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Immunology and Infection

घाव प्रतिक्रियाओं के दौरान ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल में केमोकाइन रिसेप्टर्स की लाइव इमेजिंग

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61679
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम जेब्राफ़िश न्यूट्रोफिल में chemoattractant रिसेप्टर गतिशीलता के लाइव इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं

Abstract

रासायनिक gradients द्वारा ल्यूकोसाइट मार्गदर्शन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक है। न्यूट्रोफिल पहली कोशिकाएं हैं जिन्हें ऊतक क्षति की साइटों पर भर्ती किया जाता है जहां वे महत्वपूर्ण रोगाणुरोधी कार्यों को निष्पादित करते हैं। इन लोकी के लिए उनकी तस्करी कई भड़काऊ chemoattractants, केमोकिन्स सहित द्वारा orchestrated है। आणविक स्तर पर, chemoattractant सिग्नलिंग संबंधित रिसेप्टर्स के इंट्रासेल्युलर तस्करी द्वारा विनियमित किया जाता है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि केमोकाइन रिसेप्टर्स में उपकोशिकीय परिवर्तन सेल और ऊतक स्तर पर ल्यूकोसाइट माइग्रेशन गतिशीलता को कैसे प्रभावित करते हैं। यहां हम ऊतक क्षति के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान न्यूट्रोफिल में केमोकाइन रिसेप्टर गतिशीलता के लाइव इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। इन उपकरणों से पता चला है कि ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल में विभेदक केमोकाइन रिसेप्टर तस्करी ऊतक क्षति के स्थलों पर न्यूट्रोफिल क्लस्टरिंग और फैलाव का समन्वय करती है। यह हमारी समझ के लिए निहितार्थ है कि कैसे भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को आत्म-हल किया जाता है। वर्णित उपकरणों का उपयोग विभिन्न प्रकार की शारीरिक और पैथोलॉजिकल सेटिंग्स में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन पैटर्न को समझने के लिए किया जा सकता है और कार्यप्रणाली को अन्य सिग्नलिंग रिसेप्टर्स तक बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

ल्यूकोसाइट माइग्रेशन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए सर्वोपरि महत्व का है। प्रतिरक्षा कोशिकाएं प्रोटोटाइपिक प्रवासी कोशिकाएं हैं, जो ऊतकों और रक्त वाहिकाओं को पार करने में उल्लेखनीय रूप से सक्षम हैं और सूक्ष्मजीवों या महत्व के अन्य मेजबान कोशिकाओं की ओर दिशात्मक रूप से स्थानांतरित करने के लिए रासायनिक मार्गदर्शन संकेतों की एक श्रृंखला को संवेदी करती हैं। सही मार्गदर्शन chemoattractants की मान्यता पर निर्भर करता है, जिनमें से केमोकिन्स सबसे प्रमुख श्रेणी1 का प्रतिनिधित्व करते हैं। केमोकाइन्स को अत्यधिक विशिष्ट सात-ट्रांसमेम्ब्रेन जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जाता है। केमोकाइन बाइंडिंग पर, केमोकाइन रिसेप्टर्स संरचना को बदलते हैं जिससे संबंधित ट्राइमेरिक जी प्रोटीन के सक्रियण और कार्यात्मक सिग्नलिंग सबयूनिट्स में उनके पृथक्करण होते हैं जो साइटोस्केलेटल परिवर्तनों को बढ़ावा देते हैं और माइग्रेशन1 को निर्देशित करते हैं। दूसरे, केमोकाइन रिसेप्टर्स फॉस्फोराइलेटेड होते हैं, और यह संशोधन आकर्षित करने के लिए असंवेदनशीलता की ओर जाता है, जिसके बाद तेजी से पुन: संवेदीकरण / रीसाइक्लिंग या इंट्रासेल्युलर गिरावट और सेल सतह2 से नीचे-विनियमन किया जा सकता है। ये रिसेप्टर गतिशीलता कोशिकाओं द्वारा प्राप्त सिग्नलिंग की अवधि और खुराक को प्रभावित करती है, लेकिन वे ल्यूकोसाइट माइग्रेशन व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं, विवो में स्पष्ट करना मुश्किल है।

पारंपरिक स्तनधारी प्रणालियों में लाइव ल्यूकोसाइट्स में रिसेप्टर गतिशीलता को ट्रैक करना कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। लाइव अध्ययन के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ रिसेप्टर संलयन को कोशिकाओं में व्यक्त किया जाना चाहिए। यह प्राथमिक ल्यूकोसाइट्स में चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल में, और अब तक के अध्ययनों ने केमोकाइन रिसेप्टर्स 3,4 को व्यक्त करने के लिए सरोगेट न्यूट्रोफिल सेल लाइनों का उपयोग किया है। ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की पीढ़ी, जिसमें ल्यूकोसाइट्स सूचनात्मक तस्करीदोषों 5,6 के साथ एक फ्लोरोसेंट रिसेप्टर या उत्परिवर्ती रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं, समय और संसाधनों के काफी निवेश पर जोर देता है। यहां तक कि इन उदाहरणों में, जीवित जानवर में इमेजिंग रिसेप्टर गतिशीलता के लिए इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट सीमित हो सकता है और अध्ययनों ने निश्चित ऊतक अनुभागों5 पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग किया है। इन तकनीकी चुनौतियों को देखते हुए, कैसे chemoattractant रिसेप्टर्स गतिशीलता एक जीवित ऊतक सेटिंग में सेल व्यवहार को प्रभावित करने की हमारी समझ वर्तमान में सीमित है।

यहां हम ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल में रिसेप्टर तस्करी की निगरानी करने के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं। ज़ेबराफ़िश आनुवंशिक रूप से असभ्य हैं, चूहों की तरह, लेकिन ट्रांसजेनेसिस कुशल ट्रांसपोसन सिस्टम और प्रत्यक्ष युग्मनज हेरफेर7 के उपयोग के माध्यम से अपेक्षाकृत अधिक सीधा है। पारदर्शी लार्वा आदर्श रूप से इमेजिंग के लिए उपयुक्त है। केमोकाइन रिसेप्टर गतिशीलता को प्राथमिक रोगाणु कोशिकाओं और पार्श्व रेखा आदिम में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर 8,9,10 के साथ संबंधित संलयन की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना की गई है। ज़ेबराफ़िश लार्वा परिपक्व न्यूट्रोफिल से सुसज्जित होते हैं जिनमें स्तनधारी न्यूट्रोफिल के संबंध में अत्यधिक संरक्षित आनुवंशिक और सेलुलर गुण होते हैं। साइटोस्केलेटल गतिशीलता और ध्रुवीयता नियामकों जैसे उपकोशिकीय सिग्नलिंग गतिशीलता को इन कोशिकाओं में संबंधित ट्रांसजेनिक लाइनों11,12,13 की पीढ़ी द्वारा कल्पना की गई है। हाल ही में, हमने ऊतक क्षति14 के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान न्यूट्रोफिल में केमोकाइन रिसेप्टर गतिशीलता की कल्पना और कार्यात्मक रूप से विश्लेषण किया। यहां, हम न्यूट्रोफिल में केमोकाइन सिग्नलिंग के लिए ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों की पीढ़ी का वर्णन करते हैं, लाइव इमेजिंग के लिए भ्रूण की तैयारी, न्यूट्रोफिल सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक घाव परख और छवियों के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल। हम उम्मीदवार लिगेंड के लिए केमोकाइन रिसेप्टर प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए एक साइड-प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं, जो कि अज्ञात रिसेप्टर्स में लिगैंड मान्यता पैटर्न स्थापित करने की कोशिश करते समय उपयोगी होता है। इन तकनीकों का उपयोग आगे आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ संयोजन में किया जा सकता है, जैसे कि अंतर्जात केमोकाइन अभिव्यक्ति का निषेध या परिवर्तित लिगैंड-प्रेरित तस्करी के साथ उत्परिवर्ती रिसेप्टर्स की पीढ़ी, यह पूछताछ करने के लिए कि विशिष्ट सिग्नलिंग गतिशीलता विवो में ल्यूकोसाइट व्यवहार को कैसे प्रभावित करती है। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए केमोकाइन रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग अंतर्जात केमोकाइन ग्रेडिएंट के लिए रिपोर्टर के रूप में भी किया जा सकता है, जो अन्यथा प्रत्यक्ष एंटीबॉडी धुंधला द्वारा पता लगाना मुश्किल है। वर्णित पद्धति अन्य इम्यूनो-सिग्नलिंग रिसेप्टर्स के लिए पत्रकारों की पीढ़ी का विस्तार करने के लिए गुंजाइश प्रदान करती है।

Protocol

नोट: सभी ज़ेबराफ़िश को आगमन दिशानिर्देशों और यूके होम ऑफिस नियमों, यूके एनिमल्स (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) अधिनियम 1986 के अनुसार रखा गया था।

1. ल्यूकोसाइट्स में इमेजिंग रिसेप्टर तस्करी के लिए ट्रांसजेनिक रिपोर्टर ज़ेब्राफ़िश लार्वा की पीढ़ी

  1. ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए Tol2-आधारित निर्माण उत्पन्न करें ब्याज के फ्लोरोसेंटली टैग किए गए रिसेप्टर की। न्यूट्रोफिल के लिए, लाइसोजाइम सी15 और मायलोपेरोक्सीडेस जीन16 से प्रमोटर अनुक्रमों का उपयोग करें। निर्माण को एक एकल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे जीएफपी), एक अग्रानुक्रम फ्लोरोसेंट टाइमर (उदाहरण के लिए, एक तेजी से तह जीएफपी और धीमी परिपक्वता वाली टैगआरएफपी 8,14,17) या रिपोर्टर जीएफपी की एक बिसिस्ट्रोनिक अभिव्यक्ति और एक नियंत्रण झिल्ली मार्कर9 के साथ एक संलयन के रूप में डिज़ाइन किया जा सकता है (दृष्टिकोण चुनते समय विचारों के लिए चर्चा देखें)।
    नोट: यह निर्माण रिसेप्टर अभिव्यक्ति के अंतर्जात स्तरों को दोहराता नहीं है, लेकिन ब्याज के सेल प्रकार में रिसेप्टर अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए उपयोगी है। फ्लोरोसेंट टैग की स्थिति पर निर्णय लेने के लिए इसी तरह के रिसेप्टर्स 3,5,6,8,9,10,14 पर साहित्य से परामर्श करें।
  2. मानक पशुपालन प्रथाओं18 का पालन करते हुए जंगली प्रकार के वयस्क पुरुषों और महिलाओं वाले एक टैंक की स्थापना करें, जो अंडे के स्पॉनिंग से एक दिन पहले एक बाधा से अलग हो गया था।
  3. अंडे के स्पॉनिंग के दिन, टोल 2 डीएनए निर्माण के 12.5 एनजी / μL और ट्रांसपोसेजएमआरएनए 7 के 17.5 एनजी / μएल युक्त माइक्रोइंजेक्शन के लिए ट्रांसजेनेसिस मिश्रण तैयार करें। सुबह रोशनी आने के तुरंत बाद मछली के टैंकों से बाधाओं को उठाएं (यह विभिन्न मछली सुविधाओं में भिन्न हो सकता है) और एमआरएनए इंजेक्शन के लिए 15 मिनट के भीतर अंडे एकत्र करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि डीएनए समाधान मिश्रण में transposase mRNA के क्षरण से बचने के लिए RNase मुक्त है। इसे दरकिनार करने का एक विकल्प टॉल 2 निर्माण और ट्रांसपोसेज़ के अलग-अलग समाधानों के साथ अंडे को इंजेक्ट करना है।
  4. 19 जेब्राफ़िश अंडे के ट्रांसजेनेसिस और माइक्रोइंजेक्शन के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें।
  5. एक कोशिका चरण भ्रूण की कोशिका में समाधान के 1 nL इंजेक्ट करें।
    नोट:: अभिव्यक्ति परिणाम अधिक संगत होते हैं जब सेल के अंदर इंजेक्ट करते हैं और इंजेक्शन को छोड़ते हैं जो सेल के अंदर स्पष्ट रूप से नहीं हो सकते हैं। एक-सेल चरण भ्रूण का उद्देश्य 2-16 सेल चरण भ्रूण को इंजेक्ट करते समय प्रति सेल इंजेक्शन की मात्रा इंजेक्शन की परिवर्तनशीलता के कारण होता है। एक विकल्प बाद के इंजेक्शन के बैचों से एक-सेल चरण इंजेक्शन को अलग करना होगा, यदि इनमें अलग-अलग प्रभावोत्पादकताएं हैं।
  6. दिन में बाद में इंजेक्ट किए गए भ्रूण की जांच करें और क्लच को स्वस्थ रखने के लिए अनफर्टिलाइज्ड या मृत अंडे को हटा दें।
  7. निषेचन (डीपीएफ) के बाद 3 दिनों में, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत स्क्रीन लार्वा। मार्कर न्युट्रोफिल में दिखाई देगा, विशेष रूप से पुच्छल हेमटोपोइएटिक ऊतक (सीएचटी) में, जो इन कोशिकाओं में समृद्ध है।
    नोट: लेबल की गई कोशिकाओं का प्रतिशत विभिन्न निर्माणों के साथ भिन्न होता है, लेकिन आमतौर पर 20-60% न्यूट्रोफिल से निर्माण को व्यक्त करने की उम्मीद की जाती है। कम प्रतिशत आमतौर पर वयस्क चरण में अधिक स्क्रीनिंग की भविष्यवाणी करते हैं। मछली को उगाने से पहले इन भ्रूणों के नमूने में, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ झिल्ली पर रिसेप्टर के सही स्थानीयकरण को सत्यापित करना भी एक अच्छा अभ्यास है।
  8. मानक पशुपालन प्रथाओं के बाद सकारात्मक लार्वा बढ़ो20. ये F0 पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  9. 3 महीने की उम्र में, संस्थापकों के लिए F0 मछली स्क्रीन करें। एक गैर-ट्रांसजेनिक जंगली प्रकार के साथ व्यक्तिगत मछली को पार करें और विच्छेदन दायरे के तहत देखकर रिसेप्टर की अभिव्यक्ति के लिए 3 डीपीएफ पर अपनी संतानों को स्क्रीन करें। ट्रांसजेनेसिस सफलता के आधार पर, जो प्रत्येक निर्माण के साथ भिन्न होता है, क्रॉस के सबसेट में सकारात्मक संतानों का एक प्रतिशत देखें।
    नोट: अच्छे ट्रांसजेनेसिस के लिए, लगभग एक तिहाई से आधे वयस्क सकारात्मक संतान देंगे। एक क्लच में सकारात्मक संतानों का प्रतिशत ट्रांसजीन की प्रतिलिपि संख्या के साथ भिन्न होता है और, 10-60% के बीच हो सकता है। एकल सम्मिलन ट्रांसजेनिक्स की पहचान करने के लिए चंगुल के भीतर मेंडेलियन अनुपात का ट्रैक रखना सहायक है (ये सकारात्मक लार्वा के 50% अनुपात की तलाश में एफ 2 चंगुल में अधिक आसानी से पहचाने जाते हैं)20।
  10. सकारात्मक संतानों को बढ़ाएं, जो F1 पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  11. 3 महीने की उम्र में, स्थिर F2 ट्रांसजेनिक लाइन स्थापित करने के लिए उसी तरह से F1 वयस्कों को स्क्रीन करें।
  12. ट्रांसजीन की न्यूट्रोफिल-विशिष्ट अभिव्यक्ति को मान्य करने के बाद एफ 2 लार्वा पर प्रयोग करें।
    नोट: ट्रांसजेनेसिस के दौरान, कोई रिसेप्टर अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों का निरीक्षण कर सकता है और जैविक प्रश्नों के लिए सबसे उपयुक्त अभिव्यक्ति स्तर प्राप्त करने के लिए विभिन्न ट्रांसजेनिक चंगुल रखने की सलाह दी जाती है। प्रारंभिक परिणाम F0 या F1 लार्वा में प्राप्त किए जा सकते हैं।

2. ल्यूकोसाइट घाव प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए ज़ेब्राफ़िश भ्रूण एकत्र करना

  1. एक स्थिर ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन स्थापित करने के बाद, वयस्क और मादा ट्रांसजेनिक मछली के बीच एक क्रॉस स्थापित करें और अगली सुबह अंडे एकत्र करें।
  2. E3 माध्यम (या अंडे का पानी18) में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण विकसित करें।
  3. वैकल्पिक रूप से, 24 hpf पर, एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में भ्रूण को इनक्यूबेट करें जिसमें E3 माध्यम के 50 mL होते हैं, जो 5 मिनट के लिए 0.003% ब्लीच के साथ पूरक होते हैं। बाद में E3 माध्यम में 3 बार कुल्ला ट्यूब मिनट की एक जोड़ी के लिए खड़े होने के लिए भ्रूण नीचे में बसने के लिए अनुमति देने के लिए और फिर decanting और माध्यम की जगह.
    नोट: यह लार्वा के संक्रमण जोखिम पर नियंत्रण का एक स्तर प्रदान करता है, जो घाव के दौरान ल्यूकोसाइट्स के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है।
  4. ब्लीचिंग के बाद, मेलेनिन संश्लेषण को रोकने के लिए ई 3 माध्यम में भ्रूण को 1-फिनाइल-2-थायोयूरिया के 0.003% के साथ पूरक रखें। मेथिलीन ब्लू, जिसका उपयोग अक्सर फंगल संक्रमण को रोकने के लिए किया जाता है, को यहां ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए नहीं जोड़ा जाता है।
  5. लार्वा को स्वाभाविक रूप से हैच करने की अनुमति दें और 3 डीपीएफ पर उपयोग करें जब न्यूट्रोफिल प्रचुर मात्रा में21 हों।

3. लार्वा के वेंट्रल पंख घायल

  1. घाव के लिए लार्वा तैयार करें। 2.5-3.5 डीपीएफ पर लार्वा का उपयोग करें, जब प्रचुर मात्रा में न्यूट्रोफिल देखे जाते हैं। 160-200 मिलीग्राम / एल ट्राइकेन एमएस 222 के साथ पूरक ई 3 माध्यम में लार्वा स्थानांतरण।
    नोट: ट्राइकेन के केंद्रित समाधानों को तैयार किया जाना चाहिए और पहले से ही एलीकोट में जमे हुए और दिन पर पिघलाया जाना चाहिए।
  2. लार्वा को 15 मिनट के लिए E3 + tricaine माध्यम में छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे एनेस्थेटिक हैं। एक छोटे से पेंटब्रश या इसी तरह के उपकरण के साथ धीरे से छूकर उनकी प्रतिक्रियाओं की जांच करें।
  3. एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन क्षेत्र के तहत ट्रांसजेनिक रिसेप्टर अभिव्यक्ति के साथ लार्वा का चयन करें।
  4. घाव के लिए E3 + tricaine में एक 120 मिमी पेट्री पकवान के लिए लार्वा स्थानांतरण. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके लार्वा के वेंट्रल पंख को काट दिया जाता है, जबकि विच्छेदन दायरे (चित्रा 1) के तहत देखा जाता है।
    नोट: विचार पर्याप्त न्यूट्रोफिल भर्ती का कारण बनने के लिए एक गहरी पर्याप्त कटौती करना है, लेकिन सीएचटी के जहाजों को काटने के बिना। कट को सीएचटी अक्ष पर लंबवत बनाया जाता है जैसे कि चीरा लगभग सीएचटी के जहाजों तक पहुंच जाता है। यह कुछ अभ्यास लेता है और पहले लार्वा पर पर्यवेक्षण के साथ किया जाना चाहिए जो इस उद्देश्य के लिए उत्पन्न नहीं होते हैं (उदाहरण के लिए, किसी अन्य प्रयोग से अतिरिक्त लार्वा)।

4. लाइव इमेजिंग के लिए लार्वा की तैयारी

  1. एक तरल 2% agarose समाधान प्राप्त करने के लिए हीटिंग द्वारा E3 माध्यम में कम पिघलने बिंदु (LMP) agarose भंग।
  2. इस समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    नोट: विभिन्न लार्वा के बढ़ते के बीच agarose सेटिंग से बचने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में agarose के साथ एक फ्लास्क या ट्यूब रखें।
  3. माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए एक ग्लास बॉटम डिश में तरल एलएमपी + ई 3 के पिपेट 0.5 मिलीलीटर।
  4. पिपेट एक घायल, anesthetized zebrafish लार्वा के साथ-साथ कांच के नीचे पकवान में E3 + 2x Tricaine के 0.5 mL के साथ।
  5. धीरे से एक 1% LMP / 1x Tricaine agarose / E3 समाधान प्राप्त करने के लिए दो समाधानों को मिलाएं, बुलबुले की पीढ़ी से बचें। भ्रूण को पार्श्व रूप से उन्मुख करें और धीरे से नीचे धकेलें ताकि मछली का पुच्छल हिस्सा कांच के जितना संभव हो सके उतना करीब हो।
    नोट: एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग करते समय छविकृत किए जाने वाले ऊतक को कांच के नीचे जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए। लार्वा के लिए अभिविन्यास की सेटिंग त्वरित होनी चाहिए ताकि लार्वा को तैनात करने से पहले एगरोज सेट न हो।
  6. Agarose समाधान को ठंडा होने दें और 5-10 मिनट के लिए ठोस करें। परीक्षण करें कि क्या agarose धीरे से एक छोटे से पेंट ब्रश या टिप के साथ agarose जेल को छूने से सेट किया गया है।
  7. एक बार agarose ठोस है, इमेजिंग प्लेट के लिए tricaine के 0.2 मिलीग्राम / mL के साथ पूरक E3 के 2 mL जोड़ें।

5. लाइव confocal इमेजिंग

नोट: एक कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप या समकक्ष (चित्रा 2) पर छवि भ्रूण। एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन गतिशीलता का अस्थायी संकल्प अधिक सीमित होगा। घायल लार्वा लाने से पहले इमेजिंग सेटिंग्स तैयार करें, ताकि प्रतिक्रिया को घायल होने के बाद जितनी जल्दी हो सके चित्रित किया जा सके। न्यूट्रोफिल 5 मिनट के भीतर घाव पर पहुंचते हैं और पहले आने वाली कोशिकाओं में रिसेप्टर्स इस समय सीमा के भीतर आंतरिक हो सकते हैं। अभ्यास के साथ 15 मिनट के बाद घायल होने के बाद के रूप में जल्दी के रूप में छवि करना संभव है।

  1. माइक्रोस्कोप चालू करें: निर्माता के निर्देशों के अनुसार लेजर, कैमरा और कंप्यूटर।
  2. इमेजिंग सेटिंग्स सेट करने के लिए अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें. पिछले प्रयोगों के आधार पर उपयुक्त फ्लोरोफोरस और अनुमानित एक्सपोजर समय के लिए लेजर चुनें (488 एनएम के साथ जीएफपी और 561 एनएम लेजर के साथ टैगआरएफपी प्राप्त करें)।
  3. घुड़सवार भ्रूण के साथ प्लेट को स्थानांतरित करें, जितनी जल्दी हो सके agarose सेट के बाद, confocal इमेजिंग कताई डिस्क प्लेटफ़ॉर्म पर।
  4. मंच जॉयस्टिक का उपयोग करके पकवान में मछली को खोजने के लिए माइक्रोस्कोप आंख के टुकड़े का उपयोग करें।
  5. ध्यान केंद्रित घुंडी का उपयोग कर, घाव क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: ब्याज के क्षेत्र को खोजने के लिए कम आवर्धन वायु उद्देश्य (10x) का उपयोग करना आसान हो सकता है।
  6. घाव के चारों ओर छवि के लिए फ़ील्ड का चयन करें। पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ 30x/40x उद्देश्य का उपयोग करें।
  7. एक्सपोजर समय को समायोजित करने के लिए सॉफ़्टवेयर बटन का उपयोग करें ताकि फ्लोरोसेंट मार्कर को अच्छे विपरीत के साथ देखा जा सके लेकिन सिग्नल को संतृप्त किए बिना।
    नोट: फ्लोरोसेंट एक्सपोज़र को कम करने और टाइम-लैप्स में टेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन को अधिकतम करने के लिए एक्सपोज़र समय जितना संभव हो उतना कम होना चाहिए। लेजर शक्ति लेजर की स्थिति पर निर्भर करती है, लेकिन इसे एक स्तर पर समायोजित करने की आवश्यकता होती है जो गतिशील इमेजिंग के लिए कम पर्याप्त जोखिम समय की अनुमति देता है।
  8. z-स्टैक के रूप में छवि के लिए वॉल्यूम का चयन करने के लिए सॉफ़्टवेयर बटन का उपयोग करें
  9. वांछित अवधि के लिए हर 30 सेकंड में एक समय अंतराल सेट करें।
    नोट: बाँझ वेंट्रल फिन घावों के लिए, अधिकतम भर्ती 2-3 ज द्वारा मनाया जाता है।
  10. टाइम-लैप्स लॉन्च करने से पहले, दृश्य के क्षेत्र को दस्तावेज़ करने के लिए एक उज्ज्वल फ़ील्ड स्नैपशॉट लें। यदि संभव हो, तो समय-अंतराल फिल्म के भीतर उज्ज्वल क्षेत्र प्राप्त करें।

6. ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल में रिसेप्टर आंतरिककरण का परिमाणीकरण

  1. छवि अधिग्रहण का समय-अंतराल और छवि का पिक्सेल आकार रिकॉर्ड करें. इस बात का रिकॉर्ड रखें कि इमेजिंग को घायल करने के कितने मिनट बाद शुरू हुआ।
  2. सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पर छवि खींचकर फिजी का उपयोग करके छवि डेटासेट खोलें, समय स्लाइडर का उपयोग करके प्रत्येक डेटासेट के लिए ब्याज के प्रतिनिधि फ्रेम का चयन करें, उदाहरण के लिए, 1-1.5 घंटे के बाद घायल होने पर, और इसे सहेजें।
  3. छवि डेटासेट को संसाधित करने के लिए MATLAB के साथ आगे बढ़ें।
  4. एक नई स्क्रिप्ट बनाएँ और छवि पढ़ने के लिए फ़ंक्शन शामिल करें ( पूरक फ़ाइल 1 में केंद्रक परिभाषा के लिए 'select_neutrophils.m' नामक स्क्रिप्ट में पंक्ति 6), खोलने (अनुपूरक फ़ाइल 1 में पंक्ति 11) और छवि पर बिंदुओं का मैन्युअल चयन (अनुपूरक फ़ाइल 1 में पंक्ति 12)।
  5. इस स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 1) को चलाकर ब्याज के फ्रेम को खोलें, दृश्य निरीक्षण द्वारा विश्लेषण करने के लिए न्यूट्रोफिल की पहचान करें, उन पर क्लिक करें और उनके केंद्रक का अनुमान रिकॉर्ड करें, दोनों वेंट्रल फिन घाव में और सीएचटी में।
    नोट: सीएचटी में गैर-जुटाए गए न्यूट्रोफिल न्यूट्रोफिल न्यूट्रोफिल के लिए एक आंतरिक संदर्भ के रूप में कार्य करते हैं जिनके रिसेप्टर वितरण स्थिर रहता है। यह एक आंतरिक संदर्भ के लिए घाव पर कोशिकाओं के विपरीत मूल्यों के सामान्यीकरण की अनुमति देता है।
  6. नीचे दिए गए चरणों में वर्णित सक्रिय रूपरेखा तकनीक22 का उपयोग करके प्रत्येक फ्रेम में न्यूट्रोफिल के विभाजन के साथ आगे बढ़ें।
  7. सक्रिय रूपरेखा द्वारा विभाजन के लिए आवश्यक मेटाडेटा को शामिल करने के लिए एक फ़ंक्शन बनाएं (यानी, पुनरावृत्तियों की संख्या, समोच्च का पूर्वाग्रह, अनुमानित केंद्रक आदि) 22 ( अनुपूरक फ़ाइल 2 में 'घाव डेटा.m' देखें)।
  8. एक स्क्रिप्ट बनाएँ जो फ़ंक्शन को प्रत्येक न्यूट्रोफिल के विभाजन के लिए आवश्यक जानकारी इनपुट करने के लिए 'wound_data.m' कहता है ( पूरक फ़ाइल 3 में 'calc_contrast.m' नामक स्क्रिप्ट में स्क्रिप्ट में पंक्ति 28)।
  9. छवि पढ़ने के लिए स्क्रिप्ट आदेशों में शामिल करें (अनुपूरक फ़ाइल 3 में पंक्ति 32).
  10. इनपुट छवि ( अनुपूरक फ़ाइल 3 में पंक्ति 44) के बराबर आकार के साथ एक काली छवि (यानी छवि जहां पिक्सेल मान शून्य हैं) की पीढ़ी जोड़ें और प्रत्येक न्यूट्रोफिल के केंद्रक के चारों ओर 10 × 10 पिक्सेल के वर्ग की परिभाषा ( पूरक फ़ाइल 3 में पंक्ति 45)।
  11. सक्रिय रूपरेखा (अनुपूरक फ़ाइल 3 में पंक्तियाँ 48-49) का उपयोग करके न्यूट्रोफिल विभाजन और छोटे गलत पता लगाए गए ऑब्जेक्ट्स ( अनुपूरक फ़ाइल 3 में पंक्ति 52) को हटाने में शामिल करें।
    नोट: प्रारंभिक विभाजन समोच्च केंद्रक के चारों ओर वर्ग है, जो पिक्सेल तीव्रता, पुनरावृत्तियों की संख्या और समोच्च के पूर्वाग्रह के आधार पर सक्रिय समोच्च तकनीक द्वारा विकसित होता है। विभाजन का परिणाम एक बाइनरी मुखौटा है जहां सभी पिक्सेल का मूल्य न्यूट्रोफिल क्षेत्र के अलावा 0 है, जिसके पिक्सेल का मान 1 है।
  12. केवल न्यूट्रोफिल की पिक्सेल तीव्रता प्राप्त करने के लिए मूल के साथ खंडित बाइनरी छवि का गुणन शामिल करें, बाकी छवि के साथ-ए-संख्या नहीं है, इसलिए यह गणना में योगदान नहीं करता है ( पूरक फ़ाइल 3 में पंक्तियां 56-57)।
  13. प्रत्येक न्यूट्रोफिल (GLCM)14,23 (अनुपूरक फ़ाइल 3 में पंक्ति 61) के लिए ग्रे-स्तर सह-आवृत्ति मैट्रिक्स की गणना जोड़ें। GLCM पिक्सेल तीव्रता के संदर्भ में पिक्सेल की सापेक्ष स्थिति दिखाने वाली छवि का एक और प्रतिनिधित्व है।
  14. GLCM (लाइनें 62,65 अनुपूरक फ़ाइल 3 में) पर आधारित न्यूट्रोफिल के कंट्रास्ट की गणना शामिल करें। कंट्रास्ट मीट्रिक पड़ोसी पिक्सेल के बीच तीव्रता में अंतर को मापता है। पिक्सेल की तुलना पिक्सेल के साथ की जाती है, जो तीव्रता में स्थानीय चोटियों के आकार के आधार पर अनुभवजन्य रूप से समायोजित किया जा सकता है। एक संकेत के रूप में, छवियों के लिए, 0.389 μm के पिक्सेल आकार के साथ, जब रिसेप्टर ने वेसिकुलर वितरण दिखाया तो प्रत्येक उज्ज्वल बिंदु 5 पिक्सेल की सीमा में था। इसलिए, तीव्रता की तुलना पिक्सेल में 5 पिक्सेल के अलावा की गई थी।
  15. वेंट्रल फिन ( अनुपूरक फ़ाइल 3 में पंक्ति 68) में अलग-अलग न्यूट्रोफिल के लिए मानों को अलग-अलग सहेजने के लिए आदेश जोड़ें।
  16. सभी CHT न्यूट्रोफिल से माध्य न्यूट्रोफिल कंट्रास्ट मान की गणना को उसी तरह से शामिल करें जैसे घाव पर न्यूट्रोफिल के लिए (पूरक फ़ाइल 3 में लाइनें 72-119)। CHT न्यूट्रोफिल के लिए, फ़ंक्शन को 'cht_data.m' ( अनुपूरक फ़ाइल 4 में पंक्ति 77) कहें।
  17. चरण 6.16 (यानी, विभाजन) ( अनुपूरक फ़ाइल 3 में पंक्ति 122) में ऊपर गणना की गई सीएचटी न्यूट्रोफिल के माध्य विपरीत के लिए घाव पर अलग-अलग न्यूट्रोफिल के विपरीत मूल्य के सामान्यीकरण को शामिल करें। यह एक सामान्यीकृत कंट्रास्ट देता है जो दर्शाता है कि गैर-प्रतिक्रिया कोशिकाओं को नियंत्रित करने के सापेक्ष व्यक्तिगत प्रतिक्रिया कोशिकाओं में रिसेप्टर की उपस्थिति कितनी 'डॉटी' है (चित्रा 3 और चित्रा 4)।
  18. सॉफ़्टवेयर में चलाएँ प्रतीक क्लिक करके स्क्रिप्ट (अनुपूरक फ़ाइल 3) चलाएँ।
  19. विभिन्न स्थितियों के लिए सभी चरणों को दोहराएँ।
  20. एक स्तंभ तालिका बनाकर विभिन्न स्थितियों के लिए परिणाम आयात करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर (सामग्री तालिका देखें) का उपयोग करें, परिणामों को प्लॉट करें और माध्य मानों के बीच अंतर के महत्व की जांच करने के लिए सांख्यिकीय परीक्षण करें।
    नोट:: विश्लेषण के लिए कोड भी GitHub में https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic पर पाया जा सकता है

7. जल्दी भ्रूण में केमोकाइन प्रतिक्रिया assays

नोट: यह एक वैकल्पिक पक्ष प्रयोग है जो एक उम्मीदवार केमोकाइन के जवाब में रिसेप्टर वितरण परिवर्तनों के परीक्षण की अनुमति देता है और रिसेप्टर निर्माणों की न्यूट्रोफिल अभिव्यक्ति से संबंधित ऊपर वर्णित प्रयोगों से स्वतंत्र है। रिसेप्टर्स के बीच लिगैंड-प्रेरित तस्करी में अंतर इस तकनीक के साथ स्थापित करना मुश्किल है क्योंकि लिगैंड स्तर संतृप्त कर रहे हैं14। हालांकि, यदि कोई इस प्रणाली में एक रिसेप्टर के लिगैंड-आंतरिककरण को देखता है, तो यह एक संकेत हो सकता है कि लिगैंड को रिसेप्टर द्वारा उन उदाहरणों में पहचाना जाता है जहां लिगैंड पहचान अस्पष्ट है। यह उपयोगी है, क्योंकि स्थापित सेल लाइनों जैसे कि HEK293T कोशिकाओं14 में केमोकाइन रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति बोझिल हो सकती है।

  1. जंगली प्रकार की मछली (जैसे, एबी) का एक क्रॉस सेट करें और विभाजकों को उठाने के तुरंत बाद अगली सुबह अंडे एकत्र करें (जैसा कि ऊपर वर्णित है)।
  2. फ्लोरोसेंटली टैग किए गए रिसेप्टर एमआरएनए (जैसे, Cxcr1-FT) के 100 पीजी को इंजेक्ट करें, साथ ही एक झिल्ली मार्कर (जैसे, झिल्ली सीएफपी) के लिए एमआरएनए के 100 पीजी के साथ। केमोकाइन लिगैंड के लिए एमआरएनए की अलग-अलग खुराक के मिश्रण में शामिल करें।
    नोट: एक संकेत के रूप में 150 पीजी Cxcl8a mRNA फ्लोरोसेंट Cxcr1-FT के प्रमुख internalization दिया ( चित्रा 5 देखें).
  3. E3 माध्यम के साथ भ्रूण कुल्ला और 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन।
  4. लगभग 7 hpf पर, एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन दायरे पर mRNA की अभिव्यक्ति का परीक्षण करें और छवि के लिए भ्रूण का चयन करें।
  5. पहले से 0.8% LMP agarose तैयार करें और 60 °C पर हीटब्लॉक में ग्लास ट्यूब में रखें। भ्रूण में हेरफेर करने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। प्रत्येक हाथ में संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके धीरे से dechorionate भ्रूण।
  6. कांच पिपेट के साथ एक व्यक्तिगत dechorionated भ्रूण aspirate सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले टिप पर हैं. धीरे से agarose की ट्यूब में भ्रूण जारी यह ट्यूब में डूब करने के लिए अनुमति देता है.
  7. Agarose ट्यूब से भ्रूण aspirate, रास्ते में कुछ तरल agarose इकट्ठा. धीरे से एक ग्लास-बॉटम वाले इमेजिंग डिश के केंद्र पर भ्रूण को छोड़ दें। जल्दी से भ्रूण को घुमाएं ताकि पशु ध्रुव डिश के नीचे का सामना कर रहा हो (यह पक्ष एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय उद्देश्य के सबसे करीब होना चाहिए)।
    नोट:: एक भ्रूण के अभिविन्यास rejust करने की आवश्यकता हो सकती है, जबकि agarose अभी भी सेटिंग है.
  8. agarose सेट करने के बाद, E3 माध्यम के 2 mL के साथ पूरक।
    नोट: इस स्तर पर भ्रूण लार्वा की तुलना में बहुत नाजुक हैं और यह dechorionate और माउंट करने के लिए कुछ अभ्यास लेता है। भ्रूण के टूटने से बचने के लिए, जितना संभव हो उतना धीरे-धीरे एस्पिरेट और रिलीज करना महत्वपूर्ण है।
  9. प्रति डिश 3-5 भ्रूण लोड करने के उद्देश्य से प्रक्रिया को दोहराएं।
  10. एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप पर छवि भ्रूण ( सामग्री की तालिका देखें)। उच्च पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए 40x/1.3 NA तेल उद्देश्य का उपयोग करें। mCFP, sfGFP, और tagRFP को क्रमशः 405, 488, और 552 nm के साथ, दायरे पर विज़ुअलाइज़ करें। संतृप्ति से बचने और चैनलों के बीच के माध्यम से रिसाव को कम करने के दौरान उच्च विपरीत करने के लिए फ़िल्टर और सेटिंग्स को समायोजित करें।
  11. विभिन्न स्थितियों के लिए बढ़ते और इमेजिंग को दोहराएं।

Representative Results

वेंट्रल फिन घाव के बाद 30-60 मिनट (चित्रा 1) के भीतर वेंट्रल फिन में सीएचटी से वेंट्रल फिन और घाव मार्जिन पर क्लस्टरिंग में तेजी से न्यूट्रोफिल जुटाव होता है। हमने दो केमोकाइन रिसेप्टर्स, Cxcr1 और Cxcr2 के वितरण की कल्पना की, जो ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल24 द्वारा व्यक्त किए जाते हैं और कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके Cxcl8a और Cxcl8b14 को पहचानते हैं। हमने दो संबंधित ट्रांसजेनिक लाइनें उत्पन्न कीं, Tg (lyz: Cxcr1-FT) और Tg (lyz: Cxcr2-FT), जिसमें न्यूट्रोफिल रिसेप्टर के फ्लोरोसेंट टाइमर (FT) निर्माण को व्यक्त करते हैं, यानी sfGFP और tagRFP (चित्रा 2 और संदर्भ14) के अग्रानुक्रम के साथ एक संलयन। दो फ्लोरोफोरेस के उपयोग का उद्देश्य रिसेप्टर भाग्य की एक विस्तृत श्रृंखला की निगरानी की अनुमति देना और प्लाज्मा झिल्ली पर प्रोटीन टर्नओवर समय का अनुमान प्रदान करना था, क्योंकि नए संश्लेषित रिसेप्टर्स हरे रंग में फ्लोरेस करेंगे और 8,14 वर्ष की आयु के रूप में उत्तरोत्तर लाल हो जाएंगे। हालांकि, इन रिसेप्टर्स को न्यूट्रोफिल प्लाज्मा झिल्ली पर तेजी से संरचनात्मक कारोबार पाया गया था और निवास का समय टैगआरएफपी के परिपक्वता समय से कम था, जिसमें एसएफजीएफपी झिल्ली स्थानीयकरण और टैगआरएफपी को स्थिर स्थिति (पूरक वीडियो 1 और रेफरी14) पर वेसिकुलर स्थानीयकरण दिखा रहा था। इसलिए, हमने ऊतक क्षति की साइटों पर लिगैंड-प्रेरित आंतरिककरण की निगरानी के लिए एसएफजीएफपी के वितरण पर ध्यान केंद्रित किया। रिसेप्टर वितरण के पैटर्न को कंट्रास्ट मीट्रिक का उपयोग करके परिमाणित किया गया था, जो पड़ोसी पिक्सेल के बीच तीव्रता में अंतर की रिपोर्ट करता है। तर्क यह है कि जब रिसेप्टर वितरण झिल्लीदार और चिकनी होता है, तो इसके विपरीत मूल्य कम होता है। जब रिसेप्टर वितरण vesicular और अधिक punctate है, तो इसके विपरीत मान उच्च है (चित्रा 3)।

एक वैकल्पिक विधि रिसेप्टर स्तरों (sfGFP तीव्रता) के अनुपात को एक नियंत्रण झिल्ली मार्कर के स्तर पर मापना है जैसे झिल्ली CFP (mCFP) (चित्रा 3)। दोनों विधियां रिसेप्टर आंतरिककरण का पता लगा सकती हैं, जैसा कि सेल (उच्च कंट्रास्ट मूल्य) में विश्व स्तर पर अधिक वेसिकुलर रिसेप्टर वितरण पैटर्न या झिल्ली पर कम रिसेप्टर स्तर (कम एसएफजीएफपी / एमसीएफपी अनुपात) द्वारा इंगित किया गया है। हालांकि, कंट्रास्ट मीट्रिक घाव पर न्यूट्रोफिल समूहों में रिसेप्टर आंतरिककरण का भी पता लगा सकता है, जिसमें झिल्ली विभाजन कम सटीक था और लागू नहीं था (चित्रा 3)। इस मीट्रिक का उपयोग करते हुए, हम घावों पर न्यूट्रोफिल में Cxcr1 और Cxcr2 तस्करी के बीच दृश्यमान अंतर को मापने में सक्षम थे (चित्रा 4 और पूरक वीडियो 2)। Cxcr1-FT घाव पर स्थित कोशिकाओं में आंतरिक रूप से जबकि Cxcr2-FT घाव पर न्यूट्रोफिल में झिल्लीदार बना रहा (चित्रा 4ए-सी, पूरक वीडियो 2 और पूरक वीडियो 3)। Cxcl8a और Cxcl8b का दमन, मॉर्फोलिनो उपचार के माध्यम से, घावों पर Cxcr1-FT आंतरिककरण को अलग-अलग रूप से प्रभावित करता है (चित्रा 4C,D)। आगे सत्यापित करने के लिए कि Cxcr1-FT Cxcl8a का जवाब देता है, हमने शुरुआती भ्रूण में केमोकाइन प्रतिक्रिया assays का प्रदर्शन किया। हमने पाया कि Cxcr1-FT स्पष्ट रूप से भ्रूण में आंतरिक रूप से आंतरिक है जिसमें Cxcl8a सह-व्यक्त किया गया था (चित्रा 5)। कुल मिलाकर इन परिणामों से संकेत मिलता है कि वर्णित तरीकों को न्यूट्रोफिल में केमोकाइन-प्रेरित रिसेप्टर आंतरिककरण को मापने और इन प्रभावों की मध्यस्थता करने वाले लिगैंड की पहचान स्थापित करने के लिए तैनात किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: वेंट्रल फिन घावों के लिए न्यूट्रोफिल माइग्रेशन। (ए) (बाएं) 3 डीपीएफ लार्वा का कार्टून जो पुच्छल हेमटोपोइएटिक ऊतक (सीएचटी), वीनस परिसंचरण (वीसी, नीले), वेंट्रल फिन (वीएफ) और घाव स्थल के स्थान को दर्शाता है। (दाएँ) कार्टून घाव (डब्ल्यू) के क्षेत्र को दर्शाता है जिसमें न्यूट्रोफिल सीएचटी से जुटाए जाते हैं और घाव पर क्लस्टरिंग करते हैं। सीएचटी ऊतक की पुच्छल शिरा जाल (सीवीपी) नीले रंग में तैयार की जाती है। (बी) उज्ज्वल क्षेत्र छवि (बाएं) और confocal प्रक्षेपण (दाएं) वेंट्रल फिन घाव और Tg (mpx: GFP) लार्वा में न्यूट्रोफिल के वितरण को 2 ज पोस्ट-घायल पर दिखा रहा है। धराशायी लाइनें VF और CHT रूपरेखा दिखाती हैं। स्केल बार = 25 μm. कार्टून और फ्लोरोसेंट छवि ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से संशोधित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: न्यूट्रोफिल में केमोकाइन रिसेप्टर तस्करी की लाइव इमेजिंग। (ए) Cxcr1-FT (फ्लोरोसेंट टाइमर) और Cxcr2-FT की न्यूट्रोफिल-विशिष्ट ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किए जाने वाले निर्माण। 3 dpf ट्रांसजेनिक लार्वा (Tg(lyz:Cxcr1-FT), शीर्ष के सिर में न्यूट्रोफिल के कॉन्फोकल अनुमान; Tg (lyz: Cxcr2-FT), नीचे) tRFP (मैजेंटा) और sfGFP (हरे) चैनल दिखा रहा है। स्केल बार = 20 μm. (B) चित्र 1A के रूप में 3 dpf लार्वा की शारीरिक योजना। लार्वा के नीचे घाव (डब्ल्यू) के क्षेत्र को दर्शाने वाली योजनाएं हैं, जिसमें न्यूट्रोफिल सीएचटी (शीर्ष) से जुटाए जाते हैं या वेंट्रल फिन (नीचे) में प्रवेश करने पर केमोटैक्सिस का प्रदर्शन करते हैं। धराशायी वर्ग दाईं ओर स्नैपशॉट में चित्रित क्षेत्र को इंगित करता है। (सी) टीजी (lyz: Cxcr1-FT) लार्वा (sfGFP दिखाया गया है) में न्यूट्रोफिल को CHT (शीर्ष पैनलों) या घाव (नीचे पैनलों) की ओर chemotaxis से जुटाने पर दिखाया गया है। तीर समय के साथ एक ही कक्ष दिखाते हैं. दाईं छवि पर समय बिंदु बाईं ओर की छवि के बाद बीत चुके मिनट होते हैं। स्केल बार = 10 μm. (D) केमोकाइन रिसेप्टर तस्करी के लाइव इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। पैनलों A-C ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से संशोधित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रिसेप्टर गतिशीलता के परिमाणीकरण उदाहरण। एकल (नीला) या संकुल न्यूट्रोफिल (हरे) घावों पर या सीएचटी (लाल, नारंगी) में गैर-जुटाए गए न्यूट्रोफिल को परिणामों की तुलना करने के लिए विभिन्न तरीकों से विभाजित और विश्लेषण किया गया था। दिखाए गए एक ही उदाहरण कक्षों को दो विधियों के साथ विश्लेषण किया गया था ताकि छवि में निकाले गए मूल्यों की सीमा के साथ क्या देखा जाता है, इससे संबंधित हो सके। (ए) चयनित, उदाहरण कोशिकाओं की सतह को sfGFP चैनल में समोच्च परिभाषा के आधार पर विभाजित किया गया था। (बी) कंट्रास्ट की गणना ए में दिखाए गए उदाहरण कोशिकाओं से की गई थी(सी) चयनित, उदाहरण कोशिकाओं की झिल्ली को सीएफपी चैनल में समोच्च परिभाषा के आधार पर विभाजित किया गया था। एसएफजीएफपी/सीएफपी के रेशियोमेट्रिक विश्लेषण का अनुसरण किया गया। (घ) sfGFP/CFP के अनुपात की गणना C में दिखाए गए उदाहरण कोशिकाओं पर की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ व्यक्तिगत कोशिकाओं से S.E.M. का प्रतिनिधित्व करती हैं, n>1 के मामलों में, यहाँ मानों का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए नहीं किया गया था, बल्कि केवल विभिन्न परिमाणीकरण विधियों के साथ प्राप्त मापों का उदाहरण देने के लिए किया गया था। स्केल बार = 10 μm. चित्र ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से संशोधित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: घायल करने के जवाब में Cxcr1 और Cxcr2 की विभेदक गतिशीलता। (ए) टीजी (lyz: Cxcr1-FT) या Tg (lyz: Cxcr2-FT) लार्वा में न्यूट्रोफिल का कॉन्फोकल प्रक्षेपण 80 मिनट के बाद घाव पर घाव पर (sfGFP चैनल दिखाया गया है)। स्केल बार = 10 μm.  (बी) घाव पर आवर्धित Cxcr1-FT न्यूट्रोफिल (बाएं) और Cxcr2-FT (दाएं)। हरे रंग के रिसेप्टर को ग्रे में दिखाया गया है। स्केल बार = 5 μm. (C) सामान्यीकृत कंट्रास्ट (CHT में गैर-जुटाई गई कोशिकाओं के माध्य विपरीत के लिए सामान्यीकृत प्रति व्यक्तिगत न्यूट्रोफिल के विपरीत इसके विपरीत)। cxcl8a एक splice-blocking के इंजेक्शन को संदर्भित करता है जिसमें cxcl8a के लिए अनुवाद-अवरुद्ध मॉर्फोलिनो होता है। cxcl8b cxcl8b के लिए एक splice-अवरुद्ध morpholino के साथ इंजेक्शन को संदर्भित करता है। Tg (lyz: Cxcr1-FT) के लिए: n = 24 कोशिकाओं (CHT), n = 47 कोशिकाओं (घाव) 8 लार्वा से। morpholinos के साथ Tg (lyz: Cxcr1-FT) के लिए: 5 लार्वा से n = 28 कोशिकाएं (Cxcl8a-MO), n = 16 कोशिकाएं (Cxcl8b-MO) 5 लार्वा से। Tg (lyz: Cxcr2-FT) के लिए: n = 10 कोशिकाओं (CHT) और n = 20 कोशिकाओं (घाव) से 3 लार्वा. डेटा को 1-5 इमेजिंग सत्रों में प्राप्त स्वतंत्र लार्वा से पूल किया गया था। Kruskal-Wallis Tg (lyz: Cxcr1-FT) के लिए Dunn के कई तुलना परीक्षण के साथ परीक्षण, Tg (lyz: Cxcr2-FT) के लिए दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड मैन-व्हिटनी परीक्षण। (डी) Tg (lyz: Cxcr1-FT) ट्रांसजेनिक लार्वा में न्यूट्रोफिल का कॉन्फोकल प्रक्षेपण cxcl8a morpholino (MO) (बाएं) और cxcl8b MO (दाएं) के साथ इलाज किया जाता है जो पंख के घावों (हरे रंग में दिखाए गए sfGFP चैनल) का जवाब देता है। स्नैपशॉट समतुल्य न्यूट्रोफिल संचय के टाइमपॉइंट्स पर लिया गया है (बाएं छवि में 85 मिनट पोस्ट-घायल और दाएं छवि में 45 मिनट पोस्ट-घायल)। स्केल बार = 10 μm. चित्र ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से संशोधित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रारंभिक भ्रूण में केमोकाइन प्रतिक्रिया परख. गैस्ट्रूलेटिंग भ्रूण के लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल स्लाइस जो Cxcr1-FT की अभिव्यक्ति और वितरण दिखाते हैं। Cxcr1-FT mRNA के 100 pg को 150 pg Cxcl8a mRNA के साथ या उसके बिना एक सेल-स्टेज अंडे में इंजेक्ट किया गया था। हरे और लाल रिसेप्टर्स को अलग-अलग चैनलों में दिखाया जाता है। नियंत्रण झिल्ली CFP मार्कर (mCFP) सियान चैनल में दिखाया गया है। स्केल बार = 20 μm. चित्र ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से संशोधित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फिल्म 1: एक Tg (lyz: Cxcr1-FT) (बाएं) और Tg (lyz: Cxcr2-FT) (दाएं) लार्वा के सिर में ट्रांसजेनिक न्यूट्रोफिल 3 dpf पर। sfGFP (हरा), tagRFP (magenta). फ्रेम अंतराल 30 सेकंड है और फ्रेम दर 5 एफपीएस है। स्केल बार = 20 μm. वीडियो ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से उत्पन्न होता है। इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक मूवी 2: Tg (lyz: Cxcr1-FT) (बाएं) और Tg (lyz: Cxcr2-FT) (दाएं) ट्रांसजेनिक लार्वा में न्यूट्रोफिल फिन घावों का जवाब देते हैं। फिल्म 10 मिनट के बाद घायल होने के भीतर शुरू होती है और 60 मिनट तक रहती है sfGFP (हरा), टैगआरएफपी (मैजेंटा)। फ्रेम अंतराल 30 सेकंड है और फ्रेम दर 10 एफपीएस है। CHT = पुच्छल हेमटोपोइएटिक ऊतक। VF = ventral fin स्केल बार = 25 μm. वीडियो ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से उत्पन्न होता है। इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फिल्म 3. एक घायल Tg (lyz: Cxcr1- FT) ट्रांसजेनिक लार्वा (वीडियो 2 में दिखाए गए विभिन्न लार्वा) से न्यूट्रोफिल के अतिरिक्त उदाहरण, उच्च रिज़ॉल्यूशन पर अधिग्रहित, रिसेप्टर internalization (एसएफजीएफपी चैनल हरे रंग में दिखाया गया है) को दिखा रहा है, सीएचटी में जुटाने पर या वेंट्रल फिन में प्रवेश और chemotaxis पर। फ्रेम अंतराल 30 सेकंड है और फ्रेम दर 2 एफपीएस है। स्केल बार = 10 μm. वीडियो ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) से उत्पन्न होता है। इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 1: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 2: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित विधि ऊतक क्षति के लिए एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान सीटू में अंतर्जात लिगेंड के जवाब में रिसेप्टर गतिशीलता की लाइव इमेजिंग की अनुमति देती है। Cxcr1 / Cxcr2 न्यूट्रोफिल पत्रकारों के उपयोग को अन्य शारीरिक सेटिंग्स में विस्तारित किया जा सकता है, जैसे कि संक्रमण, ट्यूमर मॉडल या अन्य प्रकार के ऊतक क्षति 14,25,26,27। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक बचाव लाइनें, जिसमें अंतर्जात रिसेप्टर को एक बहिर्जात उत्परिवर्ती रिसेप्टर द्वारा दबाया और बचाया जाता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में विशिष्ट न्यूट्रोफिल माइग्रेशन पैटर्न के महत्व को विच्छेदित करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, Cxcr1 रिसेप्टर उत्परिवर्ती है कि बिगड़ा desensitization सूजन साइटों पर अधिक प्रमुख न्यूट्रोफिल क्लस्टरिंग का कारण बनताहै 14. फ़ंक्शन फेनोटाइप के इस लाभ का उपयोग विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में न्यूट्रोफिल मंडली की भूमिका को समझने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, घाव की मरम्मत, संक्रामक रोग, या ट्यूमर विकास, और पूरक रिसेप्टर नॉकडाउन / नॉकआउट प्रयोग। यह पद्धति उपलब्ध संवाददाताओं की सीमा का विस्तार करने के लिए एक आधार भी प्रदान करती है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की पसंद पर विचार करना महत्वपूर्ण है और जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है। हमने पाया कि उपकला कोशिकाओं की तुलना में न्यूट्रोफिल में इन केमोकाइन रिसेप्टर्स का संरचनात्मक कारोबार उच्च था, और तेजी से परिपक्वता (जैसे, एसएफजीएफपी) वाले पत्रकारों को स्थिर स्थिति में झिल्ली के स्तर की रिपोर्ट करने और न्यूट्रोफिल उत्तेजना 8,14 पर मतभेदों को हल करने की आवश्यकता थी। इस प्रकार, sfGFP / tagRFP के झिल्ली अनुपात इस सेल प्रकार में लिगैंड-प्रेरित आंतरिककरण को मापने के लिए लागू नहीं होते हैं, लेकिन टैगआरएफपी का पैटर्न रिसेप्टर के इंट्रासेल्युलर भाग्य को ट्रैक करने की अनुमति देता है, जो कुछ अध्ययनों में उपयोगी हो सकता है। हमने यह भी पाया कि टैगआरएफपी का अधिक केंद्रित इंट्रासेल्युलर सिग्नल व्यक्तिगत लार्वा की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है। प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर के स्तर को मापने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण न्यूट्रोफिल में एक फ्लोरोसेंट झिल्ली मार्कर को सह-व्यक्त करना होगा या तो एक ही ट्रांसजीन9 में या एक स्वतंत्र ट्रांसजीन14 में। पूर्व परिदृश्य में ट्रांसजीन मछली और अभिव्यक्ति के स्तर की जांच के लिए एक अतिरिक्त साधन प्रदान करेगा, जो मार्कर और रिसेप्टर के बीच तुलनीय होगा। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण अधिक मॉड्यूलर होगा, जिसमें एक रिसेप्टर रिपोर्टर के साथ एक ज़ेबराफ़िश लाइन को विभिन्न रिपोर्टर लाइनों के साथ जोड़ा जा सकता है। किसी भी मामले में, यह ध्यान देने योग्य है कि रिसेप्टर के स्तर की झिल्ली परिमाणीकरण संकुल न्यूट्रोफिल में चुनौतीपूर्ण है (नीचे देखें)। अंत में, हम ध्यान देते हैं कि इस प्रोटोकॉल का एक संभावित विस्तार अधिक विस्तृत स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा लाइव इमेजिंग का पालन करना होगा।

टॉल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम अच्छी तरह से स्थापितहै 7 और लाइसोजाइम सी प्रमोटर का उपयोग न्युट्रोफिल अभिव्यक्ति11,15 के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। इसलिए, ट्रांसजेनेसिस दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सीधा है और इस प्रमोटर के साथ प्राप्त अभिव्यक्ति का स्तर रिसेप्टर गतिशीलता के विश्लेषण के लिए पर्याप्त विपरीत प्रदान करने के लिए पर्याप्त उच्च है। एक संभावित सीमा यह है कि अभिव्यक्ति का स्तर अंतर्जात रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर को दोहराता नहीं है। नई CRISPR प्रौद्योगिकियों को विशेष रुचि के रिसेप्टर्स के लिए नॉक-इन लाइनों को स्थापित करने के लिए तैनात किया जा सकताहै। ये प्रौद्योगिकियां अभी भी बोझिल हैं और उपकोशिकीय इमेजिंग के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति के स्तर की गारंटी नहीं दे सकती हैं, लेकिन उनका सफल विकास अंतर्जात सिग्नलिंग गतिशीलता को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण सफलता होगी। ट्रांसजेनिक रिसेप्टर निर्माणों के साथ डेटा की व्याख्या करने के लिए कार्यात्मक सत्यापन महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, लिगैंड मान्यता एसेस का उपयोग यह स्थापित करने के लिए किया जा सकता है कि फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन कार्यात्मक है और नॉकआउट फेनोटाइप के बचाव का उपयोग यह स्थापित करने के लिए किया जा सकता है कि ट्रांसजेनिक न्यूट्रोफिल अभिव्यक्ति का स्तर कार्यक्षमता14 के साथ संगत है। अंत में, रिसेप्टर संलयन को मान्य करने का एक और अधिक सीधा तरीका गैर-लेबल संस्करणों14 के साथ लेबल किए गए रिसेप्टर के साथ एक इन विट्रो कार्यात्मक परख का उपयोग करना होगा।

परिमाणीकरण दृष्टिकोण विवो में न्यूट्रोफिल में सटीक झिल्ली विभाजन में विशिष्ट कठिनाइयों को संबोधित करता है। उपकला प्रकृति की कोशिकाओं में, रिसेप्टर स्तरों के परिमाणीकरण को झिल्ली रिसेप्टर के स्तर को नियंत्रण मार्कर में सामान्य करके स्वचालित रूप से निष्पादित किया जा सकता है, जिसे अग्रानुक्रम या अलग से9 में व्यक्त किया जा सकता है। दरअसल, हमने इस तरह के एक दृष्टिकोण को लागू किया है, जब गैस्ट्रूलेटिंग भ्रूण14 में लिगैंड-मान्यता परख का उपयोग किया जाता है। हालांकि, न्यूट्रोफिल विवो में सेल के आकार में जटिल, तेजी से परिवर्तन से गुजरते हैं, जिससे झिल्ली विभाजन 2 डी और 3 डी14 दोनों में मुश्किल हो जाता है। यह और भी चुनौतीपूर्ण है जब न्युट्रोफिल क्लस्टर, जो कई शारीरिक सेटिंग्स29 में होता है। कंट्रास्ट मीट्रिक इस सीमा को दूर करता है क्योंकि इसे झिल्ली विभाजन की आवश्यकता नहीं होती है, बल्कि इसके बजाय सेल में रिसेप्टर वितरण की समग्र स्थिति को दर्शाता है (झिल्लीदार / चिकनी बनाम वेसिकुलर / डॉटी)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कंट्रास्ट मीट्रिक छवि के समग्र विपरीत से प्रभावित हो सकता है, इसलिए विभिन्न भ्रूणों / नमूनों में संकेत की परिवर्तनशीलता के लिए आंतरिक संदर्भ के लिए व्यक्तिगत सेल मूल्यों के सामान्यीकरण की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, हमने CHT में गैर-उत्तरदायी न्यूट्रोफिल के माध्य सेल कंट्रास्ट मूल्य का उपयोग किया (यानी, न्यूट्रोफिल जो स्थिर रहते हैं और वेंट्रल फिन में माइग्रेट नहीं करते हैं)14। एक अतिरिक्त संभावना एक ही सेल में एक नियंत्रण मार्कर के विपरीत मूल्यों के साथ सामान्य करने के लिए होगी। यह एक समाधान प्रदान करेगा जब गैर-प्रतिक्रिया देने वाली कोशिकाओं का एक आंतरिक संदर्भ उपलब्ध नहीं होता है और संभवतः विभिन्न स्थितियों के बीच रिसेप्टर गतिशीलता में महीन मात्रात्मक अंतर को हल कर सकता है।

इमेजिंग का स्थान विचार करने के लिए एक और चर है। यहां वेंट्रल फिन घाव को चुनने का कारण, जैसा कि अधिक आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले पूंछ पंख घाव मॉडल16,30 के विपरीत है, क्योंकि घाव की साइट न्युट्रोफिल निवास / प्रवासी मूल की साइट के पास है। यह परख की समयरेखा को तेज करता है, क्योंकि न्यूट्रोफिल को आने में अपेक्षाकृत कम समय लगता है। साथ ही, यह माइग्रेशन मूल (CHT) और ब्याज (घाव) के लक्ष्य स्थान दोनों पर सेल व्यवहार को कैप्चर करने का अवसर प्रदान करता है। यह यहां प्रासंगिक है, क्योंकि उपकोशिकीय इमेजिंग के लिए आवश्यक स्थानिक और अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को दृश्य या बहु-स्थिति स्कैनिंग के एक बड़े क्षेत्र के साथ जोड़ना मुश्किल है। इस प्रकार, वेंट्रल फिन घाव परख माइग्रेशन मूल से प्रवासी प्रतिक्रिया के विकास की ट्रैकिंग और कोशिकाओं में अनिर्दिष्ट रिसेप्टर उतार-चढ़ाव के एक साथ कैप्चरिंग की अनुमति देता है जो प्रतिक्रिया नहीं करते हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, उत्तरार्द्ध परिमाणीकरण उद्देश्यों के लिए उपयोगी है क्योंकि यह अविशिष्ट गतिशीलता के लिए एक आंतरिक संदर्भ प्रदान करता है। अन्य प्रणालियों में, इस तरह के आंतरिक संदर्भ का होना संभव नहीं हो सकता है, इस मामले में सह-व्यक्त झिल्ली मार्कर के विपरीत मूल्य एक वैकल्पिक नियंत्रण प्रदान करेंगे।

संक्षेप में, हम उम्मीद करते हैं कि कार्यप्रणाली अन्य प्रणालियों पर लागू होती है और इसे विभिन्न उद्देश्यों के लिए तैनात किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक ही रिपोर्टर का उपयोग अन्य भड़काऊ सेटिंग्स में किया जा सकता है, जैसे कि संक्रमण सेटिंग्स या अन्य रोग मॉडल। ज़ेब्राफ़िश रिसेप्टर रिपोर्टर लाइनों के प्रदर्शनों की सूची को अन्य सिग्नलिंग रिसेप्टर्स में विस्तारित किया जा सकता है, सिग्नलिंग तंत्र को समझने या विवो में लिगैंड गतिशीलता की रिपोर्ट करने के लिए। दृष्टिकोण को नॉकडाउन / नॉकआउट तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि मनाया गतिशीलता के यांत्रिक आधार से पूछताछ की जा सके। उदाहरण के लिए, लिगैंड अभिव्यक्ति की गड़बड़ी मनाया रिसेप्टर गतिशीलता के लिए लिगैंड निर्भरता का संकेत दे सकती है। भविष्य में, हम परिकल्पना करते हैं कि पत्रकारों के नॉक-इन सम्मिलन को शामिल करने के लिए सिस्टम को और परिष्कृत किया जा सकता है। आखिरकार, इस पद्धति का उपयोग करने वाले निष्कर्ष जेब्राफ़िश समुदाय से परे मूल्यवान उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे, स्तनधारियों में इन सिग्नलिंग रिसेप्टर्स के संरक्षण और बड़े जीवों में इन अध्ययनों के संचालन की सापेक्ष चुनौती को देखते हुए।

Disclosures

लेखकों ने कोई हितों के टकराव की घोषणा नहीं की

Acknowledgments

हम Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ मदद के लिए क्रिस्टीन होल्ट और बिल हैरिस को धन्यवाद देते हैं। हम फ्लोरोसेंट टाइमर बैकबोन निर्माणों के लिए डैरेन गिल्मर और टॉल 2-लिज़ बैकबोन वेक्टर के लिए अन्ना हटेनलोचर को धन्यवाद देते हैं। हम Tg (mpx: GFP) i114 लाइन के लिए स्टीव रेनशॉ को धन्यवाद देते हैं। इस काम को MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] द्वारा समर्थित किया गया था; आइजैक न्यूटन ट्रस्ट [12.21 (ए)i] और एक आइजैक न्यूटन ट्रस्ट अनुदान 19.23 (एन)। सी.C एक एमआरसी डीटीपी छात्र द्वारा समर्थित था और आंशिक रूप से वेलकम ट्रस्ट [204845 / जेड / 16 / जेड] द्वारा; आइजैक न्यूटन ट्रस्ट [12.21 (ए)i] अनुदान। एचडब्ल्यू को एमआरसी डीटीपी स्टूडेंटशिप द्वारा समर्थित किया गया था। एचपी को वेलकम ट्रस्ट पीएचडी अनुदान (105391 / जेड / 14 / जेड) द्वारा और आंशिक रूप से वेलकम ट्रस्ट [204845 / जेड / 16 / जेड] द्वारा समर्थित किया गया था; आइजैक न्यूटन ट्रस्ट [12.21 (ए)i] अनुदान और एमआरसी (एमआर / एल019523 / 1)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea Sigma-Aldrich P7629-25G
50mL CellStar Centrifuge Tube Grenier Bio-One Limited 210270
Clark capillary glass Harvard Apparatus 30-0020
Cleanline Thin Bleach Scientific Laboratory Supplies CLE0301
Dissecting scope Nikon SMZ645
Dri Block heater Techne FDB02AD
Fiji National Institutes of Health, Bethesda, MD
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 Sigma-Aldrich F6521
Glass bottom microwell dishes MatTek P35G-1.5-14-C
Glass pasteur pipette Fisherbrand 11795098
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Invitrogen 10391175
Leica SP8 confocal microscope Leica N/A
Low melting point agarose Invitrogen 16520-100
Magnetic stand Narishige GJ-1
MATLAB The MathWorks, Inc., Natick, MA
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140-25G
MgSO4 Sigma-Aldrich M-2643
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956003
Micromanipulator Narishige M-152
Micropipette Puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Microscope slide Thermo-Scientific J1800AMNZ
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope Olympus N/A
Petri dish (120mm) Grenier Bio-One Limited 632180
Phenol red Sigma-Aldrich P0290-100ML
Poly(A) Tailing Kit Invitrogen AM1350
Prism GraphPad Software
Small paintbrush N/A
Spectral Applied Research LMM5 laser module N/A
Surgical Scalpel Blade No. 23 Swann-Morton 233-5528
Tricaine MS222 Sigma-Aldrich E10521-50G
Volocity software N/A
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner Yokogawa N/A

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 166 ज़ेब्राफ़िश केमोकाइन न्यूट्रोफिल घाव इमेजिंग माइक्रोस्कोपी
घाव प्रतिक्रियाओं के दौरान ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल में केमोकाइन रिसेप्टर्स की लाइव इमेजिंग
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Georgantzoglou, A., Coombs, C.,… More

Georgantzoglou, A., Coombs, C., Poplimont, H., Walker, H. A., Sarris, M. Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses. J. Vis. Exp. (166), e61679, doi:10.3791/61679 (2020).

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