן אלה להשפיע על משך ומינון של איתות שהתקבלו על ידי התאים אבל איך הם משפיעים על התנהגות הגירת לויקוציטים היה קשה להבהיר ב vivo.
מעקב אחר דינמיקת קולטנים בלוקוציטים חיים במערכות יונקים מסורתיות מתמודד עם מספר אתגרים. עבור מחקרים חיים, היתוך קולטן עם חלבונים פלואורסצנטיים חייב לבוא לידי ביטוי בתאים. זה מאתגר בלוקוציטים ראשוניים, במיוחד בנויטרופילים, ומחקרים עד כה השתמשו בקווי תאי נויטרופיל פונדקאיים כדי לבטא קולטני כימוקין 3,4. דור של מודלים עכבר מהונדסים, שבו לויקוציטים מבטאים קולטן פלואורסצנטי או קולטנים מוטנטיים עם פגמים מסחריים אינפורמטיביים 5,6, כרוך בהשקעה ניכרת של זמן ומשאבים. גם במקרים אלה, רזולוציית ההדמיה והניגודיות לדינמיקה של קולטן הדמיה בבעלי החיים יכולה להיות מוגבלת ומחקרים השתמשו באימונוהיסטוכימיה בקטעי רקמות קבועות5. בהתחשב באתגרים טכניים אלה, ההבנה שלנו כיצד דינמיקת קולטנים כימותרפיים משפיעה על התנהגות התאים בסביבת רקמות חיות מוגבלת כיום.
כאן אנו מספקים מתודולוגיה לניטור סחר בקולטן בנויטרופילים של דגי זברה. דגי זברה ניתנים למתיחה גנטית, כמו עכברים, אך טרנסגנזה היא יחסית פשוטה יותר באמצעות שימוש במערכות טרנספוזון יעילות ומניפולציה ישירה של זיגוטה7. הזחל השקוף מקובל באופן אידיאלי על הדמיה. הדינמיקה קולטן chemokine כבר דמיינו בתאי נבט קדמוניים ואת פרימוריום הקו לרוחב על ידי ביטוי של היתוך המתאים עם כתבים פלואורסצנטיים 8,9,10. זחלי דגי זברה מצוידים בנויטרופילים בוגרים בעלי תכונות גנטיות ותאיות שמורות מאוד ביחס לנויטרופילים של יונקים. דינמיקת איתות תת-תאית כגון דינמיקת שלד ציטוספת שלד ורגולטורים של קוטביות כבר דמיינו בתאים אלה על ידי הדור של קווים מהונדסים מתאימים 11,12,13. לאחרונה, דמיינו וניתחנו פונקציונלית דינמיקה של קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות14. כאן, אנו מתארים את הדור של קווי כתב מהונדסים לאיתות כימוקין בנויטרופילים, הכנת עוברים להדמיה חיה, בדיקת פצעים לחקר איתות נויטרופילים והפרוטוקול לרכישה וניתוח של תמונות. אנו מספקים גם פרוטוקול צדדי כדי לבדוק תגובות קולטן chemokine ליגנדים מועמדים, אשר שימושי בעת ניסיון להקים דפוסי זיהוי ליגנד בקולטנים לא אופייניים. טכניקות אלה ניתן להשתמש בשילוב עם מניפולציות גנטיות נוספות, כגון עיכוב של ביטוי כימוקין אנדוגני או דור של קולטנים מוטנטיים עם סחר מושרה ליגנד שונה, כדי לחקור כיצד דינמיקת איתות ספציפית להשפיע על התנהגות לויקוציטים ב vivo. הקווים הטרנסגניים המבטאים קולטני chemokine מתויגים פלואורסצנטית יכולים לשמש גם ככתבים עבור שיפועים כימוקין אנדוגני, אשר אחרת קשה לזהות על ידי כתמי נוגדנים ישירים. המתודולוגיה המתוארת מספקת היקף להרחבת דור הכתבים לקולטנים אחרים של איתות חיסוני.
Protocol
הערה: כל דגי הזברה נשמרו על פי הנחיות ARRIVE ותקנות משרד הפנים בבריטניה, חוק בעלי החיים בבריטניה (נהלים מדעיים) משנת 1986.
1. דור של זחלי דגי זברה עיתונאי מהונדסים לסחר בקולטן הדמיה בלוקוציטים
- צור מבנה מבוסס Tol2 עבור ביטוי ספציפי לרקמות של קולטן העניין מתויג פלואורסצנטית. עבור נויטרופילים, השתמש רצפי מקדם מן lysozyme C15 ואת הגן myeloperoxidase16. המבנה יכול להיות מעוצב כהיתוך עם חלבון פלואורסצנטי יחיד (למשל GFP), טיימר פלואורסצנטי דו-מושבי (למשל, GFP מתקפל במהירות ותג התבגרות איטייותרRFP 8,14,17) או ביטוי דו-סטרוני של GFP כתב וסמן קרום בקרה9 (ראה דיון לשיקולים בעת בחירת הגישה).
הערה: מבנה זה אינו recapitulate רמות אנדוגני של ביטוי קולטן אבל הוא שימושי להשגת רמה גבוהה של ביטוי קולטן בסוג התא של עניין. עיין בספרות על קולטנים דומים 3,5,6,8,9,10,14 כדי להחליט על המיקום של תג פלואורסצנטי. - הקימו מיכל המכיל זכרים ונקבות בוגרים מסוג בר בעקבות שיטות גידול סטנדרטיות18, מופרדות על ידי מחסום יום לפני השרצת הביצים.
- ביום של השרצת ביצים, להכין תערובת transgenesis עבור microinjection המכיל 12.5 ng/ μL של מבנה DNA טול2 ו 17.5 ng/ μL של mRNAtransposase 7. הסר מחסומים ממיכלי דגים זמן קצר לאחר שהאורות מגיעים בבוקר (זה עשוי להשתנות במתקני דגים שונים) ולאסוף ביצים תוך 15 דקות להזרקת mRNA.
הערה: ודא פתרון ה- DNA הוא RNase חינם כדי למנוע השפלה של mRNA transposase בתערובת. אפשרות לעקוף את זה היא להזריק ביצים עם פתרונות נפרדים של מבנה Tol2 transposase. - בצע פרוטוקולים סטנדרטיים עבור transgenesis ו microinjection של ביצי דגי זברה19.
- הזרק 1 nL של הפתרון לתוך התא של עוברים שלב תא אחד.
הערה: תוצאות הביטוי עקביות יותר בעת הזרקה בתוך התא ולהיפטר הזריקות כי לא יכול להיות בבירור בתוך התא. עוברים בשלב תא אחד מכוונים בגלל השונות של הזרקת נפח לכל תא בעת הזרקת 2-16 עוברים שלב התא. אפשרות תהיה להפריד את זריקות שלב תא אחד מקבוצות של זריקות מאוחרות יותר, במקרה אלה יש יעילות שונה. - בדוק את העוברים המוזרקים בהמשך היום ולהסיר ביצים לא מופרות או מתות כדי לשמור על המצמד בריא.
- ב 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), זחלי מסך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הסמן יהיה גלוי נויטרופילים, במיוחד ברקמה hematopoietic caudal (CHT), אשר עשיר בתאים אלה.
הערה: אחוז התאים המסומנים בתווית משתנה עם מבנים שונים, אך בדרך כלל 20-60% מהנויטרופילים צפויים לבטא את המבנה. אחוזים נמוכים יותר בדרך כלל מנבאים יותר הקרנה בשלב המבוגרים. זהו מנהג טוב גם לאמת לוקליזציה נכונה של הקולטן בממברנה, עם גישת הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, במדגם של עוברים אלה לפני גידול הדגים. - לגדול זחלים חיוביים בעקבות נוהלי גידול סטנדרטיים20. אלה מייצגים את דור ה-F0.
- בגיל 3 חודשים, מסך F0 דגים עבור המייסדים. לחצות דגים בודדים עם סוג בר לא מהונדס ולסנן את צאצאיהם ב 3 dpf לביטוי של הקולטן על ידי צפייה מתחת לטווח הניתוח. בהתאם להצלחה הטרנסג'נזה, המשתנה עם כל מבנה, התבונן באחוז של צאצאים חיוביים בקבוצת משנה של הצלבים.
הערה: עבור טרנסגנזה טובה, כשליש עד מחצית מהמבוגרים יתנו צאצאים חיוביים. אחוז הצאצאים החיוביים במצמד משתנה עם מספר העותק של טרנסג'נים שנוספו, והוא יכול להיות בין 10-60%. זה מועיל לעקוב אחר היחסים המנדליים בתוך המצמדים כדי לזהות מהונדסי הכנסה בודדים (אלה מזוהים בקלות רבה יותר באחיזות F2 על ידי חיפוש יחס של 50% של זחלים חיוביים)20. - לגדל את הצאצאים החיוביים, המייצגים את דור F1.
- בגיל 3 חודשים, מסך F1 מבוגרים באותו אופן כדי להקים קו מהונדס F2 יציב.
- בצע ניסויים על זחלי F2 לאחר אימות הביטוי הספציפי לנויטרופילים של הטרנסג'ן.
הערה: במהלך הטרנסגנזה, ניתן להבחין ברמות שונות של ביטוי קולטן ומומלץ לשמור על מצמדים מהונדסים שונים כדי לקבל את רמת הביטוי המתאימה ביותר לשאלות הביולוגיות. ניתן לקבל תוצאות ראשוניות בזחלי F0 או F1.
2. איסוף עוברים של דגי זברה להערכת תגובות לפצעי לויקוציטים
- לאחר שהקים קו עיתונאי מהונדס יציב, להגדיר הכלאה בין דגים מהונדסים למבוגרים ונקבות ולאסוף ביצים למחרת בבוקר.
- לגדל עוברים ב 28 °C (5 °F) בינוני E3 (או מי ביצה18).
- אופציונלית, ב 24 hpf, עוברים דגירה בצינור צנטריפוגה המכיל 50 מ"ל של E3 בינוני בתוספת 0.003% אקונומיקה במשך 5 דקות. לאחר מכן לשטוף 3 פעמים במדיום E3 על ידי מתן הצינור לעמוד במשך כמה דקות כדי לאפשר לעוברים להתיישב בתחתית ולאחר מכן decanting והחלפת המדיום.
הערה: זה מספק רמה של שליטה על החשיפה לזיהום של הזחלים, אשר עשוי להשפיע על ההתנהגות של לויקוציטים במהלך פציעה. - לאחר הלבנה, לשמור עוברים בינוני E3 בתוספת 0.003% של 1-פניל-2-תיוריה כדי למנוע סינתזה מלנין. מתילן כחול, אשר משמש לעתים קרובות כדי למנוע זיהומים פטרייתיים, אינו מתווסף כאן, כדי למזער את autofluorescence רקמות.
- אפשר לזחלים לבקוע באופן טבעי ולהשתמש ב 3 dpf כאשר נויטרופילים הם בשפע21.
3. פציעת סנפיר גחוני של זחלים
- הכן זחלים לפציעה. השתמש זחלים ב 2.5-3.5 dpf, כאשר נויטרופילים בשפע הם נצפו. העבר זחלים ל E3 בינוני בתוספת 160-200 מ"ג / L tricaine MS222.
הערה: פתרונות מרוכזים של tricaine צריך להיות מוכן ומוקפא aliquots מראש להפשיר ביום. - השאירו את הזחלים במדיום E3 + tricaine למשך 15 דקות כדי להבטיח שהם מורדמים. בדוק את התגובות שלהם על ידי נגיעה עדינה עם מברשת צבע קטנה או כלי דומה.
- בחר זחלים עם ביטוי קולטן מהונדס תחת טווח ניתוח פלואורסצנטי.
- מעבירים את הזחלים לצלחת פטרי 120 מ"מ ב- E3 + tricaine לפציעה. באמצעות אזמל סטרילי חתך את סנפיר הגחון של הזחל, תוך התבוננות מתחת לטווח הניתוח (איור 1).
הערה: הרעיון הוא לבצע חתך עמוק מספיק כדי לגרום לגיוס נויטרופילים משמעותיים אך מבלי לחתוך את כלי ה- CHT. החתך נעשה בניצב לציר CHT כך שהחתך כמעט מגיע לכלי השיט של ה- CHT. זה לוקח קצת תרגול ויש לבצע תחילה עם פיקוח על זחלים שאינם נוצרים למטרה זו (למשל, זחלים עודפים מניסוי אחר).
4. הכנת זחלים להדמיה חיה
- להמיס נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose ב E3 בינוני על ידי חימום כדי לקבל פתרון נוזלי 2% agarose.
- אפשר לפתרון זה להתקרר עד 60 °C (60 °F).
הערה: שמור בקבוקון או צינור עם agarose באינקובטור ב 60 °C (60 °F) כדי למנוע את ההגדרה agarose בין הרכבה של זחלים שונים. - פיפטה 0.5 מ"ל של LMP + E3 נוזלי בצלחת תחתונה מזכוכית להדמיית מיקרוסקופיה.
- פיפטה זחל זברה פצוע, מורדם יחד עם 0.5 מ"ל של E3 + 2x Tricaine בצלחת התחתונה זכוכית.
- ערבבו בעדינות את שני הפתרונות כדי להשיג פתרון של 1% LMP/1x Tricaine agarose/E3, תוך הימנעות מייצור בועות. כוון את העובר לרוחב בעדינות לדחוף כלפי מטה, כך החלק caudal של הדג הוא קרוב ככל האפשר לכוס.
הערה: הרקמה שיש לצלם חייבת להיות קרובה ככל האפשר לתחתית הזכוכית בעת הדמיה עם מיקרוסקופ הפוך. ההגדרה של אוריינטציה עבור הזחל חייב להיות מהיר, כך האגרוז לא להגדיר לפני הזחל ממוקם. - תן את פתרון agarose להתקרר ולהתמצק במשך 5-10 דקות. בדוק אם האגרוז מוגדר על ידי נגיעה עדינה בג'ל האגרוז עם מברשת צבע קטנה או קצה.
- לאחר האגרוז הוא מוצק, להוסיף 2 מ"ל של E3 בתוספת עם 0.2 מ"ג / מ"ל של tricaine ללוח ההדמיה.
5. הדמיה קונפוקלית חיה
הערה: עוברי תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב או שווה ערך (איור 2). ניתן להשתמש גם במיקרוסקופ סריקת לייזר, אך הרזולוציה הזמנית של הדינמיקה תהיה מגבילה יותר. הכן את הגדרות ההדמיה לפני הבאת הזחל הפצוע, כך שניתן יהיה לדמיין את התגובה במהירות האפשרית לאחר הפציעה. נויטרופילים מגיעים לפצע תוך 5 דקות וקולטנים בתאים המגיעים הראשונים עשויים להפנים במסגרת זמן זו. עם תרגול ניתן לדמיין כבר 15 דקות לאחר פציעה.
- הפעל את המיקרוסקופ: לייזר, מצלמה ומחשב בהתאם להוראות היצרן.
- השתמש בתוכנת רכישה כדי להגדיר את הגדרות ההדמיה. בחר לייזרים עבור fluorophores המתאים וזמני חשיפה משוערים בהתבסס על ניסויים קודמים (לרכוש GFP עם 488 ננומטר ו tagRFP עם לייזר 561 ננומטר).
- העבר את הצלחת עם העובר רכוב, בהקדם האפשרי לאחר ערכות agarose, על פלטפורמת דיסק הדמיה מסתובבת קונפוקלית.
- השתמש חתיכת העין מיקרוסקופ כדי למצוא את הדגים בצלחת באמצעות ג'ויסטיק הבמה.
- דגש על אזור הפצע, באמצעות הידית המתמקדת.
הערה: כדי למצוא את תחום העניין, ייתכן שיהיה קל יותר להשתמש במטרת אוויר בהגדלה נמוכה (פי 10). - בחר את השדה לתמונה סביב הפצע. השתמש במטרה 30x/40x עם צמצם מספרי גבוה כדי לקבל רזולוציה מספקת.
- השתמש בלחצני התוכנה כדי להתאים את זמן החשיפה כך שניתן יהיה לראות את הסמן הפלואורסצנטי עם ניגודיות טובה אך מבלי להרוות את האות.
הערה: זמן החשיפה חייב להיות נמוך ככל האפשר כדי למזער את החשיפה הפלואורסצנטית ולמקסם את הרזולוציה הזמנית בהפסקת הזמן. כוח הלייזר תלוי במצב הלייזר אך יש להתאים אותו לרמה המאפשרת זמן חשיפה נמוך מספיק להדמיה דינמית. - שימוש בלחצני התוכנה כדי לבחור את אמצעי האחסון לתמונה כערימת z
- הגדר זמן לשגות כל 30 שניות למשך הרצוי.
הערה: עבור פצעי סנפיר גחון סטריליים, הגיוס המרבי הוא ציין על ידי 2-3 שעות. - לפני הפעלת הזמן לשגות, קח תמונת שדה בהירה כדי לתעד את שדה הראייה. במידת האפשר, לרכוש שדה בהיר בתוך הסרט לשגות זמן.
6. כימות הפנמת הקולטן בנויטרופילים של דגי זברה
- רשום את מרווח הזמן של רכישת התמונה ואת גודל הפיקסלים של התמונה. תבדוק כמה דקות לאחר הפציעה של ההדמיה התחילה.
- פתח את ערכות הנתונים של התמונה באמצעות פיג'י על-ידי גרירת התמונה לממשק התוכנה, בחר מסגרת מייצגת של עניין עבור כל ערכת נתונים באמצעות מחוון הזמן, לדוגמה, במהירות של 1-1.5 שעות לאחר הפציעה, ושמור אותה.
- המשך עם MATLAB כדי לעבד את ערכת הנתונים של התמונה.
- צור סקריפט חדש וכלול פונקציות לקריאת תמונה (שורה 6 בסקריפט הנקראת 'select_neutrophils.m' להגדרת צנטרואיד בקובץ משלים 1), פתיחה (שורה 11 בקובץ משלים 1) ובחירה ידנית של נקודות על התמונה (שורה 12 בקובץ משלים 1).
- פתח את מסגרת העניין על ידי הפעלת סקריפט זה (קובץ משלים 1), לזהות את הנויטרופילים לנתח על ידי בדיקה חזותית, לחץ עליהם ולרשום הערכה של centroids שלהם, הן בפצע סנפיר הגחון והן ב CHT.
הערה: הנויטרופילים הלא מגויסים ב- CHT משמשים התייחסות פנימית לנויטרופילים שהתפלגות הקולטן שלהם נשארת קבועה. זה מאפשר נורמליזציה של ערכי ניגודיות של תאים בפצע להתייחסות פנימית. - המשך עם פילוח של הנויטרופילים בכל מסגרת באמצעות טכניקת קווי מתארפעילה 22 כמתואר בשלבים הבאים.
- צור פונקציה שתכלול את המטה-נתונים הדרושים לפילוח לפי קווי מתאר פעילים (כלומר, מספר איטרציות, הטיה של קווי מתאר, צנטרואיד משוער וכו') 22 (ראה 'נתוני פצע.m' בקובץ משלים 2).
- צור קובץ Script המכנה את הפונקציה 'wound_data.m' כדי להזין את המידע הדרוש עבור פילוח של כל נויטרופיל (שורה 28 ב- Script הנקראת 'calc_contrast.m' בקובץ משלים 3).
- כלול בפקודות Script לקריאת תמונה (שורה 32 בקובץ משלים 3).
- הוסף את הדור של תמונה שחורה (כלומר תמונה שבה ערכי הפיקסלים הם אפסים) עם גודל שווה לתמונת הקלט (קו 44 בקובץ משלים 3) ואת ההגדרה של ריבוע של 10 × 10 פיקסלים סביב הצנטרואיד של כל נויטרופיל (קו 45 בקובץ משלים 3).
- כלול את פילוח הנויטרופילים באמצעות קווי מתאר פעילים (קווים 48-49 בקובץ משלים 3) והסרת אובייקטים קטנים שזוהו כוזבים (שורה 52 בקובץ משלים 3).
הערה: קווי המתאר הראשוניים של הפילוח הם הריבוע סביב הצנטרואיד, המתפתח על ידי טכניקת מתאר פעילה המבוססת על עוצמות הפיקסלים, מספר האיטרציות וההטיה של קווי המתאר. התוצאה של פילוח היא מסיכה בינארית שבה לכל הפיקסלים יש ערך 0 מלבד אזור הנויטרופיל שלפיקסלים שלו יש ערך 1. - כלול את הכפל של התמונה הבינארית המפולחת עם התמונה המקורית כדי לקבל את עוצמות הפיקסלים של הנויטרופיל בלבד, כאשר שאר התמונה אינה מספר, כך שהיא אינה תורמת לחישובים (שורות 56-57 בקובץ משלים 3).
- הוסף את החישוב של מטריצת המופע המשותף ברמת האפור עבור כל נויטרופיל (GLCM)14,23 (שורה 61 בקובץ משלים 3). GLCM הוא ייצוג נוסף של התמונה המציגה מיקום יחסי של פיקסלים במונחים של עוצמת פיקסלים.
- כלול את חישוב הניגודיות של הנויטרופיל בהתבסס על GLCM (קווים 62,65 בקובץ משלים 3). מדד הניגודיות מודד הבדלים בעוצמה בין פיקסלים שכנים. פיקסלים משווים לפיקסלים במרחק מסוים זה מזה, שניתן להתאים אותם אמפירית בהתבסס על גודל הפסגות המקומיות בעוצמה. כאינדיקציה, עבור התמונות, עם גודל פיקסל של 0.389 מיקרומטר, כאשר הקולטן הראה התפלגות שלפוחית כל נקודה בהירה הייתה בטווח של 5 פיקסלים. לכן, האינטנסיביות הושוו בפיקסלים במרווחים של 5 פיקסלים זה מזה.
- הוסף פקודות לשמירת הערכים בנפרד עבור נויטרופילים בודדים בסנפיר הגחון (קו 68 בקובץ משלים 3).
- כלול את החישוב של ערך ניגודיות הנויטרופילים הממוצע מכל הנויטרופילים של CHT באותו אופן כמו עבור נויטרופילים בפצע (קווים 72-119 בקובץ משלים 3). עבור נויטרופילים CHT, קרא לפונקציה 'cht_data.m' (שורה 77 בקובץ משלים 4).
- כלול את הנורמליזציה של ערך הניגודיות של נויטרופילים בודדים בפצע לניגוד הממוצע של נויטרופילים CHT שחושבו לעיל בשלב 6.16 (כלומר, חלוקה) (קו 122 בקובץ משלים 3). זה נותן ניגודיות מנורמלת המשקפת עד כמה מראה הקולטן 'דוטי' בתאים מגיבים בודדים ביחס לשליטה בתאים שאינם מגיבים (איור 3 ואיור 4).
- הפעל את קובץ ה- Script (קובץ משלים 3) על-ידי לחיצה על סמל ההפעלה בתוכנה.
- חזור על כל השלבים עבור תנאים שונים.
- השתמש בתוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים) כדי לייבא את התוצאות עבור התנאים השונים על-ידי יצירת טבלת עמודות, התוויית התוצאות וביצוע בדיקה סטטיסטית כדי לבדוק את משמעות ההבדל בין הערכים הממוצעים.
הערה: את הקודים לניתוח ניתן למצוא גם ב- GitHub ב- https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. בדיקות תגובה Chemokine בעוברים מוקדמים
הערה: זהו ניסוי צדדי אופציונלי המאפשר בדיקה של שינויים בהתפלגות קולטן בתגובה chemokine מועמד והוא עצמאי מן הניסויים המתוארים לעיל לגבי ביטוי נויטרופיל של מבני הקולטן. ההבדלים בסחר המושרה בליגנד בין קולטנים קשה לקבוע עם טכניקה זו כמו רמות ליגנד הם רוויים14. עם זאת, אם רואים ליגנד-הפנמה של קולטן במערכת זו, זה יכול להיות אינדיקציה כי ligand מזוהה על ידי הקולטן במקרים שבהם זהות ליגנד אינה ברורה. זה שימושי, כי ביטוי של קולטני chemokine בשורות תא הוקמה כגון HEK293T תאים14 יכול להיות מסורבל.
- הקימו צלב של דגי בר (למשל, AB) ואספו ביצים למחרת בבוקר זמן קצר לאחר הרמת המפרידים (כמתואר לעיל).
- להזריק 100 pg של mRNA קולטן מתויג פלואורסצנטית (למשל, Cxcr1-FT), יחד עם 100 pg של mRNA עבור סמן קרום (למשל, CFP ממברנה). כלול בתערובת מינונים שונים של mRNA עבור ליגנד כימוקין.
הערה: כאינדיקציה 150 pg Cxcl8a mRNA נתן הפנמה בולטת של Cxcr1-FT פלואורסצנטי (ראה איור 5). - יש לשטוף עוברים עם E3 בינוני ודגר ב-28°C.
- בסביבות 7 hpf, לבדוק את הביטוי של mRNA על טווח ניתוח פלורסנט ולבחור את העוברים לתמונה.
- הכן 0.8 % LMP agarose מראש ולשמור בצינור זכוכית במחסום חום ב 60 °C (60 °F). השתמש בצינור זכוכית כדי לתפעל את העוברים. יש לנטרל בעדינות עוברים באמצעות זוג מלקחיים בכל יד.
- שאפו עובר מפורק בודד עם פיפטת הזכוכית המבטיחה שאין בועות בקצה. שחרר בעדינות את העובר לתוך הצינור של אגרווז ומאפשר לו לשקוע לתוך הצינור.
- שאפו את העובר מצינור האגרוז, אספו קצת נוזלים לאורך הדרך. שחררו בעדינות עובר למרכז צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית. סובב במהירות את העובר כך שהקוטב החיי פונה לתחתית המנה (צד זה חייב להיות הקרוב ביותר למטרה בעת שימוש במיקרוסקופ הפוך).
הערה: ייתכן שיהיה עליך להתאים מחדש את הכיוון של העוברים בזמן שהגרוז עדיין מוגדר. - לאחר האגרוז מוגדר, תוספת עם 2 מ"ל של E3 בינוני.
הערה: העוברים בשלב זה הם שבירים מאוד בהשוואה לזחלים וזה לוקח קצת תרגול כדי dechorionate והר. חשוב לשאוף ולשחרר בעדינות ככל האפשר, כדי למנוע קרע עוברי. - חזור על התהליך במטרה לטעון 3-5 עוברים למנה.
- עוברי תמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (ראה טבלת חומרים). השתמש במטרה שמן 40x/1.3 NA כדי לקבל רזולוציה גבוהה מספיק. הצג באופן חזותי mCFP, sfGFP ו- tagRFP עם 405, 488 ו- 552 ננומטר, בהתאמה, בטווח. התאם מסננים והגדרות כך שיהיו בעלי ניגודיות גבוהה תוך הימנעות מרוויה ומזער את הדליפה בין הערוצים.
- חזור על ההרכבה וההדמיה לתנאים שונים.
Representative Results
פציעת סנפיר גחון מלווה בהתגייסות מהירה של נויטרופילים מה-CHT לסנפיר הגחון והתקבצות בשולי הפצע, תוך 30-60 דקות (איור 1). דמיינו את ההפצה של שני קולטני כימוקין, Cxcr1 ו- Cxcr2, המתבטאים על ידי נויטרופילים של דגי זברה24 ומכירים Cxcl8a ו- Cxcl8b14, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. יצרנו שני קווים מהונדסים מתאימים, Tg(lyz:Cxcr1-FT) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT), שבהם נויטרופילים מבטאים מבנה טיימר פלואורסצנטי (FT) של הקולטן, כלומר היתוך עם טנדם של sfGFP ו- tagRFP (איור 2 והפניה14). השימוש בשני הפלואורופורים נועד לאפשר ניטור של מגוון רחב של גורלות קולטנים ולספק הערכות של זמן תחלופת חלבונים בקרום הפלזמה, שכן קולטנים מסונתזים חדשים היו פלואורסצצים בירוק והופכים בהדרגה לאדומים ככל שהם מתבגרים 8,14. עם זאת, קולטנים אלה נמצאו בעלי מחזור מכונן מהיר בקרום פלזמה נויטרופיל וכי זמן המגורים היה קצר יותר מאשר זמן ההתבגרות של tagRFP, עם sfGFP מראה לוקליזציה ממברנה ו tagRFP מראה לוקליזציה של כלי רכב במצב יציב (וידאו משלים 1 ושופט14). לכן, התמקדנו בהפצה של sfGFP כדי לפקח על הפנמה הנגרמת על ידי ליגנד באתרים של נזק לרקמות. דפוס התפלגות הקולטן כונתה באמצעות מדד הניגודיות, המדווח על הבדלים בעוצמה בין הפיקסלים הסמוכים. הרציונל הוא שכאשר התפלגות הקולטן היא מממברנית וחלקה, ערך הניגודיות נמוך. כאשר התפלגות הקולטן היא שלפוחית ונקבה יותר, אז ערך הניגודיות גבוה (איור 3).
שיטה חלופית היא לכמת את היחס בין רמות הקולטן (עוצמת sfGFP) על פני רמות של סמן קרום בקרה למשל CFP ממברנה (mCFP) (איור 3). שתי השיטות יכולות לזהות הפנמת קולטן, כפי שצוין על ידי דפוס הפצת קולטן שלפוחית יותר ברחבי העולם בתא (ערך ניגודיות גבוה יותר) או רמות קולטן נמוכות יותר בקרום (יחס sfGFP / mCFP נמוך יותר). עם זאת, מדד הניגודיות יכול היה לזהות גם הפנמת קולטן באשכולות נויטרופילים בפצע, שבהם פילוח הממברנות היה פחות מדויק ולא ישים (איור 3). באמצעות מדד זה, הצלחנו לכמת את ההבדלים הנראים לעין בין סחר Cxcr1 ל- Cxcr2 בנויטרופילים בפצעים (איור 4 ווידאו משלים 2). Cxcr1-FT מופנם בתאים הממוקמים בפצע ואילו Cxcr2-FT נשאר מממברני בנויטרופילים בפצע (איור 4A-C, וידאו משלים 2 ווידאו משלים 3). דיכוי של Cxcl8a ו- Cxcl8b, באמצעות טיפול מורפולינו, השפיע באופן דיפרנציאלי על הפנמה Cxcr1-FT בפצעים (איור 4C,D). כדי לאמת עוד יותר כי Cxcr1-FT מגיב Cxcl8a, ביצענו בדיקות תגובה chemokine בעוברים מוקדמים. מצאנו כי Cxcr1-FT מופנם באופן משמעותי בעוברים שבהם Cxcl8a התבטא במשותף (איור 5). בסך הכל תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן לפרוס את השיטות המתוארות כדי למדוד הפנמה של קולטן המושרה על ידי כימוקין בנויטרופילים ולבסס את זהותו של ליגנד המתווך תופעות אלה.
איור 1: נדידת נויטרופילים לפצעי סנפיר גחון. (A) (משמאל) קריקטורה של 3 זחלים dpf המציג את המיקום של רקמת המטופויאטית caudal (CHT), מחזור ונוס (VC, כחול), סנפיר הגחון (VF) ואתר הפצע. (מימין) קריקטורה המתארת את אזור הפצע (W) עם נויטרופילים מקבל מגויס מן CHT ו קיבוץ על הפצע. מקלעת הוורידים (CVP) של רקמת ה- CHT מצוירת בכחול. (B) תמונת שדה בהירה (משמאל) והקרנה קונפוקלית (מימין) המציגה את פצע הסנפיר הגחוני ואת התפלגות הנויטרופילים בזחלי Tg(mpx:GFP) בשעה 2 שעות לאחר הפציעה. קווים מקווקווים מציגים קווי מתאר של VF ו- CHT. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. תמונה מצוירת ופלואורסצנטית שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיה חיה של סחר בקולטן כימוקין בנויטרופילים. (A) מבנים המשמשים לביטוי מהונדס ספציפי לנויטרופילים של Cxcr1-FT (טיימר פלואורסצנטי) ו- Cxcr2-FT. תחזיות קונפוקליות של נויטרופילים בראש זחל מהונדס 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), למעלה; Tg(lyz:Cxcr2-FT), למטה) המציג ערוצי tRFP (מגנטה) ו- sfGFP (ירוק). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (ב) ערכה אנטומית של זחל 3 dpf כמו באיור 1A. מתחת לזחל יש תוכניות המתארות את אזור הפצע (W) עם נויטרופילים שמתגייסים מה- CHT (למעלה) או מבצעים כימוטקסיס עם הכניסה לסנפיר הגחון (למטה). ריבוע מקווקו מציין אזור בתמונה בתצלומי בזק מימין. (C) נויטרופילים בזחלי Tg(lyz:Cxcr1-FT) (מוצג sfGFP) בעת גיוס מ- CHT (לוחות עליונים) או כימוטקסיס לכיוון הפצע (לוחות תחתון). החצים מציגים את אותם תאים לאורך זמן. נקודות זמן בתמונה הימנית הן דקות שחלפו לאחר התמונה משמאל. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D) ייצוג סכמטי של גישה ניסיונית להדמיה חיה של סחר בקולטן כימוקין. לוחות A-C ששונו מ- ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דוגמאות לכימות של דינמיקת קולטן. נויטרופילים בודדים (כחולים) או מקובצים באשכולות (ירוק) בפצעים או נויטרופילים לא מגויסים ב- CHT (אדום, כתום) חולקו ונותחו בשיטות שונות כדי להשוות תוצאות. אותם תאים לדוגמה המוצגים נותחו בשתי שיטות כדי לקשר את מה שנראה בתמונה עם טווח הערכים שחולצו. (א) פני השטח של התאים לדוגמה שנבחרו היו מפולחים בהתבסס על הגדרת מתאר בערוץ sfGFP. (B) ניגודיות חושבה מהתאים לדוגמה המוצגים ב- A. (C) הממברנה של התאים לדוגמה שנבחרו היו מפולחים בהתבסס על הגדרת מתאר בערוץ CFP. לאחר מכן בוצע ניתוח יחסי של sfGFP/CFP. (ד) היחס בין sfGFP/CFP חושב על התאים לדוגמה המוצגים ב- C. קווי שגיאה מייצגים S.E.M. מתאים בודדים, במקרים של n>1, הערכים כאן לא שימשו לניתוח סטטיסטי אלא רק כדי להדגים מדידות שהושגו בשיטות הכימות השונות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דינמיקה דיפרנציאלית של Cxcr1 ו- Cxcr2 בתגובה לפציעה. (A) הקרנה קונפוקלית של נויטרופילים ב Tg(lyz:Cxcr1-FT) או Tg(lyz:Cxcr2-FT) זחלים בפצע ב 80 דקות לאחר פציעה (ערוץ sfGFP מוצג). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) נויטרופיל Cxcr1-FT מוגדל (משמאל) ו- Cxcr2-FT (מימין) בפצע. קולטן ירוק מוצג באפור. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (C) ניגודיות מנורמלת (ניגודיות לנויטרופיל בודד מנורמלת לניגודיות הממוצעת של תאים שאינם מגויסים ב- CHT). cxcl8a מתייחס הזרקה של חסימת חיבור יחד עם מורפולינו חוסם תרגום עבור cxcl8a. cxcl8b מתייחס הזרקה עם מורפולינו חוסם חיבור עבור cxcl8b. עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT): n = 24 תאים (CHT), n = 47 תאים (פצע) מ 8 זחלים. עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT) עם מורפולינוס: n = 28 תאים (Cxcl8a-MO) מ 5 זחלים, n = 16 תאים (Cxcl8b-MO) מ 5 זחלים. עבור Tg(lyz:Cxcr2-FT): n = 10 תאים (CHT) ו n = 20 תאים (פצע) מ 3 זחלים. הנתונים אוגדו מזחלים עצמאיים שנרכשו ב-1-5 מפגשי הדמיה. מבחן קרוסקל-וואליס עם מבחן ההשוואות המרובה של דאן עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT), מבחן מאן-ויטני דו-זנבי לא מזווג עבור Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) הקרנה קונפוקלית של נויטרופילים ב- Tg (lyz:Cxcr1-FT) זחלים מהונדסים שטופלו ב - cxcl8a morpholino (MO) (משמאל) ו - cxcl8b MO (מימין) מגיבים לפצעי סנפיר (ערוץ sfGFP המוצג בירוק). תמונה שצולמה בנקודות זמן של הצטברות נויטרופילים שווה ערך (85 דקות לאחר פציעה בתמונה השמאלית ו -45 דקות לאחר פציעה בתמונה הימנית). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בדיקת תגובה של צ'מוקין בעוברים מוקדמים. פרוסות קונפוקל סריקת לייזר של עוברים gastrulating מראה ביטוי והפצה של Cxcr1-FT. 100 pg של Cxcr1-FT mRNA הוזרק לתוך אחד ביצי תא שלב עם או בלי 150 pg Cxcl8a mRNA. קולטנים ירוקים ואדומים מוצגים בערוצים נפרדים. סמן CFP קרום בקרה (mCFP) מוצג בערוץ ציאן. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט משלים 1: נויטרופילים מהונדסים בראש זחל Tg(lyz:Cxcr1-FT) (משמאל) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT) (מימין) ב-3 dpf. sfGFP(ירוק), tagRFP (מגנטה). מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 5 fps. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
סרט משלים 2: נויטרופילים ב- Tg(lyz:Cxcr1-FT) (משמאל) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT) (מימין) זחלים מהונדסים המגיבים לפצעי סנפיר. הסרט מתחיל תוך 10 דקות לאחר הפציעה ונמשך 60 דקות. sfGFP (ירוק), tagRFP (מגנטה). מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 10 fps. CHT = רקמת המטופויאטית caudal. VF = סנפיר גחון. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
סרט משלים 3. דוגמאות נוספות של נויטרופילים מ זחלים מהונדסים Tg(lyz:Cxcr1- FT) מהונדסים (זחלים שונים מאלה המוצגים בסרטון 2), שנרכשו ברזולוציה גבוהה יותר, המציגים הפנמת קולטן (ערוץ sfGFP המוצג בירוק) עם התגייסות ב- CHT או עם הכניסה וכימוטקסיס בסנפיר הגחוני. מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 2 fps. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
קובץ משלים 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 4: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
השיטה המתוארת מאפשרת הדמיה חיה של דינמיקת הקולטן בתגובה לליגנדים אנדוגניים במקום במהלך תגובה דלקתית לנזק לרקמות. השימוש בכתבי נויטרופילים Cxcr1/Cxcr2 יכול להיות מורחב להגדרות פיזיולוגיות אחרות, כגון זיהום, מודלים של גידולים או סוגים אחרים של נזק לרקמות 14,25,26,27. בנוסף, קווי הצלה מהונדסים, שבהם הקולטן האנדוגני מדוכא ומציל על ידי קולטן מוטציה אקסוגנית, יכולים לספק כלים שימושיים לנתח את החשיבות של דפוסי נדידת נויטרופילים ספציפיים בתגובות חיסוניות. לדוגמה, מוטציות קולטן Cxcr1 אשר לקוי desensitization לגרום קיבוץ נויטרופילים בולט יותר באתרים דלקתיים14. רווח זה של פנוטיפ פונקציה יכול לשמש כדי להבין את התפקיד של קהילת נויטרופילים בתהליכים פיזיולוגיים שונים, למשל, תיקון פצעים, מחלה זיהומית, או התפתחות הגידול, ולהשלים את הקולטן knockdown / ניסויי נוקאאוט. המתודולוגיה מספקת גם בסיס להרחבת מגוון הכתבים הזמינים. הבחירה של כתב פלואורסצנטי חשוב לשקול ותלוי בשאלה הביולוגית. מצאנו כי המחזור המכונן של קולטני כימוקין אלה בנויטרופילים היה גבוה, בהשוואה לתאי אפיתל, וכי כתבים עם התבגרות מהירה (למשל, sfGFP) נדרשו לדווח על רמות הממברנה במצב יציב ולפתור הבדלים על גירוי נויטרופיל 8,14. לכן, יחסי ממברנה של sfGFP / tagRFP אינם ישימים למדידת הפנמה הנגרמת על ידי ליגנד בסוג תא זה, אבל התבנית של tagRFP מאפשר מעקב אחר גורלות תאיים של הקולטן, אשר יכול להיות שימושי במחקרים מסוימים. מצאנו גם כי האות התאי המרוכז יותר של tagRFP שימושי לסינון זחלים בודדים. גישה חלופית למדידת רמות הקולטן בקרום הפלזמה תהיה לבטא במשותף סמן קרום פלואורסצנטי בנויטרופילים או באותו טרנסג'ן9 או בטרנסג'ן עצמאי14. בתרחיש הקודם הטרנסג'ן יספק אמצעי נוסף לסינון הדגים ורמות הביטוי יהיו דומות בין הסמן לקולטן. הגישה השנייה תהיה מודולרית יותר, בכך שקו דגי זברה עם כתב קולטן יכול להיות משולב עם קווים עיתונאיים שונים. בכל מקרה, ראוי לציין כי כימות הממברנה של רמות הקולטן מאתגר נויטרופילים מקובצים באשכולות (ראה להלן). לבסוף, נציין כי הרחבה אפשרית של פרוטוקול זה תהיה לעקוב אחר ההדמיה החיה על ידי אימונוהיסטוכימיה לניתוחי לוקליזציה מפורטים יותר.
מערכת Transgenesis Tol2 מבוססת היטב7 ומקדם lysozyme C שימש בהרחבה לביטוי נויטרופיל11,15. הגישה הטרנסגנזה היא, אם כן, פשוטה יחסית ורמת הביטוי שהושגה עם מקדם זה גבוהה מספיק כדי לספק ניגודיות מספקת לניתוח דינמיקת הקולטן. מגבלה אפשרית היא שרמת הביטוי אינה מסכמת מחדש את רמות הביטוי של קולטן אנדוגני. טכנולוגיות CRISPR חדשות ניתן לפרוס כדי להקים קווי נוק-אין עבור קולטנים של עניין מסוים28. טכנולוגיות אלה עדיין מסורבלות וייתכן שאינן מבטיחות את רמות הביטוי הנדרשות להדמיה תת-תאית, אך פיתוחן המוצלח יהווה פריצת דרך חשובה להבנת דינמיקת האיתות האנדוגנית. אימותים פונקציונליים חשובים לפענוח נתונים עם מבני קולטן מהונדסים. לדוגמה, ניתן להשתמש בבדיקות זיהוי ליגנד כדי לקבוע כי חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי הוא פונקציונלי והצלה של פנוטיפים נוקאאוט יכול לשמש כדי לקבוע כי רמות ביטוי נויטרופיל מהונדס תואמות לפונקציונליות14. לבסוף, דרך ישירה יותר לאמת את היתוך הקולטן יהיה לנצל בדיקה פונקציונלית במבחנה עם קולטן מתויג לצד גרסאות שאינן מסומנותבתווית 14.
גישת הכימות מטפלת בקשיים ספציפיים בפילוח ממברנות מדויק בנויטרופילים ב- vivo. בתאים של טבע אפיתל, כימות של רמות הקולטן יכול להתבצע באופן אוטומטי על ידי נרמול רמות קולטן הממברנה לסמן בקרה, אשר יכול לבוא לידי ביטוי יחד או בנפרד9. אכן, יישמנו גישה כזו, כאשר אנו משתמשים בבדיקת זיהוי ליגנד בעובריםגסטריים 14. עם זאת, נויטרופילים עוברים שינויים מורכבים ומהירים בצורת התא ב- vivo, מה שהופך את פילוח הממברנה לקשה הן בדו-ממד והן בתלת-ממד14. זה אפילו יותר מאתגר כאשר נויטרופילים אשכול, אשר מתרחשת בהגדרות פיזיולוגיות רבות29. מדד הניגודיות מתגבר על מגבלה זו מכיוון שהוא אינו דורש פילוח ממברנות אלא משקף את המצב הכולל של התפלגות הקולטן בתא (membranous/smooth vs vesicular/dotty). חשוב לציין כי מדד הניגודיות יכול להיות מושפע מהניגודיות הכוללת של התמונה, ולכן נדרשת נורמליזציה של ערכי תאים בודדים להפניה פנימית כדי להסביר את השונות של האות בעוברים/דגימות שונים. לדוגמה, השתמשנו בערך הניגודיות הממוצע לתאים של נויטרופילים שאינם מגיבים ב- CHT (כלומר, נויטרופילים שנשארים נייחים ואינם נודדים לסנפיר הגחון)14. אפשרות נוספת תהיה לנרמל עם ערכי ניגודיות של סמן בקרה באותו תא. זה יספק פתרון כאשר הפניה פנימית של תאים שאינם מגיבים אינה זמינה ועשויה לפתור הבדלים כמותיים עדינים יותר בדינמיקת הקולטן בין תנאים שונים.
מיקום ההדמיה הוא משתנה נוסף שיש לקחת בחשבון. הסיבה לבחירת פצע הסנפיר הגחוני כאן, בניגוד לפצע סנפיר הזנב הנפוץ יותר מודל16,30, היא כי האתר של פציעה נמצא בקרבת האתר של מגורים נויטרופילים / מקור נודד. זה מאיץ את ציר הזמן של הבדיקה, כפי שלוקח יחסית מעט זמן עבור נויטרופילים להגיע. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות ללכוד את התנהגות התא הן במקור ההעברה (CHT) והן במיקום היעד של עניין (פצע). זה רלוונטי כאן, כי הרזולוציה המרחבית והזמן הנדרשת להדמיה תת-תאית קשה לשלב עם שדה ראייה גדול או סריקה מרובת מיקומים. לפיכך, בדיקת פצע הסנפיר הגחוני מאפשרת מעקב אחר התפתחות התגובה הנודדת ממקור הנדידה ולכידה סימולטנית של תנודות קולטן לא ספציפיות בתאים שאינם מגיבים. כפי שהוזכר לעיל, האחרון שימושי למטרות כימות כפי שהוא מספק התייחסות פנימית עבור דינמיקה לא ספציפית. במערכות אחרות, ייתכן שלא ניתן יהיה לקבל התייחסות פנימית כזו, ובמקרה זה ערכי הניגודיות של סמן קרום מבוטא במשותף יספקו שליטה חלופית.
לסיכום, אנו צופים כי המתודולוגיה חלה על מערכות אחרות וניתן לפרוס אותה למגוון מטרות. לדוגמה, אותם כתבים יכולים להיות מנוצלים בהגדרות דלקתיות אחרות, כגון הגדרות זיהום או מודלים אחרים של מחלות. הרפרטואר של קווי הכתב קולטן דגי הזברה יכול להיות מורחב לקולטני איתות אחרים, כדי להבין מנגנוני איתות או לדווח על דינמיקה ליגנד ב vivo. הגישה יכולה להיות משולבת עם טכניקות נוקאאוט / נוקאאוט כדי לחקור את הבסיס המכני של דינמיקה נצפית. לדוגמה, הפרעה של ביטוי ליגנד יכול להצביע על התלות ligand עבור דינמיקה קולטן נצפתה. בעתיד, אנו צופים כי המערכת יכולה להיות מעודנת עוד יותר לשלב נוק-אין החדרה של כתבים. בסופו של דבר, ממצאים המשתמשים במתודולוגיה זו יספקו תובנות חדשניות בעלות ערך מעבר לקהילת דגי הזברה, בהתחשב בשימור קולטני האיתות האלה ביונקים ובאתגר היחסי של עריכת מחקרים אלה באורגניזמים גדולים יותר.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
אנו מודים לכריסטין הולט וביל האריס על העזרה במיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו מודים לדארן גילמור על מבני עמוד השדרה של הטיימר הפלואורסצנטי ואנה הוטנלוצ'ר על וקטור עמוד השדרה של טול 2-ליז. אנו מודים לסטיב רנשו על קו Tg (mpx:GFP)i114 . עבודה זו נתמכה על ידי MRC (MR/L019523/1), קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] ומענק אייזק ניוטון נאמנות 19.23(n). C.C נתמך על ידי סטודנטית MRC DTP ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק. H.W. נתמך על ידי סטודנטיות DTP MRC. H.P. נתמך על ידי מענק לדוקטורט של Wellcome Trust (105391/Z/Z/14/Z) ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/Z/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק MRC (MR/ L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A.
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
