Summary
Aqui descrevemos protocolos para realizar imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor quimioattractant em neutófilos de zebrafish
Abstract
A orientação de leucócitos por gradientes químicos é essencial para respostas imunes. Os neutrófilos são as primeiras células a serem recrutadas para locais de danos teciduais onde executam funções antimicrobianas cruciais. Seu tráfico para esses loci é orquestrado por vários quimioattractants inflamatórios, incluindo quimiocinas. No nível molecular, a sinalização de quimioattractant é regulada pelo tráfico intracelular dos receptores correspondentes. No entanto, ainda não está claro como as mudanças subcelulares nos receptores de quimiocina afetam a dinâmica de migração de leucócitos no nível celular e tecidual. Aqui descrevemos uma metodologia para imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante respostas inflamatórias a danos teciduais. Essas ferramentas revelaram que o tráfico diferencial de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish coordena o agrupamento e dispersão de neutrófilos em locais de danos teciduais. Isso tem implicações para nossa compreensão de como as respostas inflamatórias são auto-resolvidas. As ferramentas descritas poderiam ser usadas para entender padrões de migração de neutrófilos em uma variedade de ambientes fisiológicos e patológicos e a metodologia poderia ser expandida para outros receptores de sinalização.
Introduction
A migração de leucócitos é de suma importância para as respostas imunológicas. As células imunes são células migratórias prototípicas, que são notavelmente capazes de atravessar tecidos e vasos sanguíneos e sentir uma série de sinais de orientação química para migrar direcionalmente em direção a micróbios ou outras células hospedeiras de importância. A orientação correta baseia-se no reconhecimento de quimioattractants, entre os quais as quimiocinas representam a categoria1 mais proeminente. As quimiocinas são reconhecidas por receptores acoplados altamente específicos de sete transmembranos G. Após a ligação de quimiocina, os receptores de quimioterapia mudam a conformação levando à ativação de proteínas G trimeric associadas e sua dissociação em subunidades de sinalização funcional que promovem alterações citoesqueléticas e migração direcionada1. Em segundo lugar, os receptores de quimioterapia são fosforilados, e essa modificação leva à dessensibilização ao atrativo, que pode ser seguida por rápida resensibilidade/reciclagem ou degradação intracelular e baixa regulação da superfície celular2. Essas dinâmicas receptoras influenciam a duração e a dose de sinalização recebida pelas células, mas como elas afetam o comportamento de migração de leucócitos tem sido difícil de elucidar in vivo.
O rastreamento da dinâmica dos receptores em leucócitos vivos em sistemas tradicionais de mamíferos enfrenta vários desafios. Para estudos vivos, fusões receptoras com proteínas fluorescentes devem ser expressas nas células. Isso é desafiador em leucócitos primários, particularmente em neutrófilos, e estudos até agora têm usado linhas de células neutrófilas substitutas para expressar receptoresde quimioterapia 3,4. A geração de modelos de camundongos transgênicos, nos quais os leucócitos expressam um receptor fluorescente ou receptores mutantes com defeitos informativos de tráfico 5,6, implica um investimento considerável de tempo e recursos. Mesmo nesses casos, a resolução de imagens e o contraste para a dinâmica do receptor de imagem no animal vivo podem ser limitados e estudos têm usado imunohistoquímica nas seções de tecido fixo5. Dado esses desafios técnicos, nossa compreensão de como a dinâmica dos receptores quimioattractant afeta o comportamento celular em um ambiente de tecido vivo é atualmente limitada.
Aqui fornecemos uma metodologia para monitorar o tráfico de receptores em neutrófilos de zebrafish. Os zebrafish são geneticamente tratáveis, como ratos, mas a transgênese é relativamente mais simples através do uso de sistemas transposon eficientes e manipulação direta de zigoto7. A larva transparente é idealmente agradável à imagem. A dinâmica do receptor de quimiocina foi visualizada em células germinativas primordiais e a linha lateral primordium por expressão de fusões correspondentes com repórteres fluorescentes 8,9,10. As larvas de zebrafish são equipadas com neutrófilos maduros que têm propriedades genéticas e celulares altamente conservadas em relação aos neutrófilos mamíferos. Dinâmicas de sinalização subcelular, como a dinâmica citoesqueléllica e os reguladores de polaridade foram visualizadas nessas células pela geração das linhas transgênicas correspondentes 11,12,13. Recentemente, visualizamos e analisamos funcionalmente a dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante o curso de respostas inflamatórias a danos teciduais14. Aqui, descrevemos a geração de linhas de repórteres transgênicos para sinalização de quimiocina em neutrófilos, preparação de embriões para imagens vivas, um ensaio de ferida para estudar sinalização de neutrófilo e o protocolo para aquisição e análise de imagens. Também fornecemos um protocolo lateral para testar as respostas do receptor de quimiocina aos ligantes candidatos, o que é útil ao tentar estabelecer padrões de reconhecimento de ligantes em receptores não característicos. Essas técnicas podem ser usadas em combinação com outras manipulações genéticas, como a inibição da expressão endógena da quimiocina ou geração de receptores mutantes com tráfico induzido por ligantes alterados, para questionar como a dinâmica de sinalização específica afeta o comportamento leucócito in vivo. As linhas transgênicas que expressam receptores de quimioterapia fluorescentes também podem ser usadas como repórteres para gradientes endógenos de quimioterapia, que são difíceis de detectar por manchas diretas de anticorpos. A metodologia descrita fornece espaço para a expansão da geração de repórteres para outros receptores de imuno-sinalização.
Protocol
NOTA: Todos os zebrafish foram mantidos de acordo com as diretrizes da ARRIVE e regulamentos do Ministério do Interior do Reino Unido, Uk Animals (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Geração de larvas de zebrafish repórter transgênico para o tráfico de receptores de imagem em leucócitos
- Gerar construção baseada em Tol2 para expressão específica do tecido do receptor fluorescente marcado de interesse. Para neutrófilos, use sequências de promotores do gene lysozyme C15 e mieloperoxidase16. A construção pode ser projetada como uma fusão com uma única proteína fluorescente (por exemplo, GFP), um temporizador fluorescente tandem (por exemplo, um GFP dobrável rápido e um amadurecimento mais lento tagRFP 8,14,17) ou uma expressão bicistronic do repórter GFP e um marcador de membrana de controle9 (ver Discussão para considerações ao escolher a abordagem).
NOTA: Este construto não recapitula níveis endógenos de expressão receptora, mas é útil para obter alto nível de expressão receptora no tipo de interesse celular. Consulte a literatura sobre receptores similares 3,5,6,8,9,10,14 para decidir sobre a posição da tag fluorescente. - Montou um tanque contendo machos e fêmeas adultos do tipo selvagem seguindo as práticas padrão de criação18, separado por uma barreira no dia anterior à desova de ovos.
- No dia da desova de ovos, prepare a mistura de transgênese para microinjeção contendo 12,5 ng/μL de construção de DNA Tol2 e 17,5 ng/μL de transposase mRNA7. Levante barreiras de tanques de peixe logo após as luzes virem pela manhã (isso pode variar em diferentes instalações de peixes) e colete ovos dentro de 15 minutos para injeção de mRNA.
NOTA: Certifique-se de que a solução de DNA é livre de RNase para evitar a degradação do mRNA transposase na mistura. Uma opção para contornar isso é injetar ovos com soluções separadas de construção e transposição tol2. - Siga os protocolos padrão para transgênese e microinjeção de ovos de zebrafish19.
- Injete 1 nL da solução na célula de embriões de estágio unicelular.
NOTA: Os resultados da expressão são mais consistentes ao injetar dentro da célula e descartar as injeções que podem não estar claramente dentro da célula. Os embriões de estágio de uma célula são destinados devido à variabilidade da injeção de volume por célula ao injetar embriões de estágio celular de 2-16. Uma opção seria separar as injeções de estágio de uma célula de lotes de injeções posteriores, caso tenham diferentes eficácias. - Verifique os embriões injetados no final do dia e remova ovos não fertilizados ou mortos para manter a embreagem saudável.
- Aos 3 dias após a fertilização (dpf), larvas de tela sob um microscópio fluorescente. O marcador será visível em neutrófilos, particularmente no tecido hematopoiético caudal (CHT), que é rico nessas células.
NOTA: A porcentagem de células rotuladas varia com diferentes construções, mas geralmente 20-60% dos neutrófilos devem expressar a construção. Porcentagens mais baixas geralmente prevêem mais triagem na fase adulta. É uma boa prática também verificar a localização correta do receptor na membrana, com uma abordagem de imagem de maior resolução, em uma amostra desses embriões antes de cultivar o peixe. - Cresça larvas positivas seguindo as práticas padrão de criação20. Estes representam a geração F0.
- Aos 3 meses de idade, tela F0 peixe para fundadores. Cruze peixes individuais com um tipo selvagem não transgênico e trie seus descendentes a 3 dpf para a expressão do receptor, visualizando sob o escopo de dissecação. Dependendo do sucesso da transgênese, que varia de acordo com cada construção, observe uma porcentagem de descendentes positivos em um subconjunto das cruzes.
NOTA: Para uma boa transgênese, cerca de um terço a metade dos adultos darão descendentes positivos. A porcentagem de descendentes que é positiva em uma embreagem varia com o número de cópia de transgenes inseridos e, pode ser entre 10-60%. É útil acompanhar as relações mendelianas dentro das garras para identificar transgênicos de inserção única (estes são mais facilmente identificados em embreagens F2, procurando uma proporção de 50% de larvas positivas)20. - Cresça a prole positiva, que representa a geração F1.
- Aos 3 meses de idade, tela adultos de F1 da mesma forma para estabelecer linha transgênica F2 estável.
- Realize experimentos em larvas F2 após validar a expressão específica de neutrófilo do transgene.
NOTA: Durante a transgênese, pode-se observar diferentes níveis de expressão receptora e é aconselhável manter diferentes embreagens transgênicas para obter o nível de expressão mais adequado para as questões biológicas. Os resultados iniciais podem ser obtidos em larvas F0 ou F1.
2. Coleta de embriões de zebrafish para avaliar as respostas da ferida leucócito
- Depois de ter estabelecido uma linha de repórteres transgênicos estáveis, configure um cruzamento entre peixes transgênicos adultos e fêmeas e colete ovos na manhã seguinte.
- Cultivar embriões a 28,5 °C em E3 médio (ou água de ovo18).
- Opcionalmente, a 24 hpf, incubam embriões em um tubo de centrífuga contendo 50 mL de E3 médio suplementado com alvejante de 0,003% por 5 min. Posteriormente enxágue 3 vezes no meio E3, deixando o tubo descansar por alguns minutos para permitir que os embriões se instalem no fundo e, em seguida, decantar e substituir o meio.
NOTA: Isso fornece um nível de controle sobre a exposição à infecção das larvas, o que pode afetar o comportamento dos leucócitos durante o ferimento. - Após o branqueamento, mantenha os embriões no meio E3 suplementados com 0,003% de 1-fenil-2-thiourea para evitar a síntese de melanina. O azul de metileno, que muitas vezes é usado para prevenir infecções fúngicas, não é adicionado aqui, para minimizar a autofluorescência tecidual.
- Permita que as larvas eclodam naturalmente e usem a 3 dpf quando os neutrófilos forem abundantes21.
3. Ferimento da barbatana ventral de larvas
- Prepare larvas para ferimentos. Use larvas a 2,5-3,5 dpf, quando forem observados neutrófilos abundantes. Transfira larvas para o E3 médio suplementado com 160-200 mg/L tricaine MS222.
NOTA: As soluções concentradas de tricaine devem ser preparadas e congeladas com antecedência e descongeladas no dia. - Deixe as larvas no meio E3+tricaine por 15 minutos para garantir que elas sejam anestesiadas. Verifique suas respostas tocando suavemente com um pequeno pincel ou ferramenta semelhante.
- Selecione larvas com expressão de receptor transgênico sob um escopo de dissecação fluorescente.
- Transfira larvas para uma placa de Petri de 120 mm em E3 + tricaine para ferimentos. Utilizando um bisturi estéril corte a barbatana ventral da larva, observando sob o escopo de dissecação (Figura 1).
NOTA: A ideia é realizar um corte profundo o suficiente para causar um recrutamento substancial de neutrófilos, mas sem cortar os vasos do CHT. O corte é feito perpendicular ao eixo CHT de tal forma que a incisão quase atinge os vasos do CHT. Isso requer alguma prática e deve primeiro ser realizado com supervisão de larvas que não são geradas para este fim (por exemplo, larvas em excesso de outro experimento).
4. Preparação de larvas para imagens vivas
- Dissolver o ponto de fusão baixo (LMP) surgiu no meio E3 por aquecimento para obter uma solução líquida de 2% de agarose.
- Deixe esta solução esfriar até 60 °C.
NOTA: Mantenha um frasco ou tubo com agarose em uma incubadora a 60 °C para evitar o ajuste de agarose entre a montagem de diferentes larvas. - Pipeta 0,5 mL do líquido LMP + E3 em uma placa de fundo de vidro para imagens de microscopia.
- Pipeta uma larva de zebrafish anestesiada ferida, juntamente com 0,5 mL de E3 + 2x Tricaine no prato de fundo de vidro.
- Misture suavemente as duas soluções para obter uma solução LMP/1x Tricaine agarose/E3 de 1%, evitando a geração de bolhas. Oriente o embrião lateralmente e suavemente empurre para baixo para que a parte caudal do peixe esteja o mais perto possível do vidro.
NOTA: O tecido a ser imageado deve estar o mais próximo possível do fundo de vidro ao fotografar com um microscópio invertido. O ajuste de orientação para a larva deve ser rápido para que a agarose não se ajuste antes que a larva seja posicionada. - Deixe a solução agarose esfriar e solidificar por 5-10 min. Teste se a agarose é definida tocando suavemente o gel de agarose com um pequeno pincel ou ponta.
- Uma vez que a agarose esteja sólida, adicione 2 mL de E3 complementado com 0,2 mg/mL de tricaine à placa de imagem.
5. Imagem confocal ao vivo
NOTA: Embriões de imagem em um microscópio confocal de disco giratório ou equivalente (Figura 2). Um microscópio de varredura a laser também pode ser usado, mas a resolução temporal da dinâmica será mais limitante. Prepare as configurações de imagem antes de trazer a larva ferida, para que a resposta possa ser imagen o mais rápido possível após o ferimento. Neutrófilos chegam à ferida dentro de 5 minutos e receptores nas primeiras células que chegam podem internalizar dentro deste período de tempo. Com a prática é possível imaginar até 15 minutos após o ferimento.
- Ligue o microscópio: laser, câmera e computador conforme as instruções do fabricante.
- Use software de aquisição para configurar as configurações de imagem. Escolha lasers para os fluoroforos apropriados e tempos de exposição aproximados com base em experimentos anteriores (adquira GFP com 488 nm e tagRFP com laser de 561 nm).
- Transfira a placa com o embrião montado, o mais rápido possível após os conjuntos de agarose, para a plataforma de disco de imagem confocal.
- Use a peça ocular do microscópio para encontrar o peixe no prato usando o joystick do palco.
- Concentre-se na área da ferida, usando o botão de focalizar.
NOTA: Para encontrar a área de interesse pode ser mais fácil usar um objetivo de ar de baixa ampliação (10x). - Selecione o campo para a imagem ao redor da ferida. Use um objetivo de 30x/40x com alta abertura numérica para obter resolução suficiente.
- Use os botões de software para ajustar o tempo de exposição para que o marcador fluorescente possa ser visto com bom contraste, mas sem saturar o sinal.
NOTA: O tempo de exposição deve ser o mais baixo possível para minimizar a exposição fluorescente e maximizar a resolução temporal no lapso de tempo. A potência do laser depende da condição do laser, mas precisa ser ajustada a um nível que permita baixo tempo de exposição suficiente para imagens dinâmicas. - Use os botões de software para selecionar o volume para a imagem como uma pilha de z
- Configure um lapso de tempo a cada 30 s para a duração desejada.
NOTA: Para feridas estéreis da barbatana ventral, o recrutamento máximo é observado por 2-3 h. - Antes de iniciar o lapso de tempo, faça um instantâneo de campo brilhante para documentar o campo de visão. Se possível, adquira um campo brilhante dentro do filme time-lapse.
6. Quantificação da internalização do receptor em neutrófilos de zebrafish
- Regisso intervalo de tempo de aquisição de imagem e o tamanho do pixel da imagem. Mantenha um registro de quantos minutos após o ferimento a imagem começou.
- Abra os conjuntos de dados de imagem usando Fiji arrastando a imagem para a interface de software, selecione um quadro representativo de interesse para cada conjunto de dados usando o controle deslizante de tempo, por exemplo, a 1-1,5 h após o ferimento e salve-o.
- Proceda com o MATLAB para processar o conjunto de dados de imagem.
- Crie um novo script e inclua funções para leitura de imagem (linha 6 no script chamado 'select_neutrophils.m' para definição centralizada no Arquivo Suplementar 1), abertura (linha 11 em Arquivo Suplementar 1) e seleção manual de pontos na imagem (linha 12 no Arquivo Suplementar 1).
- Abra o quadro de interesse executando este script (arquivo suplementar 1), identifique os neutrófilos para analisar por inspeção visual, clique neles e regise uma estimativa de seus centroides, tanto na ferida da barbatana ventral quanto na CHT.
NOTA: Os neutrófilos não mobilizados no CHT servem como referência interna para neutrófilos cuja distribuição de receptores permanece constante. Isso permite a normalização dos valores de contraste das células na ferida a uma referência interna. - Proceder com a segmentação dos neutrófilos em cada quadro utilizando a técnica de contornos ativos22 , conforme descrito nas etapas abaixo.
- Crie uma função para incluir os metadados necessários para segmentação por contornos ativos (ou seja, número de iterações, viés de contorno, centroide estimado etc.) 22 (ver 'dados de feridas.m' no Arquivo Complementar 2).
- Crie um script que chame a função de 'wound_data.m' para inserir as informações necessárias para segmentação de cada neutrófilo (linha 28 no script chamado 'calc_contrast.m' no Arquivo Suplementar 3).
- Inclua nos comandos de script para leitura de imagem (linha 32 no Arquivo Complementar 3).
- Adicione a geração de uma imagem preta (ou seja, imagem onde os valores dos pixels são zeros) com um tamanho igual à imagem de entrada (linha 44 em Arquivo Suplementar 3) e a definição de um quadrado de 10 × 10 pixels ao redor do centroide de cada neutrófilo (linha 45 em Arquivo Suplementar 3).
- Inclua a segmentação de neutrófilos utilizando contornos ativos (linhas 48-49 no arquivo complementar 3) e a remoção de pequenos objetos falsos detectados (linha 52 em Arquivo Suplementar 3).
NOTA: O contorno de segmentação inicial é o quadrado ao redor do centroide, que evolui pela técnica de contorno ativo baseada nas intensidades dos pixels, no número de iterações e no viés do contorno. O resultado da segmentação é uma máscara binária onde todos os pixels têm valor 0 além da área de neutrófilo cujos pixels têm valor 1. - Inclua a multiplicação da imagem binária segmentada com a original para obter apenas as intensidades de pixel do neutrófilo, com o resto da imagem não sendo um número, de modo que não contribua para cálculos (linhas 56-57 em Arquivo Suplementar 3).
- Adicione o cálculo da matriz de co-ocorrência de nível cinza para cada neutrófilo (GLCM)14,23 (linha 61 em Arquivo Suplementar 3). GLCM é outra representação da imagem mostrando posição relativa dos pixels em termos de intensidade de pixel.
- Inclua o cálculo do contraste do neutrófilo com base no GLCM (linhas 62,65 em Arquivo Suplementar 3). A métrica de contraste mede diferenças de intensidade entre pixels vizinhos. Os pixels são comparados com pixels de certa distância, que podem ser ajustados empiricamente com base no tamanho dos picos locais em intensidade. Como indicação, para as imagens, com um tamanho de pixel de 0,389 μm, quando o receptor mostrou distribuição vesicular cada ponto brilhante estava na faixa de 5 pixels. Portanto, as intensidades foram comparadas em pixels espaçados 5 pixels separados.
- Adicione comandos para salvar os valores separadamente para neutrófilos individuais na barbatana ventral (linha 68 em Arquivo Suplementar 3).
- Inclua o cálculo do valor médio de contraste de neutrófilos de todos os neutrófilos cht da mesma forma que para neutrófilos na ferida (linhas 72-119 no arquivo complementar 3). Para neutrófilos cht, chame a função de 'cht_data.m' (linha 77 em Arquivo Suplementar 4).
- Inclua a normalização do valor de contraste dos neutrófilos individuais na ferida ao contraste médio dos neutrófilos cht calculado acima na etapa 6.16 (ou seja, divisão) (linha 122 em Arquivo Suplementar 3). Isso dá um contraste normalizado que reflete o quão "dotty" o aparecimento do receptor está em células de resposta individuais em relação ao controle de células não-respondendo (Figura 3 e Figura 4).
- Execute o script (Arquivo Suplementar 3) clicando no símbolo de execução no software.
- Repita todos os passos para diferentes condições.
- Use software estatístico (ver Tabela de Materiais) para importar os resultados para as diferentes condições, criando uma tabela de colunas, traçar os resultados e realizar teste estatístico para verificar a significância da diferença entre os valores médios.
NOTA: Os códigos para a análise também podem ser encontrados no GitHub em https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. Ensaios de resposta de quimiocina em embriões precoces
NOTA: Este é um experimento paralelo opcional que permite o teste de alterações de distribuição de receptores em resposta a uma quimiocina candidata e é independente dos experimentos descritos acima sobre a expressão de neutrófilo dos construtos receptores. As diferenças no tráfico induzido por ligante entre receptores são difíceis de estabelecer com essa técnica, pois os níveis de ligantes estão saturando14. No entanto, se alguém vê a internalização de ligante de um receptor neste sistema, isso pode ser uma indicação de que o ligante é reconhecido pelo receptor em casos em que a identidade ligante não é clara. Isso é útil, porque a expressão de receptores de quimioterapia em linhas celulares estabelecidas, como as células HEK293T14 , pode ser complicada.
- Configure uma cruz de peixes do tipo selvagem (por exemplo, AB) e colete ovos na manhã seguinte logo após levantar os separadores (como descrito acima).
- Injete 100 pg de mRNA receptor fluorescente (por exemplo, Cxcr1-FT), juntamente com 100 pg de mRNA para um marcador de membrana (por exemplo, cfp de membrana). Inclua na mistura doses variadas de mRNA para ligante de quimiocina.
NOTA: Como indicação 150 pg Cxcl8a mRNA deu uma interiorização proeminente do Cxcr1-FT fluorescente (ver Figura 5). - Enxágüe embriões com e3 médio e incubar a 28°C.
- A cerca de 7 hpf, teste a expressão do mRNA em um escopo de dissecação fluorescente e selecione os embriões para imagem.
- Prepare 0,8 % LMP agarose com antecedência e mantenha no tubo de vidro em um bloco de calor a 60 °C. Use uma pipeta de vidro para manipular os embriões. Embriões suavemente descorrionatos usando um par de fórceps em cada mão.
- Aspire um embrião descorioado individual com a pipeta de vidro garantindo que não haja bolhas na ponta. Solte suavemente o embrião no tubo de agarose permitindo que ele afunde no tubo.
- Aspire o embrião do tubo de agarose, coletando algum líquido agarose ao longo do caminho. Liberte suavemente o embrião no centro de um prato de imagem com fundo de vidro. Gire rapidamente o embrião para que o polo animal esteja voltado para o fundo do prato (este lado deve estar mais próximo do objetivo ao usar um microscópio invertido).
NOTA: Pode-se precisar reajustar a orientação dos embriões enquanto a agarose ainda está configurando. - Após a garose definida, complemente com 2 mL de meio E3.
NOTA: Os embriões nesta fase são muito frágeis em comparação com as larvas e é preciso alguma prática para deschorioar e montar. É importante aspirar e soltar o mais suavemente possível, para evitar a ruptura do embrião. - Repita o processo com o objetivo de carregar 3-5 embriões por prato.
- Embriões de imagem em um microscópio confocal invertido (ver Tabela de Materiais). Use um objetivo de óleo NA 40x/1.3 para obter uma resolução suficiente. Visualize mCFP, sfGFP e tagRFP com 405, 488 e 552 nm, respectivamente, no escopo. Ajuste filtros e configurações para ter alto contraste, evitando a saturação e minimize o vazamento entre os canais.
- Repita a montagem e a imagem para diferentes condições.
Representative Results
A ferida da barbatana ventral é seguida pela rápida mobilização de neutrófilos do CHT para a barbatana ventral e agrupamento na margem da ferida, dentro de 30-60 min (Figura 1). Visualizamos a distribuição de dois receptores de quimiocina, Cxcr1 e Cxcr2, que são expressos por neutrófilos de zebrafish24 e reconhecem Cxcl8a e Cxcl8b14, usando microscopia confocal de disco giratório. Geramos duas linhas transgênicas correspondentes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), nas quais os neutrófilos expressam uma construção do temporizador fluorescente (FT) do receptor, ou seja, uma fusão com um tandem de sfGFP e tagRFP (Figura 2 e referência14). O uso dos dois fluoroforos destinava-se a permitir o monitoramento de uma ampla gama de destinos receptores e fornecer estimativas de tempo de rotatividade de proteínas na membrana plasmática, já que receptores recém-sintetizados fluoresceriam em verde e progressivamente se tornariam vermelhos à medida que envelheciam 8,14 anos. No entanto, esses receptores apresentaram rápida rotatividade constitutiva na membrana plasmática de neutrófilo e que o tempo de residência foi menor do que o tempo de maturação do tagRFP, com sfGFP mostrando localização de membrana e tagRFP mostrando localização vesicular em estado estável (Vídeo Suplementar 1 e ref14). Por isso, focamos na distribuição do SFGFP para monitorar a internalização induzida por ligantes em locais de danos teciduais. O padrão de distribuição do receptor foi quantificado utilizando-se a métrica de contraste, que relata diferenças de intensidade entre pixels vizinhos. A lógica é que quando a distribuição do receptor é membranous e suave, o valor de contraste é baixo. Quando a distribuição do receptor é vesicular e mais pontual, então o valor de contraste é alto (Figura 3).
Um método alternativo é quantificar a razão dos níveis de receptor (intensidade sfGFP) sobre os níveis de um marcador de membrana de controle, por exemplo, membrana CFP (mCFP) (Figura 3). Ambos os métodos poderiam detectar a internalização do receptor, como indicado por um padrão de distribuição de receptores mais vesiculares globalmente na célula (maior valor de contraste) ou níveis de receptores mais baixos na membrana (menor razão sfGFP/mCFP). No entanto, a métrica de contraste também poderia detectar internalização do receptor em aglomerados de neutrófilos na ferida, em que a segmentação da membrana era menos precisa e não aplicável (Figura 3). Utilizando esta métrica, conseguimos quantificar diferenças visíveis entre o tráfico de Cxcr1 e Cxcr2 em neutrófilos em feridas (Figura 4 e Vídeo Suplementar 2). Cxcr1-FT internalizado em células localizadas na ferida, enquanto Cxcr2-FT permaneceu membranous em neutrófilos na ferida (Figura 4A-C, Vídeo Suplementar 2 e Vídeo Suplementar 3). A supressão de Cxcl8a e Cxcl8b, através do tratamento de morfolino, afetou diferencialmente a internalização Cxcr1-FT nas feridas (Figura 4C,D). Para validar ainda mais que o Cxcr1-FT responde ao Cxcl8a, realizamos ensaios de resposta de quimioterapia em embriões precoces. Descobrimos que cxcr1-FT foi significativamente internalizado em embriões nos quais Cxcl8a foi co-expresso (Figura 5). Ao todo, esses resultados indicam que os métodos descritos podem ser implantados para medir a internalização do receptor induzido pela quimiocina em neutrófilos e estabelecer a identidade do ligante mediando esses efeitos.
Figura 1: Migração de neutrófilo para feridas de barbatana ventral. (A) (Esquerda) Desenho de 3 larvas dpf mostrando a localização do tecido hematopoiético caudal (CHT), a circulação de vênus (VC, azul), a barbatana ventral (VF) e o local da ferida. (À direita) Desenho animado retratando a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados do CHT e agrupando-se na ferida. O plexo da veia caudal (CVP) do tecido CHT é desenhado em azul. (B) Imagem de campo brilhante (esquerda) e projeção confocal (direita) mostrando a ferida da barbatana ventral e a distribuição de neutrófilos em larvas Tg (mpx:GFP) a 2 h após o ferimento. As linhas tracejadas mostram contornos VF e CHT. Barra de escala = 25 μm. Desenho animado e imagem fluorescente modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia em neutrófilos. (A) Construções utilizadas para expressão transgênica específica de neutrófilo de Cxcr1-FT (Temporizador Fluorescente) e Cxcr2-FT. Projeções confocal de neutrófilos na cabeça de uma larva transgênica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), topo; Tg(lyz:Cxcr2-FT), inferior) mostrando canais tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatômico de 3 dpf larva como na Figura 1A. Abaixo da larva estão esquemas que retratam a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados a partir do CHT (topo) ou realizando quimitaxis ao entrar na barbatana ventral (inferior). O quadrado tracejado indica área imagem em instantâneos à direita. (C) Nêutrons em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP) após a mobilização do CHT (painéis superiores) ou quimiotaxis em direção à ferida (painéis inferiores). As flechas mostram as mesmas células ao longo do tempo. Os pontos de tempo na imagem direita são minutos decorridos após a imagem à esquerda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representação esquemática da abordagem experimental para imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia. Painéis A-C modificados a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos de quantificação da dinâmica dos receptores. Neutrófilos únicos (azuis) ou agrupados (verdes) em feridas ou neutrófilos não mobilizados na CHT (vermelho, laranja) foram segmentados e analisados por diferentes métodos para comparar resultados. As mesmas células de exemplo mostradas foram analisadas com dois métodos para relacionar o que é visto na imagem com a gama de valores extraídos. (A) A superfície das células selecionadas, exemplo, foi segmentada com base na definição de contorno no canal sfGFP. (B) O contraste foi computado a partir das células de exemplo mostradas em A. (C) A membrana das células selecionadas, exemplo, foram segmentadas com base na definição de contorno no canal CFP. Análise ratiométrica do sfGFP/CFP seguido. (D) A razão de sfGFP/CFP foi calculada nas células de exemplo mostradas em C. As barras de erro representam S.E.M. de células individuais, em casos de n>1, valores aqui não foram utilizados para análise estatística, mas apenas para exemplificar medições obtidas com os diferentes métodos de quantificação. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dinâmica diferencial de Cxcr1 e Cxcr2 em resposta ao ferimento. (A) Projeção confocal de neutrófilos em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) ou Tg (lyz:Cxcr2-FT) na ferida a 80 min pós-ferida (canal sfGFP mostrado). Barra de escala = 10 μm. (B) Neutrófilo Cxcr1-FT ampliado (esquerda) e Cxcr2-FT (direita) na ferida. Receptor verde é mostrado em cinza. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado ao contraste médio de células não mobilizadas no CHT). cxcl8a refere-se à injeção de um bloqueio de emendas juntamente com um morfolino bloqueador de tradução para cxcl8a. cxcl8b refere-se à injeção com um morfolino bloqueador de emendas para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (ferida) de 8 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr1-FT) com morfolnos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) e n=20 células (ferida) de 3 larvas. Os dados foram agrupados de larvas independentes adquiridas em 1-5 sessões de imagem. Teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparações múltiplas de Dunn para Tg (lyz:Cxcr1-FT), teste mann-whitney não pago de duas caudas para Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) Projeção confocal de neutrófilos em Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvas transgênicas tratadas com cxcl8a morpholino (MO) (esquerda) e cxcl8b MO (direita) respondendo a feridas de barbatana (canal sfGFP mostrado em verde). Instantâneo tirada em pontos de tempo de acúmulo de neutrófilo equivalente (85 min pós-ferimentos na imagem esquerda e 45 minutos pós-ferimentos na imagem direita). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ensaio de resposta de quimiocina em embriões primitivos. Fatias confocal de escaneamento a laser de embriões gastrulating mostrando expressão e distribuição de Cxcr1-FT. 100 pg de Cxcr1-FT mRNA foram injetadas em um estágio celular com ou sem 150 pg Cxcl8a mRNA. Receptores verdes e vermelhos são mostrados em canais separados. O marcador CFP da membrana de controle (mCFP) é mostrado no canal ciano. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme suplementar 1: Neutrófilos transgênicos na cabeça de uma larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (direita) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para baixar este vídeo.
Filme suplementar 2: Neutrófilos em Tg (lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg (lyz:Cxcr2-FT) (direita) larvas transgênicas respondendo a feridas na barbatana. O filme começa dentro de 10 min pós-ferida e dura 60 min. sfGFP (verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 10 fps. CHT = tecido hematopoiético caudal. VF = barbatana ventral. Barra de escala = 25 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para baixar este vídeo.
Filme suplementar 3. Exemplos adicionais de neutrófilos de uma larva transgênica Tg(lyz:Cxcr1-FT) ferida (larva diferente da mostrada no Vídeo 2), adquirida em maior resolução, mostrando internalização receptora (canal sfGFP mostrado em verde) após mobilização no CHT ou na entrada e quimipeso na barbatana ventral. O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para baixar este vídeo.
Arquivo complementar 1: Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2: Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 3: Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 4: Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
O método descrito permite imagens vivas da dinâmica do receptor em resposta a ligantes endógenos in situ durante uma resposta inflamatória a danos teciduais. O uso de repórteres de neutrófilo Cxcr1/Cxcr2 poderia ser expandido para outras configurações fisiológicas, como infecção, modelos tumorais ou outros tipos de danos teciduais 14,25,26,27. Além disso, linhas de resgate transgênicas, nas quais o receptor endógeno é suprimido e resgatado por um receptor mutante exógeno, poderiam fornecer ferramentas úteis para dissecar a importância de padrões específicos de migração de neutrófilos em respostas imunes. Por exemplo, mutantes receptores Cxcr1 que prejudicaram a dessensibilização causam agrupamento de neutrófilos mais proeminentes em locais inflamatórios14. Esse ganho de fenotipo de função poderia ser usado para entender o papel da congregação de neutrófilos em diferentes processos fisiológicos, por exemplo, reparação de feridas, doença infecciosa ou evolução tumoral, e complementar experimentos receptores knockdown/knockout. A metodologia também fornece uma base para expandir o leque de repórteres disponíveis. A escolha do repórter fluorescente é importante de se considerar e depende da questão biológica. Descobrimos que a rotatividade constitutiva desses receptores de quimioterapia em neutrófilos foi alta, em comparação com as células epiteliais, e que repórteres com maturação rápida (por exemplo, sfGFP) foram obrigados a relatar níveis de membrana em estado estável e resolver diferenças sobre a estimulação de neutrófilos 8,14. Assim, as relações de membrana de sfGFP/tagRFP não são aplicáveis para medir a internalização induzida por ligante neste tipo de célula, mas o padrão de tagRFP permite o rastreamento dos destinos intracelulares do receptor, o que poderia ser útil em alguns estudos. Também descobrimos que o sinal intracelular mais concentrado do tagRFP é útil para a triagem de larvas individuais. Uma abordagem alternativa para medir os níveis de receptor na membrana plasmática seria co-expressar um marcador de membrana fluorescente em neutrófilos no mesmo transgene9 ou em um transgeneindependente 14. No cenário anterior, o transgene forneceria um meio adicional para a triagem dos níveis de peixe e expressão seria comparável entre o marcador e o receptor. Esta última abordagem seria mais modular, na qual uma linha de zebrafish com um repórter receptor poderia ser combinada com diferentes linhas de repórteres. Em ambos os casos, vale a pena notar que a quantificação da membrana dos níveis do receptor é desafiadora em neutrófilos agrupados (veja abaixo). Por fim, observa-se que uma possível extensão deste protocolo seria acompanhar a imagem ao vivo pela imunohistoquímica para análises de localização mais detalhadas.
O sistema de transgênese Tol2 é bem estabelecido7 e o promotor de lysozyme C tem sido amplamente utilizado para a expressão de neutrófilo11,15. A abordagem transgênese é, portanto, relativamente simples e o nível de expressão alcançado com este promotor é alto o suficiente para fornecer contraste suficiente para a análise da dinâmica dos receptores. Uma possível limitação é que o nível de expressão não recapitula os níveis de expressão do receptor endógeno. Novas tecnologias CRISPR poderiam ser implantadas para estabelecer linhas de impacto para receptores de interesse particular28. Essas tecnologias ainda são complicadas e podem não garantir os níveis de expressão necessários para imagens subcelulares, mas seu desenvolvimento bem-sucedido seria um importante avanço para a compreensão da dinâmica de sinalização endógena. As validações funcionais são importantes para a interpretação de dados com construtos de receptores transgênicos. Por exemplo, ensaios de reconhecimento de ligantes podem ser usados para estabelecer que a proteína de fusão fluorescente é funcional e o resgate de fenótipos eliminatórios poderia ser usado para estabelecer que os níveis de expressão transgênica de neutrófilos são compatíveis com a funcionalidade14. Finalmente, uma maneira mais direta de validar a fusão receptora seria utilizar um ensaio funcional in vitro com receptor rotulado ao lado das versões não rotuladas14.
A abordagem de quantificação aborda dificuldades específicas na segmentação precisa da membrana em neutrófilos in vivo. Em células de natureza epitelial, a quantificação dos níveis dos receptores pode ser executada automaticamente pela normalização dos níveis do receptor de membrana para um marcador de controle, que pode ser expresso em conjunto ou separadamente9. De fato, aplicamos tal abordagem, ao usar o ensaio de reconhecimento de ligantes em embriões gasetruidores14. No entanto, os neutrófilos sofrem mudanças complexas e rápidas na forma celular in vivo, dificultando a segmentação da membrana tanto em 2D quanto em 3D14. Isso é ainda mais desafiador quando os neutrófilos se aglomeram, o que ocorre em muitas configurações fisiológicas29. A métrica de contraste supera essa limitação, pois não requer segmentação de membrana, mas reflete o estado geral de distribuição de receptores na célula (membranous/suave vs vesicular/dotty). É importante notar que a métrica de contraste pode ser afetada pelo contraste geral da imagem, de modo que a normalização dos valores celulares individuais a uma referência interna é necessária para explicar a variabilidade do sinal em diferentes embriões/amostras. Por exemplo, utilizamos o valor médio de contraste celular de neutrófilos não responsivos no CHT (ou seja, neutrófilos que permanecem estacionários e não migram para a barbatana ventral)14. Uma possibilidade adicional seria normalizar com valores de contraste de um marcador de controle na mesma célula. Isso forneceria uma solução quando uma referência interna de células não-respondendo não estiver disponível e provavelmente resolveria diferenças quantitativas mais finas na dinâmica do receptor entre diferentes condições.
A localização da imagem é outra variável a considerar. A razão para escolher a ferida da barbatana ventral aqui, ao contrário da ferida da barbatana traseira mais usada modelo16,30, é porque o local do ferimento está próximo ao local de residência neutrófila/origem migratória. Isso acelera a linha do tempo do ensaio, pois leva relativamente pouco tempo para os neutrófilos chegarem. Além disso, oferece a oportunidade de capturar o comportamento celular tanto na origem migratória (CHT) quanto no local de destino do interesse (ferida). Isso é relevante aqui, pois a resolução espacial e temporal necessária para imagens subcelulares é difícil de combinar com um grande campo de visão ou varredura multi-posição. Assim, o ensaio da ferida da barbatana ventral permite o acompanhamento da evolução da resposta migratória da origem migratória e a captura simultânea de flutuações de receptores inespecíficos em células que não respondem. Como mencionado acima, este último é útil para fins de quantificação, pois fornece uma referência interna para dinâmicas inespecíficas. Em outros sistemas, pode não ser possível ter tal referência interna, nesse caso os valores de contraste de um marcador de membrana co-expresso forneceriam um controle alternativo.
Em resumo, prevemos que a metodologia é aplicável a outros sistemas e pode ser implantada para uma variedade de propósitos. Por exemplo, os mesmos repórteres poderiam ser utilizados em outros ambientes inflamatórios, como configurações de infecção ou outros modelos de doenças. O repertório de linhas de repórteres receptores de zebrafish poderia ser expandido para outros receptores de sinalização, para entender mecanismos de sinalização ou relatar a dinâmica de ligantes in vivo. A abordagem pode ser combinada com técnicas de knockdown/nocaute para interrogar a base mecanicista da dinâmica observada. Por exemplo, a perturbação da expressão de ligantes pode indicar a dependência de ligantes para a dinâmica do receptor observado. No futuro, prevemos que o sistema poderia ser refinado para incorporar a inserção de repórteres. Em última análise, os achados que utilizam essa metodologia forneceriam novas percepções valiosas para além da comunidade de zebrafish, dada a conservação desses receptores de sinalização em mamíferos e o desafio relativo de realizar esses estudos em organismos maiores.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses
Acknowledgments
Agradecemos a Christine Holt e Bill Harris por ajuda com microscopia confocal. Agradecemos a Darren Gilmour pelas construções de espinha dorsal fluorescente e Anna Huttenlocher pelo vetor tol2-lyz backbone. Agradecemos a Steve Renshaw pela linha Tg(mpx:GFP)i114 . Este trabalho foi apoiado pelo MRC (MR/L019523/1), pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e um Isaac Newton Trust concedem 19.23(n). C.C. foi apoiado por uma estudante mrc DTP e em parte pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] concessão. H.W. foi apoiado por uma MrC DTP Studentship. A H.P. foi apoiada por uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) e em parte por um Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] grant e o MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A.
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
