Summary
여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 화학유인성 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량적 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
화학적 구배에 의한 백혈구 안내는 면역 반응에 필수적입니다. 호중구는 중요한 항균 기능을 수행하는 조직 손상 부위에 모집 된 최초의 세포입니다. 이 유전자좌로의 밀매는 케모카인을 포함한 여러 염증성 화학 유인제에 의해 조정됩니다. 분자 수준에서, 화학유인제 신호전달은 상응하는 수용체의 세포내 밀매에 의해 조절된다. 그러나 케모카인 수용체의 세포 내 변화가 세포 및 조직 수준에서 백혈구 이동 역학에 어떻게 영향을 미치는지는 분명하지 않습니다. 여기서 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량 분석을위한 방법론을 설명합니다. 이러한 도구는 제브라피쉬 호중구에서의 차등 케모카인 수용체 밀매가 조직 손상 부위에서 호중구 군집화 및 분산을 조정한다는 것을 밝혀냈다. 이것은 염증 반응이 어떻게 스스로 해결되는지에 대한 우리의 이해에 영향을 미칩니다. 기술된 도구들은 다양한 생리학적 및 병리학적 설정들에서 호중구 이동 패턴을 이해하는데 사용될 수 있고, 방법론은 다른 신호전달 수용체들로 확장될 수 있다.
Introduction
백혈구 이동은 면역 반응에 가장 중요합니다. 면역 세포는 원형 철새 세포로, 조직과 혈관을 횡단하고 미생물 또는 기타 중요한 숙주 세포쪽으로 방향으로 이동하기위한 다양한 화학적 안내 신호를 감지 할 수 있습니다. 올바른 지침은 화학 유인 물질의 인식에 의존하며, 그 중 케모카인은 가장 두드러진 범주1을 나타냅니다. 케모카인은 고도로 특이적인 일곱 막횡단 G 단백질 결합 수용체에 의해 인식된다. 케모카인 결합시, 케모카인 수용체는 형태 변화를 일으켜 연관된 삼량체 G 단백질의 활성화와 세포골격 변화 및 지시된 이동을 촉진하는 기능적 신호전달 서브유닛으로의 해리를 유도한다1. 이차적으로, 케모카인 수용체는 인산화되고, 이러한 변형은 유인제에 대한 탈감작으로 이어지고, 이는 신속한 재감작/재활용 또는 세포내 분해 및 세포 표면으로부터의 하향 조절(down-regulation 2)에 뒤따를 수 있다. 이러한 수용체 역학은 세포에 의해 수신되는 신호전달의 지속 기간 및 용량에 영향을 미치지만, 이들이 백혈구 이동 거동에 어떻게 영향을 미치는지 생체내에서 밝히기가 어려웠다.
전통적인 포유류 시스템에서 살아있는 백혈구에서 수용체 역학을 추적하는 것은 몇 가지 도전에 직면 해 있습니다. 살아있는 연구를 위해, 형광 단백질과의 수용체 융합은 세포에서 발현되어야 한다. 이것은 원발성 백혈구, 특히 호중구에서 도전적이며, 지금까지의 연구는 케모카인 수용체 3,4를 발현하기 위해 대리 호중구 세포주를 사용했다. 백혈구가 유익한 인신 매매 결함 5,6을 갖는 형광 수용체 또는 돌연변이 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델의 생성은 상당한 시간과 자원의 투자를 수반한다. 이러한 경우에도, 살아있는 동물에서 수용체 역학을 영상화하기 위한 이미징 해상도 및 콘트라스트는 제한될 수 있고, 연구는 고정된 조직 절편(5)에 대한 면역조직화학을 이용하였다. 이러한 기술적 과제를 감안할 때, 화학 유인 수용체 역학이 살아있는 조직 환경에서 세포 거동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해는 현재 제한적입니다.
여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 수용체 밀매를 모니터링하는 방법론을 제공합니다. 제브라피쉬는 생쥐처럼 유전적으로 다루기 쉽지만, 효율적인 트랜스포존 시스템과 직접 접합체 조작을 통해 트랜스제네시스가 비교적 더 간단하다7. 투명한 유충은 이상적으로 이미징에 복종 할 수 있습니다. 케모카인 수용체 역학은 형광 리포터 8,9,10과의 상응하는 융합체의 발현에 의해 원시성 생식 세포 및 측선 프리모듐에서 시각화되었다. Zebrafish 유충은 포유류 호중구와 관련하여 유전 적 및 세포 특성을 고도로 보존 한 성숙한 호중구를 갖추고 있습니다. 세포골격 역학 및 극성 조절제와 같은 세포하 신호전달 역학은 상응하는 트랜스제닉 라인(11,12,13)의 생성에 의해 이들 세포에서 시각화되었다. 최근에, 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응의 과정 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학을 시각화하고 기능적으로 분석하였다14. 여기에서는 호중구에서 케모카인 신호전달을 위한 형질전환 리포터 라인의 생성, 라이브 이미징을 위한 배아의 준비, 호중구 신호전달을 연구하기 위한 상처 분석 및 이미지의 획득 및 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 또한 후보 리간드에 대한 케모카인 수용체 반응을 시험하기 위한 사이드 프로토콜을 제공하며, 이는 특징이 없는 수용체에서 리간드 인식 패턴을 확립하려고 할 때 유용하다. 이들 기술은 내인성 케모카인 발현의 억제 또는 변경된 리간드-유도된 인신매매를 갖는 돌연변이 수용체의 생성과 같은 추가의 유전자 조작과 조합하여, 특정 신호전달 역학이 생체내에서 백혈구 거동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 사용될 수 있다. 형광 태깅된 케모카인 수용체를 발현하는 트랜스제닉 라인은 또한 내인성 케모카인 구배에 대한 리포터로서 사용될 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 직접 항체 염색에 의해 검출하기 어렵다. 기술된 방법론은 리포터의 생성을 다른 면역-신호전달 수용체로 확장시키기 위한 범위를 제공한다.
Protocol
참고 : 모든 제브라 피쉬는 ARRIVE 지침 및 영국 홈 오피스 규정, 영국 동물 (과학 절차) 법 1986에 따라 보관되었습니다.
1. 백혈구에서 수용체 밀매를 영상화하기 위한 형질전환 리포터 제브라피쉬 유충의 생성
- 관심있는 형광 태깅된 수용체의 조직 특이적 발현을 위한 Tol2-기반 구축물을 생성한다. 호중구의 경우, 라이소자임C15 및 골수퍼옥시다제 유전자16으로부터의 프로모터 서열을 사용한다. 작제물은 단일 형광 단백질 (예를 들어 GFP), 탠덤 형광 타이머 (예를 들어, 빠른 폴딩 GFP 및 느린 성숙 tagRFP 8,14,17) 또는 리포터 GFP 및 조절 막 마커9의 비시스트로닉 발현과의 융합으로서 설계될 수 있다 (접근법을 선택할 때 고려사항에 대한 논의 참조).
참고: 이 구축물은 수용체 발현의 내인성 수준을 재조정하지는 않지만, 관심있는 세포 유형에서 높은 수준의 수용체 발현을 얻는데 유용하다. 형광 태그의 위치를 결정하기 위해 유사한 수용체 3,5,6,8,9,10,14에 대한 문헌을 참조한다. - 난자 산란 전날 장벽으로 분리 된 표준 축산 관행18에 따라 야생형 성인 남성과 여성이 포함 된 탱크를 설치하십시오.
- 달걀 산란 당일, 12.5 ng/μL의 Tol2 DNA 구축물과 17.5 ng/μL의 트랜스포자제mRNA 7을 포함하는 미세주입을 위한 트랜스제네시스 혼합물을 준비한다. 불이 아침에 들어온 직후에 어항에서 장벽을 들어 올리고 (이것은 물고기 시설에 따라 다를 수 있음) mRNA 주입을 위해 15 분 이내에 알을 수집하십시오.
참고: DNA 용액이 혼합물 중의 트랜스포사제 mRNA의 분해를 피하기 위해 RNase가 없는지 확인하십시오. 이것을 우회하는 옵션은 Tol2 구조체와 트랜스포자제의 별도의 용액으로 계란을 주입하는 것입니다. - 제브라피쉬 알의 형질 전환 및 미세 주입에 대한 표준 프로토콜을 따르십시오19.
- 1 nL의 용액을 1 세포 단계 배아의 세포에 주입하십시오.
참고 : 발현 결과는 세포 내부에 주입하고 세포 내부에 명확하게 없을 수있는 주사를 버릴 때보다 일관성이 있습니다. 1 세포 단계 배아는 2-16 세포 단계 배아를 주입 할 때 세포 당 부피 주입의 변동성 때문에 목표로합니다. 옵션은 한 세포 단계 주사를 나중에 주사의 배치와 분리하는 것입니다.이 주사의 효능이 다른 경우. - 나중에 주입 된 배아를 확인하고 수정되지 않았거나 죽은 난자를 제거하여 클러치를 건강하게 유지하십시오.
- 수정 후 3 일 (dpf)에 형광 현미경으로 유충을 선별합니다. 마커는 호중구, 특히 이들 세포가 풍부한 인과적 조혈 조직 (CHT)에서 볼 수 있습니다.
참고: 표지된 세포의 비율은 상이한 구축물에 따라 다르지만, 일반적으로 호중구의 20-60%가 구축물을 발현할 것으로 예상된다. 낮은 비율은 일반적으로 성인 단계에서 더 많은 선별 검사를 예측합니다. 물고기를 키우기 전에이 배아의 샘플에서 고해상도 이미징 접근법을 사용하여 막에서 수용체의 올바른 국소화를 확인하는 것이 좋습니다. - 표준 축산 관행20에 따라 긍정적 인 애벌레를 키우십시오. 이들은 F0 세대를 나타냅니다.
- 생후 3개월에 창업자를 위해 F0 물고기를 선별합니다. 비-트랜스제닉 야생형으로 개별 물고기를 교차시키고, 해부 범위 하에서 관찰함으로써 수용체의 발현을 위해 그들의 자손을 3 dpf에서 스크리닝한다. 각 구조에 따라 달라지는 트랜스 제네시스 성공에 따라 십자가의 하위 집합에서 양성 자손의 비율을 관찰하십시오.
참고 : 좋은 전이 요법을 위해서는 성인의 약 삼분의 일에서 절반이 긍정적 인 자손을 낳을 것입니다. 클러치에서 양성 인 자손의 비율은 삽입 된 전이유전자의 카피 수에 따라 다르며 10-60 % 사이가 될 수 있습니다. 클러치 내의 멘델리안 비율을 추적하여 단일 삽입 트랜스제닉 (양성 유충의 50 % 비율을 찾아 F2 클러치에서 더 쉽게 확인됨)20을 확인하는 것이 도움이됩니다. - F1 세대를 대표하는 긍정적 인 자손을 키우십시오.
- 생후 3개월에, 안정한 F2 트랜스제닉 라인을 확립하기 위해 동일한 방식으로 F1 성인을 스크리닝한다.
- 전이유전자의 호중구 특이적 발현을 검증한 후 F2 유충에 대한 실험을 수행한다.
참고 : 트랜스 제네시스 동안 다양한 수준의 수용체 발현을 관찰 할 수 있으며 생물학적 질문에 가장 적합한 발현 수준을 얻기 위해 다른 트랜스제닉 클러치를 유지하는 것이 좋습니다. 초기 결과는 F0 또는 F1 유충에서 얻을 수 있습니다.
2. 백혈구 상처 반응을 평가하기 위한 제브라피쉬 배아 수집
- 안정적인 트랜스제닉 리포터 라인을 구축한 후, 성인과 암컷 트랜스제닉 어류 사이에 크로스를 설정하고 다음날 아침 알을 수집한다.
- 배아를 E3 배지 (또는 난수18)에서 28.5 °C에서 성장시킨다.
- 임의로, 24 hpf에서, 배아를 0.003% 표백제가 보충된 E3 배지 50 mL를 함유하는 원심분리 튜브에서 5분 동안 인큐베이션한다. 이어서 E3 배지에서 3 번 헹구어 튜브를 몇 분 동안 방치하여 배아가 바닥에 정착 할 수있게 한 다음 배지를 디캔팅하고 교체하십시오.
참고 : 이것은 상처 중 백혈구의 행동에 영향을 줄 수있는 유충의 감염 노출에 대한 통제 수준을 제공합니다. - 표백 후, 멜라닌 합성을 방지하기 위해 1-페닐-2-티오우레아의 0.003%가 보충된 E3 배지에 배아를 보관하십시오. 곰팡이 감염을 예방하는 데 자주 사용되는 메틸렌 블루는 조직 자동 형광을 최소화하기 위해 여기에 첨가되지 않습니다.
- 유충이 자연적으로 부화하도록 허용하고 호중구가 풍부 할 때 3dpf에서 사용하십시오21.
3. 애벌레의 복부 지느러미 상처
- 상처를 입히기 위해 애벌레를 준비하십시오. 풍부한 호중구가 관찰 될 때 2.5-3.5 dpf에서 유충을 사용하십시오. 유충을 160-200 mg / L 트리카인 MS222로 보충 된 E3 배지로 옮깁니다.
참고 : 트리카인의 농축 용액은 미리 분취량으로 준비하고 냉동해야하며 당일 해동해야합니다. - 유충을 E3 + 트리카인 배지에 15 분 동안 두어 마취되도록하십시오. 작은 붓이나 유사한 도구로 부드럽게 만져서 반응을 확인하십시오.
- 형광 해부 범위 하에서 트랜스제닉 수용체 발현을 갖는 유충을 선택한다.
- 유충을 E3 + 트리카인에있는 120mm 페트리 접시로 옮겨 상처를 입으십시오. 멸균 메스를 사용하여 해부 범위 하에서 관찰하면서 유충의 복부 지느러미를 자른다(그림 1).
참고 : 아이디어는 상당한 호중구 모집을 일으킬 수있을만큼 충분히 깊은 절단을 수행하지만 CHT의 혈관을 절단하지 않는 것입니다. 절단은 절개가 CHT의 혈관에 거의 도달하도록 CHT 축에 수직으로 만들어집니다. 이것은 약간의 연습이 필요하며 먼저이 목적을 위해 생성되지 않은 애벌레 (예 : 다른 실험의 과도한 애벌레)에 대한 감독을 통해 수행되어야합니다.
4. 살아있는 영상화를위한 유충의 준비
- 가열에 의해 E3 매질에 저융점(LMP) 아가로오스를 용해시켜 액체 2% 아가로스 용액을 얻었다.
- 이 용액을 60°C까지 식히십시오.
참고 : 다른 유충의 장착 사이에 아가로스 세팅을 피하기 위해 60 °C의 인큐베이터에 아가로스가있는 플라스크 또는 튜브를 보관하십시오. - 0.5 mL의 액체 LMP + E3를 현미경 이미징을 위한 유리 바닥 접시에 피펫.
- 유리 바닥 접시에 0.5 mL의 E3 + 2x Tricaine과 함께 부상당한 마취 된 제브라 피쉬 유충을 피펫하십시오.
- 두 용액을 부드럽게 혼합하여 1% LMP/1x 트리카인 아가로스/E3 용액을 얻어 거품 생성을 방지합니다. 배아를 옆으로 향하게하고 부드럽게 밀어 물고기의 꼬리 부분이 유리에 최대한 가까워지도록하십시오.
참고: 영상화할 조직은 거꾸로 현미경으로 이미징할 때 유리 바닥에 최대한 가까이 있어야 합니다. 유충의 방향 설정은 유충이 위치하기 전에 아가로스가 설정되지 않도록 신속해야합니다. - 아가로스 용액을 식히고 5-10 분 동안 응고시킵니다. 아가로스가 작은 페인트 브러시 또는 팁으로 아가로스 젤을 부드럽게 만져서 설정되었는지 테스트하십시오.
- 아가로스가 고체가 되면 0.2mg/mL의 트리카인이 보충된 E3 2mL를 이미징 플레이트에 첨가합니다.
5. 라이브 공초점 이미징
참고: 회전하는 디스크 공초점 현미경 또는 이와 동등한 배아를 이미지화합니다(그림 2). 레이저 스캐닝 현미경도 사용할 수 있지만 역학의 시간적 해상도는 더 제한적입니다. 부상당한 유충을 가져 오기 전에 이미징 설정을 준비하여 상처 후 가능한 한 빨리 반응을 이미징 할 수 있도록하십시오. 호중구는 5 분 이내에 상처에 도착하고 처음 도착한 세포의 수용체는이 시간 프레임 내에 내재화 될 수 있습니다. 연습을 통해 상처 후 15 분 이내에 이미지를 찍을 수 있습니다.
- 현미경을 켭니다 : 제조업체 지침에 따라 레이저, 카메라 및 컴퓨터.
- 수집 소프트웨어를 사용하여 이미징 설정을 설정합니다. 이전 실험을 기반으로 적절한 형광단과 대략적인 노출 시간에 맞는 레이저를 선택하십시오 (488nm의 GFP 및 561nm 레이저로 tagRFP 획득).
- 장착 된 배아와 함께 플레이트를 아가로스 세트 후 가능한 한 빨리 공초점 이미징 회전 디스크 플랫폼으로 옮깁니다.
- 현미경 아이피스를 사용하여 무대 조이스틱을 사용하여 접시에서 물고기를 찾으십시오.
- 초점 손잡이를 사용하여 상처 부위에 초점을 맞춥니다.
참고: 관심 영역을 찾으려면 낮은 배율의 공기 목표물(10x)을 사용하는 것이 더 쉬울 수 있습니다. - 상처 주위를 이미지화할 필드를 선택합니다. 높은 수치 조리개로 30x/40x 목표를 사용하여 충분한 해상도를 얻으십시오.
- 소프트웨어 버튼을 사용하여 노출 시간을 조정하여 형광 마커가 좋은 콘트라스트로 볼 수 있지만 신호를 포화시키지 않고 볼 수 있습니다.
참고: 노출 시간은 형광 노출을 최소화하고 타임랩스에서 시간 분해능을 최대화하기 위해 가능한 한 낮아야 합니다. 레이저 파워는 레이저의 상태에 따라 다르지만 동적 이미징을 위해 충분히 낮은 노출 시간을 허용하는 수준으로 조정해야 합니다. - 소프트웨어 버튼을 사용하여 z-스택으로 이미지화할 볼륨을 선택합니다.
- 원하는 기간 동안 30초마다 시간 경과를 설정합니다.
참고 : 멸균 된 복부 지느러미 상처의 경우 최대 모집은 2-3 시간까지 관찰됩니다. - 타임랩스를 시작하기 전에 밝은 필드 스냅샷을 만들어 시야를 문서화합니다. 가능하면 타임랩스 동영상 내에서 밝은 필드를 얻습니다.
6. 제브라피쉬 호중구에서 수용체 내재화의 정량화
- 이미지 획득의 시간 간격과 이미지의 픽셀 크기를 기록합니다. 상처 후 이미징이 시작된 지 몇 분 동안 기록하십시오.
- 이미지를 소프트웨어 인터페이스로 드래그하여 피지를 사용하여 이미지 데이터 세트를 열고, 타임 슬라이더를 사용하여 각 데이터 세트에 대한 대표 프레임 (예 : 상처 후 1-1.5 시간)을 선택하고 저장하십시오.
- MATLAB을 계속 진행하여 이미지 데이터 세트를 처리합니다.
- 새 스크립트를 만들고 이미지 읽기(보충 파일 1의 중심 정의에 대해 'select_neutrophils.m'라는 스크립트의 6행), 열기(보충 파일 1의 11행) 및 이미지의 점을 수동으로 선택하는 기능(보충 파일 1의 12행)을 포함합니다.
- 이 스크립트 (보충 파일 1)를 실행하여 관심있는 프레임을 열고, 육안 검사로 분석 할 호중구를 식별하고, 클릭하고 복부 지느러미 상처와 CHT에서 중심 추정치를 기록하십시오.
참고: CHT에서 동원되지 않은 호중구는 수용체 분포가 일정하게 유지되는 호중구에 대한 내부 참조 역할을 합니다. 이것은 상처에서 세포의 대조 값을 내부 참조로 정규화 할 수있게합니다. - 아래 단계에 설명된 바와 같이 활성 윤곽선 기술(22 )을 사용하여 각 프레임에서 호중구의 세분화를 진행한다.
- 활성 윤곽선(즉, 반복 횟수, 윤곽선의 바이어스, 추정 중심 등)에 의한 세분화에 필요한 메타데이터를 포함하는 함수를 생성합니다. 22 ( 보충 파일 2의 '상처 데이터.m' 참조).
- 'wound_data.m' 함수를 호출하여 각 호중구의 세분화에 필요한 정보를 입력하는 스크립트를 만듭니다( 보충 파일 3의 'calc_contrast.m'라는 스크립트의 28행).
- 이미지 읽기를 위한 스크립트 명령( 보충 파일 3의 32행)에 포함하십시오.
- 입력 이미지와 동일한 크기의 검은 색 이미지 (즉, 픽셀 값이 0 인 이미지)의 생성 ( 보충 파일 3의 44 행)과 각 호중구의 중심 주위× 10 10 픽셀의 정사각형 정의 ( 보충 파일 3의 45 행)를 추가하십시오.
- 활성 윤곽선(보충 파일 3의 48-49행)을 사용한 호중구 세분화와 작은 잘못 감지된 물체의 제거( 보충 파일 3의 52행)를 포함합니다.
참고: 초기 분할 윤곽선은 중심 주위의 사각형으로, 픽셀 강도, 반복 횟수 및 윤곽선의 바이어스를 기반으로 활성 윤곽선 기술에 의해 진화합니다. 세그멘테이션의 결과는 모든 픽셀이 값 1을 갖는 호중구 영역과 떨어져 값 0을 갖는 이진 마스크입니다. - 세그먼트화된 이진 이미지를 원래 이미지와 곱하여 호중구의 픽셀 강도만 가져오고, 나머지 이미지는 숫자가 아니므로 계산에 기여하지 않습니다( 보충 파일 3의 56-57행).
- 각 호중구 (GLCM)14,23 (보충 파일 3의 61 행)에 대한 회색 수준 공동 발생 행렬의 계산을 추가하십시오. GLCM은 픽셀 강도의 관점에서 픽셀의 상대적 위치를 보여주는 이미지의 또 다른 표현입니다.
- GLCM에 기초한 호중구의 명암비의 계산을 포함하십시오 ( 보충 파일 3의 62,65 행). 대비 메트릭은 인접 픽셀 간의 강도 차이를 측정합니다. 픽셀은 특정 거리 떨어진 픽셀과 비교되며, 이는 강도의 로컬 피크의 크기에 따라 경험적으로 조정할 수 있습니다. 표시로서, 0.389 μm의 픽셀 크기를 갖는 이미지의 경우, 수용체가 수포 분포를 나타냈을 때 각각의 밝은 점은 5 픽셀의 범위였다. 따라서, 강도는 5 픽셀 간격으로 픽셀 단위로 비교되었다.
- 복부 지느러미의 개별 호중구에 대한 값을 별도로 저장하는 명령을 추가합니다( 보충 파일 3의 68행).
- 상처에서의 호중구에 대한 것과 동일한 방식으로 모든 CHT 호중구로부터의 평균 호중구 대조 값의 계산을 포함시킨다 (보충 파일 3의 줄 72-119). CHT 호중구의 경우 'cht_data.m' 함수를 호출합니다( 보충 파일 4의 77행).
- 상처에서의 개별 호중구의 명암치의 합격화를 단계 6.16에서 상기 계산된 CHT 호중구의 평균 대비치(즉, 분열)로 정규화하는 것을 포함한다( 보충 파일 3의 줄 122). 이것은 대조군 무반응 세포에 비해 개별 반응 세포에서 수용체의 출현이 어떻게 '도티'되는지를 반영하는 정규화 된 대조를 제공합니다 (그림 3 및 그림 4).
- 소프트웨어에서 실행 기호를 클릭하여 스크립트(보충 파일 3)를 실행합니다.
- 다른 조건에 대해 모든 단계를 반복합니다.
- 통계 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 열 테이블을 만들고, 결과를 플로팅하고, 통계 테스트를 수행하여 평균값 간의 차이의 유의성을 확인하여 다양한 조건에 대한 결과를 가져옵니다.
참고: 분석 코드는 GitHub at https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic 에서도 찾을 수 있습니다.
7. 초기 배아에서의 케모카인 반응 분석
참고: 이것은 후보 케모카인에 대한 반응에서 수용체 분포 변화의 시험을 허용하는 선택적인 측면 실험이며, 수용체 구축물의 호중구 발현에 관한 상기 기술된 실험과는 무관하다. 수용체 사이의 리간드-유도된 인신매매의 차이는 리간드 수준이 포화되기 때문에 이 기술로 확립하기가 어렵다(14). 그러나, 만약 이 시스템에서 수용체의 리간드-내재화를 본다면, 이것은 리간드 동일성이 불분명한 경우에 리간드가 수용체에 의해 인식된다는 표시일 수 있다. 이는 HEK293T 세포(14 )와 같은 확립된 세포주에서 케모카인 수용체의 발현이 번거로울 수 있기 때문에 유용하다.
- 야생형 물고기 (예 : AB)의 십자가를 설정하고 분리기를 들어 올린 직후 다음날 아침 알을 수집하십시오 (위에서 설명한 바와 같이).
- 100 pg의 형광 태깅된 수용체 mRNA (예를 들어, Cxcr1-FT)를 막 마커 (예를 들어, 막 CFP)에 대해 100 pg의 mRNA와 함께 주입한다. 혼합물에 케모카인 리간드에 대한 mRNA의 다양한 투여량을 포함한다.
참고: 150 pg Cxcl8a mRNA는 형광성 Cxcr1-FT의 현저한 내재화를 주었다( 도 5 참조). - 배아를 E3 배지로 헹구고 28°C에서 배양한다.
- 약 7 hpf에서, 형광 해부 범위 상에서 mRNA의 발현을 시험하고 이미지화할 배아를 선택한다.
- 0.8% LMP 아가로스를 미리 준비하고 60°C의 히트 블록으로 유리 튜브에 보관하십시오. 유리 피펫을 사용하여 배아를 조작하십시오. 각 손에 한 쌍의 포셉을 사용하여 배아를 부드럽게 데코리오네이트하십시오.
- 유리 피펫으로 개별 데코리온 배아를 흡인하여 끝에 거품이 없는지 확인하십시오. 배아를 아가로스 튜브에 부드럽게 풀어 튜브에 가라 앉히십시오.
- 아가로스 튜브에서 배아를 흡인하여 길을 따라 액체 아가로스를 수집하십시오. 배아를 유리 바닥 이미징 접시의 중앙에 부드럽게 놓습니다. 동물 기둥이 접시의 바닥을 향하도록 배아를 빠르게 회전시킵니다 (거꾸로 된 현미경을 사용할 때이 쪽은 목표에 가장 가깝습니다).
참고 : 아가로스가 여전히 설정되어있는 동안 배아의 방향을 재조정해야 할 수도 있습니다. - 아가로스를 설정 한 후 2 mL의 E3 배지로 보충하십시오.
참고 :이 단계의 배아는 애벌레에 비해 매우 약하며 데코리오네이트하고 장착하는 데 약간의 연습이 필요합니다. 배아 파열을 피하기 위해 가능한 한 부드럽게 흡인하고 방출하는 것이 중요합니다. - 접시 당 3-5 개의 배아를로드하는 것을 목표로하는 과정을 반복하십시오.
- 거꾸로 된 공초점 현미경에 배아 를 이미지화하십시오 (자료 표 참조). 40x/1.3 NA 오일 목표를 사용하여 충분히 높은 분해능을 얻으십시오. 범위에서 각각 405, 488 및 552nm로 mCFP, sfGFP 및 tagRFP를 시각화합니다. 필터와 설정을 조정하여 콘트라스트가 높도록 하면서 채도를 방지하고 채널 간 누출을 최소화합니다.
- 다양한 조건에 대해 장착 및 이미징을 반복하십시오.
Representative Results
복부 지느러미 상처는 CHT에서 복부 지느러미로 급속 호중구 동원 및 30-60 분 이내에 상처 마진에서 군집화됩니다 (그림 1). 우리는 제브라피쉬 호중구 24에 의해 발현되는 두 개의 케모카인 수용체인 Cxcr1 및 Cxcr2의 분포를 시각화하고 스핀 디스크 공초점 현미경을 사용하여 Cxcl8a 및 Cxcl8b14를 인식합니다. 우리는 두 개의 상응하는 트랜스제닉 라인, Tg(lyz:Cxcr1-FT) 및 Tg(lyz:Cxcr2-FT)를 생성했는데, 여기서 호중구는 수용체의 형광 타이머(FT) 구축물, 즉 sfGFP 및 tagRFP의 탠덤과의 융합을 발현한다(도 2 및 참조14). 두 형광단의 사용은 광범위한 수용체 운명을 모니터링하고 원형질막에서의 단백질 턴오버 시간의 추정치를 제공하기위한 것이었으며, 새로 합성 된 수용체는 녹색으로 형광을 띠고 8,14 세가되면 점진적으로 적색이됩니다. 그러나, 이들 수용체는 호중구 원형질막에서 빠른 구성적 턴오버를 가지며 체류 시간이 tagRFP의 성숙 시간보다 짧았고, sfGFP는 막 국소화를 나타내고 tagRFP는 정상 상태에서 수포 국소화를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (보충 비디오 1 및 참조14). 따라서, 우리는 조직 손상 부위에서 리간드-유도된 내재화를 모니터링하기 위해 sfGFP의 분포에 초점을 맞추었다. 수용체 분포의 패턴은 이웃 픽셀들 사이의 강도의 차이를 보고하는 콘트라스트 메트릭을 사용하여 정량화되었다. 그 근거는 수용체 분포가 막강하고 매끄럽게 될 때 대조 값이 낮다는 것입니다. 수용체 분포가 수포성이고 더 많은 구멍을 뚫으면 명암비가 높습니다 (그림 3).
대안적인 방법은 대조군 막 마커, 예를 들어 막 CFP(mCFP)의 수준에 대한 수용체 수준(sfGFP 강도)의 비율을 정량화하는 것이다(도 3). 두 방법 모두 세포에서 전세계적으로 더 많은 수포 수용체 분포 패턴 (더 높은 명암치) 또는 막에서의 낮은 수용체 수준 (더 낮은 sfGFP / mCFP 비율)에 의해 나타나는 것처럼 수용체 내재화를 감지 할 수 있습니다. 그러나, 콘트라스트 메트릭은 또한 상처에서 호중구 클러스터에서 수용체 내재화를 검출할 수 있었는데, 여기서 막 분할은 덜 정확했고 적용 가능하지 않았다(그림 3). 이 메트릭을 사용하여 상처에서 호중구에서 Cxcr1과 Cxcr2 밀매의 가시적 인 차이를 정량화 할 수있었습니다 (그림 4 및 보충 비디오 2). Cxcr1-FT는 상처에 위치한 세포에 내재화되는 반면, Cxcr2-FT는 상처에서 호중구에서 막강한 상태로 남아있었습니다 (그림 4A-C, 보충 비디오 2 및 보충 비디오 3). 모르폴리노 치료를 통해 Cxcl8a 및 Cxcl8b의 억제는 상처에서 Cxcr1-FT 내재화에 차별적으로 영향을 미쳤다 (그림 4C, D). Cxcr1-FT가 Cxcl8a에 반응하는지 더 검증하기 위해, 우리는 초기 배아에서 케모카인 반응 분석을 수행했습니다. 우리는 Cxcr1-FT가 Cxcl8a가 공동 발현된 배아에서 현저하게 내재화된다는 것을 발견했다(도 5). 전체적으로 이들 결과는 호중구에서 케모카인 유도된 수용체 내재화를 측정하고 이들 효과를 매개하는 리간드의 동일성을 확립하기 위해 기술된 방법이 전개될 수 있음을 나타낸다.
그림 1: 복부 지느러미 상처로의 호중구 이동. (A) (왼쪽) 꼬리 조혈 조직 (CHT), 금성 순환 (VC, 파란색), 복부 지느러미 (VF) 및 상처 부위의 위치를 보여주는 3 dpf 유충의 만화. (오른쪽) 호중구가 CHT에서 동원되어 상처에서 군집하는 상처 (W)의 영역을 묘사하는 만화. CHT 조직의 꼬리 정맥 신경총 (CVP)은 파란색으로 그려집니다. (B) 밝은 필드 이미지 (왼쪽) 및 공초점 투영 (오른쪽)은 상처 후 2 시간에서 Tg (mpx : GFP) 유충에서 복부 지느러미 상처와 호중구의 분포를 보여줍니다. 파선은 VF 및 CHT 윤곽선을 표시합니다. 스케일 바 = 25 μm. 만화 및 형광 이미지는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 호중구에서 케모카인 수용체 밀매의 라이브 이미징. (a) Cxcr1-FT (형광 타이머) 및 Cxcr2-FT의 호중구 특이적 트랜스제닉 발현에 사용되는 작제물. 3 dpf 트랜스제닉 유충의 머리에서 호중구의 공초점 돌기 (Tg(lyz:Cxcr1-FT), 상단; Tg(lyz:Cxcr2-FT), 하단)는 tRFP(마젠타) 및 sfGFP(녹색) 채널을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. (B) 도 1A에서와 같이 3 dpf 유충의 해부학적 계획. 유충 아래에는 CHT (상단)에서 동원되거나 복부 지느러미 (하단)에 들어갈 때 화학 주성을 수행하는 호중구가있는 상처 (W)의 면적을 묘사하는 계획이 있습니다. 파선 사각형은 오른쪽의 스냅숏으로 이미지화된 영역을 나타냅니다. (C) CHT (상단 패널) 또는 상처 (하단 패널)쪽으로 화학 주축을 동원 할 때 Tg (lyz : Cxcr1-FT) 유충 (sfGFP가 표시됨)의 호중구. 화살표는 시간이 지남에 따라 동일한 셀을 표시합니다. 오른쪽 이미지의 시간 지점은 왼쪽의 이미지 이후 경과된 시간(분)입니다. 스케일 바 = 10 μm. (D) 케모카인 수용체 밀매의 라이브 이미징을 위한 실험적 접근법의 개략적인 표현. 패널 A-C가 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 수용체 역학의 정량화 예. CHT에서 상처 또는 비동원된 호중구에서 단일(청색) 또는 군집형 호중구(녹색)(적색, 주황색)를 분절하고 결과를 비교하기 위해 상이한 방법에 의해 분석하였다. 표시된 동일한 예제 셀은 이미지에서 보이는 것을 추출된 값의 범위와 관련시키는 두 가지 방법으로 분석되었습니다. (a) 선택된 실시예 셀의 표면은 sfGFP 채널에서의 윤곽선 정의에 기초하여 분절되었다. (B) 콘트라스트는 A. (C)에 나타낸 실시예 세포로부터 계산하였고, 선택된 세포들, 실시예 셀들의 멤브레인은 CFP 채널에서의 등고선 정의에 기초하여 분절되었다. sfGFP/CFP의 비율계량 분석이 뒤따랐다. (D) sfGFP/CFP의 비율은 C. 에러 막대는 개별 세포로부터 S.E..M.를 나타내는 예시 셀에서 계산되었으며, n>1의 경우, 여기의 값들은 통계적 분석에 사용되지 않고 단지 상이한 정량화 방법으로 얻은 측정치를 예시하기 위한 것이다. 스케일 바 = 10 μm. 참조14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 상처에 대한 반응에서 Cxcr1 및 Cxcr2의 차동 역학. (A) 상처 후 80분에 상처에서 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 또는 Tg(lyz:Cxcr2-FT) 유충에서 호중구의 공초점 투영(sfGFP 채널 표시). 스케일 바 = 10 μm. (B) 상처에서 확대된 Cxcr1-FT 호중구(왼쪽) 및 Cxcr2-FT(오른쪽). 녹색 수용체는 회색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 5 μm. (C) 정규화된 대조 (CHT에서 동원되지 않은 세포의 평균 대비로 정규화된 개별 호중구 당 대비). cxcl8a는 cxcl8a에 대한 번역 블로킹 모르폴리노와 함께 스플라이스 블로킹의 주입을 지칭한다. cxcl8b는 cxcl8b에 대한 스플라이스 블로킹 모르폴리노를 사용한 주입을 지칭한다. Tg (lyz : Cxcr1-FT)의 경우 : n = 24 세포 (CHT), n = 8 마리의 유충에서 나온 47 세포 (상처). 모르폴리노스를 가진 Tg (lyz:Cxcr1-FT)의 경우: 5마리의 유충에서 n=28 세포(Cxcl8a-MO), 5마리의 유충으로부터 n=16개의 세포(Cxcl8b-MO)가 있다. Tg (lyz : Cxcr2-FT)의 경우 : n = 10 세포 (CHT) 및 n = 20 세포 (상처) 3 마리의 유충. 데이터는 1-5 개의 이미징 세션에서 획득 한 독립적 인 유충으로부터 풀링되었습니다. Tg(lyz:Cxcr1-FT)에 대한 Dunn의 다중 비교 테스트, Tg(lyz:Cxcr2-FT)에 대한 2개의 꼬리 무쌍 Mann-Whitney 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 테스트. (d) 지느러미 상처에 반응하는 cxcl8a 모르폴리노(MO)(왼쪽) 및 cxcl8b MO(오른쪽)로 처리된 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 형질전환 유충에서 호중구의 공초점 투영(녹색으로 표시된 sfGFP 채널). 동등한 호중구 축적의 시점에서 찍은 스냅 샷 (왼쪽 이미지에서 85 분, 오른쪽 이미지에서 상처 후 45 분). 스케일 바 = 10 μm. 참조14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 초기 배아에서의 케모카인 반응 분석. 레이저-스캐닝 공초점 Cxcr1-FT. Cxcr1-FT mRNA의 발현 및 분포를 나타내는 가스트레이션 배아의 공초점 슬라이스를 150 pg Cxcl8a mRNA가 있거나 없는 150 pg의 세포-단계 난자에 주입하였다. 녹색 및 적색 수용체는 별개의 채널로 표시된다. 대조군 막 CFP 마커 (mCFP)는 시안 채널에 도시되어 있다. 스케일 바 = 20 μm. 참조14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 1: 3 dpf에서 Tg (lyz : Cxcr1-FT) (왼쪽) 및 Tg (lyz : Cxcr2-FT) (오른쪽) 유충의 머리에있는 형질전환 호중구. sfGFP (녹색), tagRFP (자홍색). 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 5fps입니다. 스케일 바 = 20 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 2: Tg(lyz:Cxcr1-FT)(왼쪽)와 Tg(lyz:Cxcr2-FT)(오른쪽)의 호중구가 지느러미 상처에 반응하는 형질전환 유충입니다. 영화는 상처 후 10 분 이내에 시작되어 60 분 동안 지속됩니다. sfGFP (녹색), tagRFP (자홍색). 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 10fps입니다. CHT = 인과적 조혈 조직. VF = 복부 지느러미. 스케일 바 = 25 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 3. 상처 입은 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 트랜스제닉 유충(비디오 2에 표시된 것과 다른 유충)으로부터의 호중구의 추가 예는 CHT에서 동원될 때 또는 복부 지느러미에 진입 및 화학주성시 수용체 내재화(녹색으로 표시된 sfGFP 채널)를 보여주는, 더 높은 해상도로 획득되었다. 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 2fps입니다. 스케일 바 = 10 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기술된 방법은 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 계내에서 내인성 리간드에 반응하는 수용체 역학의 살아있는 이미징을 허용한다. Cxcr1/Cxcr2 호 중구 리포터의 사용은 감염, 종양 모델 또는 다른 유형의 조직 손상(14,25,26,27)과 같은 다른 생리학적 설정으로 확장될 수 있다. 또한, 내인성 수용체가 외인성 돌연변이 수용체에 의해 억제되고 구출되는 트랜스제닉 구조 라인은 면역 반응에서 특정 호중구 이동 패턴의 중요성을 해부하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있다. 예를 들어, 탈감작 장애를 갖는 Cxcr1 수용체 돌연변이체는 염증 부위(14)에서 더욱 두드러진 호중구 클러스터링을 야기한다. 이러한 기능 표현형의 이득은 상이한 생리학적 과정들, 예를 들어, 상처 복구, 감염성 질환 또는 종양 진화, 및 보체 수용체 녹다운/녹아웃 실험에서 호중구 회중의 역할을 이해하는데 사용될 수 있다. 이 방법론은 또한 사용 가능한 기자의 범위를 확대 할 수있는 기반을 제공합니다. 형광 리포터의 선택은 고려해야 할 중요한 것이며 생물학적 질문에 달려 있습니다. 우리는 호중구에서 이러한 케모카인 수용체의 구성 회전율이 상피 세포와 비교하여 높았으며 빠른 성숙 (예 : sfGFP)을 가진 기자가 정상 상태에서 막 수준을보고하고 호중구 자극시 차이를 해결해야한다는 것을 발견했습니다 8,14. 따라서, sfGFP/tagRFP의 막 비율은 이 세포 유형에서 리간드-유도된 내재화를 측정하는 데는 적용되지 않지만, tagRFP의 패턴은 수용체의 세포내 운명의 추적을 허용하며, 이는 일부 연구에서 유용할 수 있다. 우리는 또한 tagRFP의 더 집중된 세포 내 신호가 개별 유충을 스크리닝하는 데 유용하다는 것을 발견했습니다. 원형질막에서 수용체 수준을 측정하기 위한 대안적인 접근법은 동일한 전이유전자(9) 또는 독립적인 전이유전자(14)에서 호중구에서 형광막 마커를 공동발현시키는 것이다. 이전의 시나리오에서, 전이유전자는 물고기를 스크리닝하기 위한 추가적인 수단을 제공할 것이고, 발현 수준은 마커와 수용체 사이에서 필적할 것이다. 후자의 접근법은 수용체 리포터가있는 제브라 피쉬 라인이 다른 리포터 라인과 결합 될 수 있다는 점에서 더 모듈화 될 것입니다. 두 경우 모두 수용체 수준의 막 정량화가 군집형 호중구에서 어렵다는 점은 주목할 가치가 있습니다 (아래 참조). 마지막으로, 우리는이 프로토콜의 가능한 확장은보다 상세한 국소화 분석을 위해 면역 조직 화학에 의한 라이브 이미징을 후속 조치하는 것입니다.
Tol2 형질생성 시스템은 잘 확립되어 있고7 라이소자임 C 프로모터는 호중구 발현11,15를 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 따라서, 트랜스제네시스 접근법은, 비교적 간단하고, 이러한 프로모터로 달성된 발현 수준은 수용체 역학의 분석을 위한 충분한 콘트라스트를 제공하기에 충분히 높다. 가능한 제한은 발현 수준이 내인성 수용체 발현 수준을 재구하지 않는다는 것이다. 새로운 CRISPR 기술은 특정 관심의 수용체에 대한 녹인 라인을 확립하기 위해 배치될 수 있다(28). 이러한 기술은 여전히 번거롭고 세포 내 이미징에 필요한 발현 수준을 보장하지는 않지만 성공적인 개발은 내인성 신호 역학을 이해하는 데 중요한 돌파구가 될 것입니다. 기능적 검증은 트랜스제닉 수용체 구축물을 사용한 데이터를 해석하는데 중요하다. 예를 들어, 리간드 인식 분석은 형광 융합 단백질이 기능적이라는 것을 확립하는데 사용될 수 있고, 넉아웃 표현형을 구하고, 트랜스제닉 호중구 발현 수준이 기능성14와 양립가능하다는 것을 확립하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 수용체 융합을 검증하는 보다 직접적인 방법은 표지되지 않은 버전14와 함께 표지된 수용체를 갖는 시험관내 기능적 검정을 이용하는 것이다.
정량화 접근법은 생체 내에서 호중구에서 정확한 막 세분화의 특정 어려움을 해결합니다. 상피 성질의 세포에서, 수용체 수준의 정량화는 막 수용체 수준을 조절 마커로 정상화함으로써 자동으로 실행될 수 있으며, 이는 병렬로 또는 개별적으로 발현될 수 있다9. 실제로, 우리는 가스트레이션 배아14에서 리간드-인식 검정을 사용할 때 그러한 접근법을 적용하였다. 그러나 호중구는 생체 내에서 세포 모양의 복잡하고 급격한 변화를 겪어 2D 및 3D14에서 막 세분화를 어렵게 만듭니다. 이것은 호중구 군집이 많은 생리적 환경29에서 발생하는 경우 훨씬 더 도전적입니다. 대조 메트릭은 막 세분화를 필요로하지 않고 대신 세포에서 수용체 분포의 전체 상태 (막성 / 부드러운 대 수포 / 도티)를 반영하기 때문에이 제한을 극복합니다. 콘트라스트 메트릭은 이미지의 전체 대비에 의해 영향을 받을 수 있으므로 서로 다른 배아/샘플에서 신호의 변동성을 설명하기 위해서는 개별 세포 값을 내부 참조로 정규화해야 합니다. 예를 들어, 우리는 CHT에서 반응하지 않는 호중구의 평균 세포 대조 값 (즉, 정지되어 있고 복부 지느러미로 이동하지 않는 호중구)14를 사용했습니다. 추가적인 가능성은 동일한 세포에서 대조 마커의 대조 값으로 정규화하는 것이다. 이것은 무반응 세포의 내부 참조가 이용 가능하지 않을 때 해결책을 제공 할 것이고, 다른 조건 사이의 수용체 역학의 미세한 정량적 차이를 해결할 수 있습니다.
이미징의 위치는 고려해야 할 또 다른 변수입니다. 더 일반적으로 사용되는 꼬리 지느러미 상처 모델16,30과는 달리 복부 지느러미 상처를 여기에서 선택하는 이유는 상처 부위가 호중구 거주지 / 철새 기원 부위 근처에 있기 때문입니다. 이것은 호중구가 도착하는 데 상대적으로 적은 시간이 걸리기 때문에 분석의 타임 라인을 가속화합니다. 추가적으로, 그것은 이동 기원 (CHT) 및 관심의 표적 위치 (상처) 둘 다에서 세포 거동을 포착할 수 있는 기회를 제공한다. 이는 세포하 영상화에 필요한 공간적 및 시간적 분해능이 넓은 시야각 또는 다중 위치 스캐닝과 결합하기 어렵기 때문에 여기에서 관련이 있다. 따라서, 복부 지느러미 상처 분석은 이동 기원으로부터의 이주 반응의 진화를 추적하고 반응하지 않는 세포에서 비특이적 수용체 변동을 동시에 포착하는 것을 허용한다. 위에서 언급했듯이, 후자는 불특정 역학에 대한 내부 참조를 제공하기 때문에 정량화 목적으로 유용합니다. 다른 시스템에서, 이러한 내부 참조를 갖는 것이 불가능할 수 있으며, 이 경우 공동-발현된 막 마커의 콘트라스트 값은 대안적인 제어를 제공할 것이다.
요약하면, 우리는 방법론이 다른 시스템에 적용 가능하고 다양한 목적으로 배포 될 수 있다고 예상합니다. 예를 들어, 동일한 리포터가 감염 설정 또는 다른 질병 모델과 같은 다른 염증 설정에서 활용될 수 있다. 제브라피쉬 수용체 리포터 라인의 레퍼토리는 다른 신호전달 수용체로 확장될 수 있고, 신호전달 메카니즘을 이해하거나 생체내에서 리간드 역학을 보고할 수 있다. 이 접근법은 녹다운/녹아웃 기술과 결합하여 관찰된 역학의 기계론적 기초를 조사할 수 있다. 예를 들어, 리간드 발현의 섭동은 관찰된 수용체 역학에 대한 리간드 의존성을 나타낼 수 있다. 앞으로는 기자의 녹인 삽입을 통합하기 위해 시스템을 더욱 정교하게 만들 수 있을 것으로 예상합니다. 궁극적으로,이 방법론을 사용한 발견은 포유류에서 이러한 신호 수용체의 보존과 더 큰 유기체에서 이러한 연구를 수행하는 상대적 도전을 감안할 때 제브라 피쉬 공동체를 넘어서는 가치있는 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 공초점 현미경 검사에 도움을 주신 Christine Holt와 Bill Harris에게 감사드립니다. 형광 타이머 백본 구축물에 대한 대런 길모어와 Tol2-Lyz 백본 벡터에 대한 Anna Huttenlocher에게 감사드립니다. Tg(mpx:GFP)i114 라인에 대해 Steve Renshaw에게 감사드립니다. 이 작업은 MRC (MR / L019523 / 1), Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i]와 아이작 뉴턴 트러스트 보조금 19.23 (n). C.C.는 MRC DTP 학생회와 Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금. H.W.는 MRC DTP Studentship의 지원을 받았습니다. H.P.는 Wellcome Trust PhD 보조금 (105391 / Z / 14 / Z)과 Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금과 MRC (MR / L019523 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A.
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
