Summary
هنا نصف بروتوكولات إجراء التصوير الحي والتحليل الكمي لديناميكيات مستقبلات الجاذب الكيميائي في عدلات أسماك الزرد
Abstract
توجيه الكريات البيض عن طريق التدرجات الكيميائية ضروري للاستجابات المناعية. العدلات هي الخلايا الأولى التي يتم تجنيدها إلى مواقع تلف الأنسجة حيث تقوم بتنفيذ وظائف حاسمة مضادة للميكروبات. يتم تنظيم الاتجار بهم إلى هذه المواقع من قبل العديد من الجاذبات الكيميائية الالتهابية ، بما في ذلك chemokines. على المستوى الجزيئي ، يتم تنظيم إشارات الجاذب الكيميائي من خلال الاتجار داخل الخلايا للمستقبلات المقابلة. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تؤثر التغيرات تحت الخلوية في مستقبلات الكيموكين على ديناميكيات هجرة الكريات البيض على مستوى الخلايا والأنسجة. هنا نصف منهجية للتصوير الحي والتحليل الكمي لديناميكيات مستقبلات الكيموكاين في العدلات أثناء الاستجابات الالتهابية لتلف الأنسجة. وقد كشفت هذه الأدوات أن الاتجار بمستقبلات الكيموكين التفاضلية في عدلات أسماك الزرد ينسق تجمع العدلات وتشتتها في مواقع تلف الأنسجة. هذا له آثار على فهمنا لكيفية حل الاستجابات الالتهابية ذاتيا. ويمكن استخدام الأدوات الموصوفة لفهم أنماط هجرة العدلات في مجموعة متنوعة من البيئات الفسيولوجية والمرضية، ويمكن توسيع نطاق المنهجية لتشمل مستقبلات إشارات أخرى.
Introduction
هجرة الكريات البيض لها أهمية قصوى للاستجابات المناعية. الخلايا المناعية هي خلايا مهاجرة نموذجية ، وهي قادرة بشكل ملحوظ على عبور الأنسجة والأوعية الدموية واستشعار مجموعة من إشارات التوجيه الكيميائي للهجرة في الاتجاه نحو الميكروبات أو الخلايا المضيفة الأخرى ذات الأهمية. يعتمد التوجيه الصحيح على التعرف على الجاذبات الكيميائية ، من بينها الكيموكينات التي تمثل الفئة1 الأبرز. يتم التعرف على الكيموكينات من خلال مستقبلات محددة للغاية من البروتين G عبر الغشاء المقترن. عند ربط الكيموكين ، تغير مستقبلات الكيموكين التشكيل مما يؤدي إلى تنشيط بروتينات G الثلاثية المرتبطة بها وانفصالها إلى وحدات فرعية وظيفية للإشارة تعزز التغيرات الهيكلية الخلوية والهجرة الموجهة1. ثانيا ، يتم فسفور مستقبلات الكيموكين ، ويؤدي هذا التعديل إلى إزالة الحساسية إلى الجاذب ، والذي يمكن أن يتبعه إعادة تحسس / إعادة تدوير سريعة أو تدهور داخل الخلايا وخفض التنظيم من سطح الخلية2. تؤثر ديناميكيات المستقبلات هذه على مدة وجرعة الإشارات التي تتلقاها الخلايا ولكن من الصعب توضيح كيفية تأثيرها على سلوك هجرة الكريات البيض في الجسم الحي.
يواجه تتبع ديناميكيات المستقبلات في الكريات البيض الحية في أنظمة الثدييات التقليدية العديد من التحديات. بالنسبة للدراسات الحية ، يجب التعبير عن اندماج المستقبلات مع البروتينات الفلورية في الخلايا. هذا أمر صعب في الكريات البيض الأولية ، وخاصة في العدلات ، وقد استخدمت الدراسات حتى الآن خطوط خلايا العدلات البديلة للتعبير عن مستقبلات الكيموكين 3,4. إن توليد نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، التي تعبر فيها الكريات البيض عن مستقبلات الفلورسنت أو المستقبلات المتحولة ذات عيوب الاتجار بالمعلومات 5,6 ، يستلزم استثمارا كبيرا في الوقت والموارد. حتى في هذه الحالات ، يمكن أن تكون دقة التصوير والتباين لديناميكيات مستقبلات التصوير في الحيوان الحي محدودة وقد استخدمت الدراسات الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام الأنسجة الثابتة5. وبالنظر إلى هذه التحديات التقنية، فإن فهمنا لكيفية تأثير ديناميكيات مستقبلات الجاذبات الكيميائية على سلوك الخلايا في بيئة الأنسجة الحية محدود حاليا.
هنا نقدم منهجية لرصد الاتجار بالمستقبلات في عدلات أسماك الزرد. الزرد قابل للسحب وراثيا ، مثل الفئران ، ولكن التحول أكثر وضوحا نسبيا من خلال استخدام أنظمة transposon الفعالة والتلاعب المباشر بالزيجوت7. اليرقة الشفافة قابلة للتصوير بشكل مثالي. تم تصور ديناميكيات مستقبلات الكيموكين في الخلايا الجرثومية البدائية والخط الجانبي البدائي من خلال التعبير عن الانصهارات المقابلة مع مراسلي الفلورسنت8،9،10. تم تجهيز يرقات أسماك الزرد بالعدلات الناضجة التي لها خصائص وراثية وخلوية محفوظة للغاية فيما يتعلق بالعدلات الثديية. تم تصور ديناميكيات الإشارات تحت الخلوية مثل ديناميكيات الهيكل الخلوي ومنظمات القطبية في هذه الخلايا عن طريق توليد خطوط معدلة وراثيا مقابلة11،12،13. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتصور وتحليل ديناميكيات مستقبلات الكيموكين وظيفيا في العدلات أثناء الاستجابات الالتهابية لتلف الأنسجة14. هنا ، نصف توليد خطوط المراسل المعدلة وراثيا لإشارات الكيموكين في العدلات ، وإعداد الأجنة للتصوير الحي ، وفحص الجرح لدراسة إشارات العدلات وبروتوكول الحصول على الصور وتحليلها. كما نقدم بروتوكولا جانبيا لاختبار استجابات مستقبلات الكيموكين للروابط المرشحة ، وهو أمر مفيد عند محاولة إنشاء أنماط التعرف على الليغاند في المستقبلات غير المميزة. يمكن استخدام هذه التقنيات بالاقتران مع المزيد من التلاعب الجيني ، مثل تثبيط تعبير الكيموكين الداخلي أو توليد المستقبلات المتحولة مع الاتجار المتغير الناجم عن الرباط ، لاستجواب كيفية تأثير ديناميكيات الإشارات المحددة على سلوك الكريات البيض في الجسم الحي. يمكن أيضا استخدام الخطوط المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستقبلات الكيموكين الموسومة بالفلورسنت كمراسلين لتدرجات الكيموكين الذاتية المنشأ ، والتي يصعب اكتشافها عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة المباشر. توفر المنهجية الموصوفة مجالا لتوسيع نطاق توليد المراسلين ليشمل مستقبلات أخرى للإشارات المناعية.
Protocol
ملاحظة: تم الاحتفاظ بجميع أسماك الزرد وفقا لإرشادات REACH ولوائح وزارة الداخلية البريطانية ، وقانون الحيوانات في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986.
1. توليد يرقات الزرد المراسل المعدل وراثيا لتصوير مستقبلات الاتجار في الكريات البيض
- قم بإنشاء بنية قائمة على Tol2 للتعبير المحدد عن الأنسجة للمستقبل الموسوم بالفلورسنت محل الاهتمام. بالنسبة للعدلات، استخدم تسلسلات المروج من الليزوزيم C15 والجين الميلوبيروكسيديز16. يمكن تصميم البنية كاندماج مع بروتين فلورسنت واحد (مثل GFP) ، أو مؤقت فلورسنت ترادف (على سبيل المثال ، GFP سريع الطي وعلامة أبطأ نضجاRFP 8,14,17) أو تعبير ثنائي المستقيم للمراسل GFP وعلامة غشاء التحكم9 (انظر المناقشة للاعتبارات عند اختيار النهج).
ملاحظة: لا تلخص هذه البنية المستويات الداخلية للتعبير عن المستقبلات ولكنها مفيدة للحصول على مستوى عال من التعبير عن المستقبلات في نوع الخلية محل الاهتمام. راجع الأدبيات المتعلقة بالمستقبلات المماثلة3،5،6،8،9،10،14 لاتخاذ قرار بشأن موضع علامة الفلورسنت. - قم بإنشاء خزان يحتوي على ذكور وإناث بالغين من النوع البري وفقا لممارسات التربية القياسية18 ، مفصولة بحاجز في اليوم السابق لتفريخ البيض.
- في يوم تفريخ البيض ، قم بإعداد خليط transgenesis للحقن المجهري الذي يحتوي على 12.5 نانوغرام / ميكرولتر من بنية الحمض النووي Tol2 و 17.5 نانوغرام / ميكرولتر من transposase mRNA7. ارفع الحواجز من خزانات الأسماك بعد فترة وجيزة من ظهور الأضواء في الصباح (قد يختلف هذا في مرافق الأسماك المختلفة) وجمع البيض في غضون 15 دقيقة لحقن الحمض النووي الريبوزي المرسال.
ملاحظة: تأكد من أن محلول الحمض النووي خال من الحمض النووي الريبوزي المرسال لتجنب تدهور الحمض النووي الريبوزي المرسال في الخليط. خيار للتحايل على هذا هو حقن البيض بمحاليل منفصلة من بناء Tol2 و transposase. - اتبع البروتوكولات القياسية للتحويل والحقن المجهري لبيض الزرد19.
- حقن 1 نانولتر من المحلول في خلية الأجنة ذات الخلية الواحدة.
ملاحظة: تكون نتائج التعبير أكثر اتساقا عند الحقن داخل الخلية والتخلص من الحقن التي قد لا تكون واضحة داخل الخلية. تهدف الأجنة ذات الخلية الواحدة إلى ذلك بسبب تباين حجم الحقن لكل خلية عند حقن أجنة مرحلة الخلية 2-16. سيكون الخيار هو فصل حقن مرحلة الخلية الواحدة عن دفعات الحقن اللاحقة ، في حالة وجود فعالية مختلفة لها. - تحقق من الأجنة المحقونة في وقت لاحق من اليوم وقم بإزالة البيض غير المخصب أو الميت للحفاظ على صحة القابض.
- في 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، تفحص اليرقات تحت المجهر الفلوري. ستكون العلامة مرئية في العدلات ، خاصة في الأنسجة المكونة للدم الذيلي (CHT) ، الغنية بهذه الخلايا.
ملاحظة: تختلف النسبة المئوية للخلايا المصنفة باختلاف البنيات، ولكن من المتوقع عادة أن يعبر 20-60٪ من العدلات عن البنية. عادة ما تتنبأ النسب المئوية المنخفضة بمزيد من الفحص في مرحلة البلوغ. ومن الممارسات الجيدة أيضا التحقق من التوطين الصحيح للمستقبل في الغشاء، مع اتباع نهج تصوير عالي الدقة، في عينة من هذه الأجنة قبل زراعة الأسماك. - تنمو يرقات إيجابية باتباع ممارسات التربية القياسية20. هذه تمثل جيل F0.
- في عمر 3 أشهر ، قم بفحص أسماك F0 للمؤسسين. عبور الأسماك الفردية مع نوع بري غير معدل وراثيا وفحص ذريتها في 3 dpf للتعبير عن المستقبل من خلال العرض تحت نطاق تشريح. اعتمادا على نجاح التكوين ، والذي يختلف مع كل بناء ، لاحظ نسبة مئوية من النسل الإيجابي في مجموعة فرعية من الصلبان.
ملاحظة: من أجل التحول الجيد ، فإن حوالي ثلث إلى نصف البالغين سيعطون ذرية إيجابية. تختلف النسبة المئوية للنسل الإيجابي في القابض باختلاف عدد نسخ الجينات المحورة التي تم إدخالها ، ويمكن أن تتراوح بين 10-60٪. من المفيد تتبع نسب المندلية داخل القوابض لتحديد الوراثات الجينية أحادية الإدخال (يتم تحديدها بسهولة أكبر في قوابض F2 من خلال البحث عن نسبة 50٪ من اليرقات الإيجابية)20. - تنمو النسل الإيجابي ، والتي تمثل جيل F1.
- في عمر 3 أشهر ، قم بفحص البالغين F1 بنفس الطريقة لإنشاء خط F2 معدل وراثيا مستقر.
- قم بإجراء تجارب على يرقات F2 بعد التحقق من صحة التعبير الخاص بالعدلات للجين المحور.
ملاحظة: أثناء عملية التكوين ، قد يلاحظ المرء مستويات متفاوتة من التعبير عن المستقبلات ومن المستحسن الاحتفاظ ببراثن مختلفة معدلة وراثيا للحصول على مستوى التعبير الأنسب للأسئلة البيولوجية. يمكن الحصول على النتائج الأولية في يرقات F0 أو F1.
2. جمع أجنة الزرد لتقييم استجابات جرح الكريات البيض
- بعد إنشاء خط مراسل مستقر معدل وراثيا ، قم بإعداد تقاطع بين الأسماك المعدلة وراثيا البالغة والإناث وجمع البيض في صباح اليوم التالي.
- تنمو الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في وسط E3 (أو ماء البيض18).
- اختياريا، عند 24 حصانا، احتضن الأجنة في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 50 مل من وسط E3 مع تستكمل بمبيض 0.003٪ لمدة 5 دقائق. شطف بعد ذلك 3 مرات في وسط E3 عن طريق ترك الأنبوب يقف لبضع دقائق للسماح للأجنة بالاستقرار في القاع ثم صب واستبدال الوسط.
ملاحظة: يوفر هذا مستوى من التحكم في تعرض اليرقات للعدوى ، مما قد يؤثر على سلوك الكريات البيض أثناء الجرح. - بعد التبييض ، احتفظ بالأجنة في وسط E3 مع استكمال 0.003٪ من 1-phenyl-2-thiourea لمنع تخليق الميلانين. لا يضاف الميثيلين الأزرق ، الذي يستخدم غالبا لمنع الالتهابات الفطرية ، هنا ، لتقليل التألق الذاتي للأنسجة.
- اسمح لليرقات بالفقس بشكل طبيعي واستخدمها عند 3 dpf عندما تكون العدلات وفيرة21.
3. جرح الزعنفة البطنية لليرقات
- إعداد اليرقات للجرح. استخدم اليرقات عند 2.5-3.5 dpf ، عند ملاحظة العدلات الوفيرة. نقل اليرقات إلى وسط E3 مع استكمال 160-200 ملغ / لتر تريكاين MS222.
ملاحظة: يجب تحضير المحاليل المركزة من التريكاين وتجميدها في الأليكوتات مقدما وإذابتها في اليوم. - اترك اليرقات في وسط E3 + tricaine لمدة 15 دقيقة لضمان تخديرها. تحقق من استجاباتهم عن طريق اللمس بلطف باستخدام فرشاة طلاء صغيرة أو أداة مماثلة.
- حدد اليرقات ذات التعبير عن المستقبلات المعدلة وراثيا تحت نطاق تشريح الفلورسنت.
- نقل اليرقات إلى طبق بتري 120 ملم في E3 + tricaine للجرح. باستخدام مشرط معقم قطع الزعنفة البطنية لليرقة ، مع ملاحظة تحت نطاق تشريح (الشكل 1).
ملاحظة: الفكرة هي إجراء قطع عميق بما فيه الكفاية للتسبب في تجنيد العدلات بشكل كبير ولكن دون قطع أوعية CHT. يتم إجراء القطع عموديا على محور CHT بحيث يصل الشق تقريبا إلى أوعية CHT. يتطلب هذا بعض الممارسة ويجب أولا القيام به مع الإشراف على اليرقات التي لم يتم إنشاؤها لهذا الغرض (على سبيل المثال ، اليرقات الزائدة من تجربة أخرى).
4. إعداد اليرقات للتصوير الحي
- قم بإذابة الأغاروز منخفض درجة الانصهار (LMP) في وسط E3 عن طريق التسخين للحصول على محلول أغاروز سائل بنسبة 2٪.
- اسمح لهذا الحل أن يبرد إلى 60 درجة مئوية.
ملاحظة: احتفظ بقارورة أو أنبوب مع الأغاروز في حاضنة عند 60 درجة مئوية لتجنب إعداد الأغاروز بين تركيب يرقات مختلفة. - ماصة 0.5 مل من السائل LMP + E3 في طبق قاع زجاجي للتصوير المجهري.
- ماصة يرقة الزرد المصابة والمخدرة جنبا إلى جنب مع 0.5 مل من E3 + 2x Tricaine في طبق القاع الزجاجي.
- امزج الحلين بلطف للحصول على محلول 1٪ LMP / 1x Tricaine agarose / E3 ، وتجنب توليد الفقاعات. قم بتوجيه الجنين أفقيا وادفع بلطف لأسفل بحيث يكون الجزء الذيلي من الأسماك أقرب ما يمكن إلى الزجاج.
ملاحظة: يجب أن يكون النسيج المراد تصويره أقرب ما يمكن إلى القاع الزجاجي عند التصوير باستخدام مجهر مقلوب. يجب أن يكون إعداد اتجاه اليرقة سريعا بحيث لا يتم تعيين الأغاروز قبل وضع اليرقات. - دع محلول الأغاروز يبرد ويتصلب لمدة 5-10 دقائق. اختبر ما إذا كان يتم ضبط الأغاروز عن طريق لمس هلام الأغاروز بلطف باستخدام فرشاة طلاء صغيرة أو طرف.
- بمجرد أن يصبح الأغاروز صلبا ، أضف 2 مل من E3 مكملا ب 0.2 ملغ / مل من التركائين إلى لوحة التصوير.
5. التصوير البؤري الحي
ملاحظة: صورة للأجنة على قرص دوار مجهر بؤري أو ما يعادله (الشكل 2). يمكن أيضا استخدام المجهر الماسح الضوئي بالليزر ولكن الدقة الزمنية للديناميكيات ستكون أكثر تقييدا. قم بإعداد إعدادات التصوير قبل إحضار اليرقة المصابة ، بحيث يمكن تصوير الاستجابة في أسرع وقت ممكن بعد الجرح. تصل العدلات إلى الجرح في غضون 5 دقائق وقد تستوعب المستقبلات في الخلايا القادمة الأولى خلال هذا الإطار الزمني. مع الممارسة ، من الممكن التصوير في وقت مبكر من 15 دقيقة بعد الجرح.
- قم بتشغيل المجهر: الليزر والكاميرا والكمبيوتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- استخدم برنامج الاكتساب لإعداد إعدادات التصوير. اختر أشعة الليزر للفلوروفورات المناسبة وأوقات التعرض التقريبية بناء على التجارب السابقة (احصل على GFP مع 488 نانومتر و tagRFP مع ليزر 561 نانومتر).
- انقل الصفيحة مع الجنين المثبت ، في أقرب وقت ممكن بعد مجموعات الأغاروز ، إلى منصة قرص الدوران التصويري البؤري.
- استخدم قطعة عين المجهر للعثور على الأسماك في الطبق باستخدام عصا التحكم المسرحية.
- ركز على منطقة الجرح، باستخدام مقبض التركيز.
ملاحظة: للعثور على مجال الاهتمام ، قد يكون من الأسهل استخدام هدف جوي منخفض التكبير (10x). - حدد الحقل المراد تصويره حول الجرح. استخدم هدفا 30x/40x مع فتحة عدسة رقمية عالية للحصول على دقة كافية.
- استخدم أزرار البرامج لضبط وقت التعرض بحيث يمكن رؤية علامة الفلورسنت بتباين جيد ولكن دون تشبع الإشارة.
ملاحظة: يجب أن يكون وقت التعرض منخفضا قدر الإمكان لتقليل التعرض للفلورسنت وزيادة الدقة الزمنية إلى أقصى حد في الفاصل الزمني. تعتمد طاقة الليزر على حالة الليزر ولكن يجب تعديلها إلى مستوى يسمح بوقت تعرض منخفض بما يكفي للتصوير الديناميكي. - استخدم أزرار البرامج لتحديد مستوى الصوت المراد تصويره كمكدس z
- قم بإعداد فاصل زمني كل 30 ثانية للمدة المطلوبة.
ملاحظة: بالنسبة لجروح الزعانف البطنية المعقمة ، يتم ملاحظة الحد الأقصى للتجنيد بمقدار 2-3 ساعات. - قبل بدء الفاصل الزمني، التقط لقطة حقل ساطعة لتوثيق مجال الرؤية. إذا كان ذلك ممكنا ، احصل على حقل ساطع داخل فيلم الفاصل الزمني.
6. القياس الكمي لاستيعاب المستقبلات في عدلات أسماك الزرد
- سجل الفاصل الزمني لاكتساب الصورة وحجم البكسل للصورة. احتفظ بسجل لعدد الدقائق التي بدأ فيها التصوير بعد الإصابة.
- افتح مجموعات بيانات الصور باستخدام فيجي عن طريق سحب الصورة إلى واجهة البرنامج ، وحدد إطارا تمثيليا للاهتمام لكل مجموعة بيانات باستخدام شريط تمرير الوقت ، على سبيل المثال ، في 1-1.5 ساعة بعد الجرح ، واحفظه.
- تابع مع MATLAB لمعالجة مجموعة بيانات الصورة.
- قم بإنشاء برنامج نصي جديد وقم بتضمين وظائف لقراءة الصور (السطر 6 في البرنامج النصي يسمى "select_neutrophils.m" للتعريف المركزي في الملف التكميلي 1) والفتح (السطر 11 في الملف التكميلي 1) والاختيار اليدوي للنقاط على الصورة (السطر 12 في الملف التكميلي 1).
- افتح إطار الاهتمام عن طريق تشغيل هذا البرنامج النصي (الملف التكميلي 1) ، وحدد العدلات لتحليلها عن طريق الفحص البصري ، وانقر عليها وسجل تقديرا لسنترويدات ، سواء في جرح الزعنفة البطنية أو في CHT.
ملاحظة: العدلات غير المعبأة في CHT بمثابة مرجع داخلي للعدلات التي يظل توزيع مستقبلاتها ثابتا. هذا يسمح بتطبيع قيم التباين للخلايا في الجرح إلى مرجع داخلي. - تابع تجزئة العدلات في كل إطار باستخدام تقنية الخطوط النشطة22 كما هو موضح في الخطوات أدناه.
- إنشاء وظيفة لتضمين البيانات الوصفية المطلوبة للتجزئة حسب الخطوط النشطة (أي عدد التكرارات ، وتحيز الكفاف ، والمركز المقدر ، وما إلى ذلك) 22 (انظر 'بيانات الجرح.m' في الملف التكميلي 2).
- قم بإنشاء برنامج نصي يستدعي الدالة "wound_data.m" لإدخال المعلومات اللازمة لتجزئة كل عدلة (السطر 28 في البرنامج النصي يسمى "calc_contrast.m" في الملف التكميلي 3).
- قم بتضمين أوامر البرنامج النصي لقراءة الصور (السطر 32 في الملف التكميلي 3).
- أضف توليد صورة سوداء (أي صورة تكون فيها قيم البكسل أصفارا) بحجم مساو لصورة الإدخال (السطر 44 في الملف التكميلي 3) وتعريف مربع من 10 × 10 بكسل حول المركز المركزي لكل عدلة (السطر 45 في الملف التكميلي 3).
- قم بتضمين تجزئة العدلات باستخدام الخطوط النشطة (الأسطر 48-49 في الملف التكميلي 3) وإزالة الأجسام الصغيرة المكتشفة خطأ (السطر 52 في الملف التكميلي 3).
ملاحظة: كفاف التجزئة الأولي هو المربع حول السنترويد ، والذي يتطور بواسطة تقنية الكفاف النشط بناء على كثافة البكسل وعدد التكرارات وانحياز المحيط. نتيجة التجزئة هي قناع ثنائي حيث يكون لجميع وحدات البكسل قيمة 0 بصرف النظر عن منطقة العدلة التي يكون لوحدات البكسل قيمة 1. - قم بتضمين ضرب الصورة الثنائية المجزأة مع الصورة الأصلية للحصول على كثافة البكسل للعدلة فقط ، مع كون بقية الصورة ليست رقما ، بحيث لا تساهم في العمليات الحسابية (الأسطر 56-57 في الملف التكميلي 3).
- أضف حساب مصفوفة الحدوث المشترك ذات المستوى الرمادي لكل عدلة (GLCM)14,23 (السطر 61 في الملف التكميلي 3). GLCM هو تمثيل آخر للصورة يظهر الموضع النسبي للبكسل من حيث كثافة البكسل.
- قم بتضمين حساب تباين العدلة استنادا إلى GLCM (الأسطر 62,65 في الملف التكميلي 3). يقيس مقياس التباين الاختلافات في الكثافة بين وحدات البكسل المجاورة. تتم مقارنة وحدات البكسل مع وحدات البكسل على مسافة معينة ، والتي يمكن تعديلها تجريبيا بناء على حجم القمم المحلية في الكثافة. كمؤشر ، بالنسبة للصور ، بحجم بكسل يبلغ 0.389 ميكرومتر ، عندما أظهر المستقبل توزيعا حويصليا ، كانت كل نقطة مضيئة في حدود 5 بكسل. لذلك ، تمت مقارنة الكثافات بالبكسل المتباعدة بمقدار 5 بكسل.
- أضف أوامر لحفظ القيم بشكل منفصل للعدلات الفردية في الزعنفة البطنية (السطر 68 في الملف التكميلي 3).
- قم بتضمين حساب متوسط قيمة تباين العدلات من جميع العدلات CHT بنفس الطريقة التي تم بها حساب العدلات عند الجرح (الأسطر 72-119 في الملف التكميلي 3). بالنسبة للعدلات CHT ، اتصل بالدالة "cht_data.m" (السطر 77 في الملف التكميلي 4).
- قم بتضمين تطبيع قيمة التباين للعدلات الفردية عند الجرح إلى متوسط تباين العدلات CHT المحسوبة أعلاه في الخطوة 6.16 (أي القسمة) (السطر 122 في الملف التكميلي 3). وهذا يعطي تباينا طبيعيا يعكس مدى "نقطة" مظهر المستقبلات في الخلايا الفردية المستجيبة بالنسبة للخلايا غير المستجيبة للتحكم (الشكل 3 والشكل 4).
- قم بتشغيل البرنامج النصي (الملف التكميلي 3) بالنقر فوق رمز التشغيل في البرنامج.
- كرر كافة الخطوات لظروف مختلفة.
- استخدم برنامجا إحصائيا (انظر جدول المواد) لاستيراد النتائج للظروف المختلفة عن طريق إنشاء جدول أعمدة ورسم النتائج وإجراء اختبار إحصائي للتحقق من دلالة الفرق بين القيم المتوسطة.
ملاحظة: يمكن أيضا العثور على رموز التحليل في GitHub في https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. مقايسات استجابة الكيموكين في الأجنة المبكرة
ملاحظة: هذه تجربة جانبية اختيارية تسمح باختبار تغيرات توزيع المستقبلات استجابة لكيموكين مرشح وهي مستقلة عن التجارب الموضحة أعلاه فيما يتعلق بتعبير العدلات لبنى المستقبلات. من الصعب تحديد الاختلافات في الاتجار الناجم عن الرباط بين المستقبلات باستخدام هذه التقنية لأن مستويات الليغاند تشبع14. ومع ذلك ، إذا رأى المرء استيعاب الليغاند لمستقبل في هذا النظام ، فقد يكون هذا مؤشرا على أن الليغاند يتم التعرف عليه من قبل المستقبل في الحالات التي تكون فيها هوية الليغاند غير واضحة. هذا مفيد ، لأن التعبير عن مستقبلات الكيموكين في خطوط الخلايا الثابتة مثل خلايا HEK293T14 يمكن أن يكون مرهقا.
- قم بإعداد صليب من الأسماك البرية (على سبيل المثال ، AB) وجمع البيض في صباح اليوم التالي بعد فترة وجيزة من رفع الفواصل (كما هو موضح أعلاه).
- حقن 100 بيكوغرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال الموسوم بالفلورسنت (على سبيل المثال، Cxcr1-FT)، جنبا إلى جنب مع 100 بيكوغرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال لعلامة غشاء (على سبيل المثال، غشاء CFP). تضمين في الخليط جرعات مختلفة من الحمض النووي الريبوزي المرسال ل chemokine ligand.
ملاحظة: كمؤشر 150 pg Cxcl8a mRNA أعطى استيعابا بارزا للفلورسنت Cxcr1-FT (انظر الشكل 5). - اشطف الأجنة بوسط E3 واحتضنها عند 28 درجة مئوية.
- عند حوالي 7 hpf ، اختبر التعبير عن mRNA على نطاق تشريح الفلورسنت وحدد الأجنة لتصويرها.
- تحضير 0.8 ٪ LMP agarose مقدما والاحتفاظ بها في أنبوب زجاجي في كتلة حرارية عند 60 درجة مئوية. استخدم ماصة زجاجية للتلاعب بالأجنة. قم بإزالة الأجنة بلطف باستخدام زوج من الملقط في كل يد.
- قم بشفط جنين فردي منزوع الصبغة باستخدام ماصة زجاجية لضمان عدم وجود فقاعات في الطرف. حرر الجنين بلطف في أنبوب الأغاروز مما يسمح له بالغرق في الأنبوب.
- استنشاق الجنين من أنبوب الأغاروز ، وجمع بعض الأغاروز السائل على طول الطريق. حرري الجنين بلطف في وسط طبق تصوير ذو قاع زجاجي. قم بتدوير الجنين بسرعة بحيث يواجه القطب الحيواني الجزء السفلي من الطبق (يجب أن يكون هذا الجانب الأقرب إلى الهدف عند استخدام المجهر المقلوب).
ملاحظة: قد يحتاج المرء إلى إعادة ضبط اتجاه الأجنة بينما لا يزال الأغاروز قيد الإعداد. - بعد تعيين الأغاروز ، تكملة مع 2 مل من E3 المتوسطة.
ملاحظة: الأجنة في هذه المرحلة هشة للغاية بالمقارنة مع اليرقات ويتطلب الأمر بعض الممارسة لإزالة الهوريونيات وتركيبها. من المهم الشفط والإفراج بلطف قدر الإمكان ، لتجنب تمزق الجنين. - كرر العملية التي تهدف إلى تحميل 3-5 أجنة لكل طبق.
- صورة للأجنة على مجهر بؤري مقلوب (انظر جدول المواد). استخدم هدف نفطي 40x/1.3 NA للحصول على دقة عالية بما فيه الكفاية. تصور mCFP و sfGFP و tagRFP باستخدام 405 و 488 و 552 نانومتر على التوالي على النطاق. اضبط الفلاتر والإعدادات للحصول على تباين عال مع تجنب التشبع وتقليل التسرب بين القنوات.
- كرر التركيب والتصوير لظروف مختلفة.
Representative Results
يتبع جرح الزعنفة البطنية تعبئة العدلات السريعة من CHT إلى الزعنفة البطنية والتجمع على هامش الجرح ، في غضون 30-60 دقيقة (الشكل 1). لقد تصورنا توزيع اثنين من مستقبلات الكيموكين ، Cxcr1 و Cxcr2 ، والتي يتم التعبير عنها بواسطة عدلات الزرد24 والتعرف على Cxcl8a و Cxcl8b14 ، باستخدام المجهر البؤري للقرص الغزل. لقد أنشأنا خطين معدلين وراثيا مطابقين ، Tg (lyz: Cxcr1-FT) و Tg (lyz: Cxcr2-FT) ، حيث تعبر العدلات عن بناء مؤقت الفلورسنت (FT) للمستقبل ، أي اندماج مع ترادف من sfGFP و tagRFP (الشكل 2 والمرجع14). كان الهدف من استخدام اثنين من الفلوروفورات هو السماح بمراقبة مجموعة واسعة من مصائر المستقبلات وتقديم تقديرات لوقت دوران البروتين في غشاء البلازما ، حيث أن المستقبلات المركبة حديثا سوف تتألق باللون الأخضر وتصبح حمراء تدريجيا مع تقدم عمرهافي 8,14. ومع ذلك ، فقد وجد أن هذه المستقبلات لها دوران تأسيسي سريع في غشاء البلازما العدلة وأن وقت الإقامة كان أقصر من وقت نضج tagRFP ، حيث أظهر sfGFP توطين الغشاء و tagRFP يظهر توطين الحويصلات في حالة ثابتة (الفيديو التكميلي 1 والمرجع14). لذلك ، ركزنا على توزيع sfGFP لمراقبة الاستيعاب الناجم عن الليغاند في مواقع تلف الأنسجة. تم تحديد نمط توزيع المستقبلات كميا باستخدام مقياس التباين ، الذي يبلغ عن الاختلافات في الكثافة بين وحدات البكسل المجاورة. الأساس المنطقي هو أنه عندما يكون توزيع المستقبلات غشائيا وسلسا ، تكون قيمة التباين منخفضة. عندما يكون توزيع المستقبلات حويصليا وأكثر ثقبا ، تكون قيمة التباين عالية (الشكل 3).
وهناك طريقة بديلة تتمثل في تحديد نسبة مستويات المستقبلات (شدة sfGFP) على مستويات علامة غشاء التحكم مثل غشاء CFP (mCFP) (الشكل 3). يمكن لكلتا الطريقتين اكتشاف استيعاب المستقبلات ، كما هو موضح في نمط توزيع المستقبلات الحويصلية على مستوى العالم في الخلية (قيمة تباين أعلى) أو انخفاض مستويات المستقبلات في الغشاء (انخفاض نسبة sfGFP / mCFP). ومع ذلك، يمكن لمقياس التباين أيضا الكشف عن استيعاب المستقبلات في مجموعات العدلات عند الجرح، حيث يكون تجزئة الغشاء أقل دقة وغير قابلة للتطبيق (الشكل 3). باستخدام هذا المقياس، تمكنا من تحديد الاختلافات المرئية بين Cxcr1 و Cxcr2 في الاتجار بالعدلات عند الجروح (الشكل 4 والفيديو التكميلي 2). Cxcr1-FT داخليا في الخلايا الموجودة في الجرح بينما ظل Cxcr2-FT غشائيا في العدلات عند الجرح (الشكل 4A-C ، الفيديو التكميلي 2 والفيديو التكميلي 3). قمع Cxcl8a و Cxcl8b ، من خلال العلاج المورفولينو ، يؤثر بشكل تفاضلي على استيعاب Cxcr1-FT في الجروح (الشكل 4C ، D). لمزيد من التحقق من أن Cxcr1-FT يستجيب ل Cxcl8a ، أجرينا اختبارات استجابة chemokine في الأجنة المبكرة. وجدنا أن Cxcr1-FT تم استيعابه بشكل ملحوظ في الأجنة التي تم فيها التعبير عن Cxcl8a بشكل مشترك (الشكل 5). تشير هذه النتائج إجمالا إلى أنه يمكن نشر الطرق الموصوفة لقياس استيعاب المستقبلات التي يسببها الكيموكين في العدلات وتحديد هوية الليغاند الذي يتوسط في هذه الآثار.
الشكل 1: هجرة العدلات إلى جروح الزعانف البطنية. (أ) (يسار) رسم كاريكاتوري ليرقة 3 dpf يوضح موقع النسيج المكون للدم الذيلي (CHT) ، والدورة الدموية في الزهرة (VC ، الأزرق) ، والزعنفة البطنية (VF) وموقع الجرح. (يمين) رسم كاريكاتوري يصور منطقة الجرح (W) مع العدلات التي يتم تعبئتها من CHT وتتجمع عند الجرح. يتم رسم الضفيرة الوريدية الذيلية (CVP) لأنسجة CHT باللون الأزرق. (ب) صورة المجال الساطع (يسار) والإسقاط البؤري (يمين) تظهر جرح الزعنفة البطنية وتوزيع العدلات في يرقات Tg (mpx: GFP) عند 2 ساعة بعد الجرح. تظهر الخطوط المتقطعة الخطوط العريضة VF و CHT. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. صورة كرتونية وفلورسنت معدلة من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير الحي للاتجار بمستقبلات الكيموكين في العدلات. (أ) التركيبات المستخدمة للتعبير الوراثي الخاص بالعدلات ل Cxcr1-FT (مؤقت الفلورسنت) و Cxcr2-FT. الإسقاطات البؤرية للعدلات في رأس يرقة معدلة وراثيا 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT) ، أعلى ؛ Tg(lyz:Cxcr2-FT)، أسفل) تعرض قنوات tRFP (أرجواني) وsfGFP (أخضر). شريط المقياس = 20 ميكرومتر (ب) مخطط تشريحي من يرقة 3 dpf كما في الشكل 1A. أسفل اليرقة توجد مخططات تصور منطقة الجرح (W) مع العدلات التي يتم تعبئتها من CHT (أعلى) أو إجراء التاكسي الكيميائي عند دخول الزعنفة البطنية (أسفل). يشير المربع المتقطع إلى المساحة التي تم تصويرها في لقطات على اليمين. (ج) العدلات في يرقات Tg(lyz:Cxcr1-FT) (يظهر sfGFP) عند التعبئة من CHT (الألواح العلوية) أو التاكسي الكيميائي نحو الجرح (الألواح السفلية). تعرض الأسهم الخلايا نفسها بمرور الوقت. النقاط الزمنية على الصورة اليمنى هي دقائق منقضية بعد الصورة على اليسار. شريط المقياس = 10 ميكرومتر (D) التمثيل التخطيطي للنهج التجريبي للتصوير الحي للاتجار بمستقبلات الكيموكين. () عدلت اللوحات من ألف إلى جيم من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أمثلة كمية لديناميكيات المستقبلات. تم تقسيم العدلات المفردة (الزرقاء) أو العنقودية (الخضراء) عند الجروح أو العدلات غير المعبأة في CHT (الأحمر والبرتقالي) وتحليلها بطرق مختلفة لمقارنة النتائج. تم تحليل نفس الخلايا النموذجية المعروضة بطريقتين لربط ما يظهر في الصورة بنطاق القيم المستخرجة. (أ) تم تقسيم سطح الخلايا النموذجية المختارة استنادا إلى تعريف الكفاف في قناة sfGFP. (ب) تم حساب التباين من الخلايا النموذجية الموضحة في A. (C) تم تقسيم غشاء الخلايا النموذجية المختارة بناء على تعريف الكفاف في قناة CFP. وتبع ذلك تحليل نسبي ل sfGFP / CFP. (د) تم حساب نسبة sfGFP/CFP على الخلايا النموذجية المبينة في C. تمثل أشرطة الخطأ S.E.M. من الخلايا الفردية، وفي حالات n>1، لم تستخدم القيم هنا للتحليل الإحصائي ولكن فقط لتجسيد القياسات التي تم الحصول عليها باستخدام طرق القياس الكمي المختلفة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. () عدل الشكل من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الديناميات التفاضلية ل Cxcr1 و Cxcr2 استجابة للجرح. (أ) الإسقاط البؤري للعدلات في يرقات Tg(lyz:Cxcr1-FT) أو Tg(lyz:Cxcr2-FT) عند الجرح في 80 دقيقة بعد الجرح (قناة sfGFP المعروضة). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) عدلة Cxcr1-FT مكبرة (يسار) و Cxcr2-FT (يمين) عند الجرح. يظهر المستقبل الأخضر باللون الرمادي. شريط المقياس = 5 ميكرومتر (C) التباين الطبيعي (التباين لكل عدلة فردية يتم تطبيعه إلى متوسط تباين الخلايا غير المعبأة في CHT). يشير cxcl8a إلى حقن حجب الوصلة مع مورفولينو مانع للترجمة ل cxcl8a. يشير cxcl8b إلى الحقن باستخدام مورفولينو مانع للوصلة ل cxcl8b. بالنسبة ل Tg(lyz:Cxcr1-FT): n = 24 خلية (CHT) ، n = 47 خلية (جرح) من 8 يرقات. بالنسبة ل Tg (lyz: Cxcr1-FT) مع المورفولينوهات: n = 28 خلية (Cxcl8a-MO) من 5 يرقات ، n = 16 خلية (Cxcl8b-MO) من 5 يرقات. بالنسبة ل Tg(lyz:Cxcr2-FT): n = 10 خلايا (CHT) و n = 20 خلية (جرح) من 3 يرقات. تم تجميع البيانات من يرقات مستقلة تم الحصول عليها في 1-5 جلسات تصوير. اختبار Kruskal-Wallis مع اختبار المقارنات المتعددة من Dunn ل Tg (lyz: Cxcr1-FT) ، اختبار Mann-Whitney غير المقترن ثنائي الذيل ل Tg (lyz: Cxcr2-FT). (د) الإسقاط البؤري للعدلات في اليرقات المعدلة وراثيا Tg(lyz:Cxcr1-FT) المعالجة ب cxcl8a morpholino (MO) (يسار) و cxcl8b MO (يمين) استجابة لجروح الزعانف (قناة sfGFP الموضحة باللون الأخضر). لقطة تم التقاطها في نقاط زمنية لتراكم العدلات المكافئة (85 دقيقة بعد الجرح في الصورة اليسرى و 45 دقيقة بعد الجرح في الصورة اليمنى). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. () عدل الشكل من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: فحص استجابة الكيموكين في الأجنة المبكرة. تم حقن شرائح متحدة البؤرة للمسح الضوئي بالليزر من الأجنة المعدة التي تظهر التعبير عن وتوزيع Cxcr1-FT. 100 pg من Cxcr1-FT mRNA في بيض واحد في مرحلة الخلية مع أو بدون 150 pg Cxcl8a mRNA. تظهر المستقبلات الخضراء والحمراء في قنوات منفصلة. تظهر علامة CFP غشاء التحكم (mCFP) في القناة السماوية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. () عدل الشكل من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم التكميلي 1: العدلات المعدلة وراثيا في رأس يرقة Tg(lyz:Cxcr1-FT) (يسار) و Tg(lyz:Cxcr2-FT) (يمين) عند 3 dpf. sfGFP (أخضر)، tagRFP (أرجواني). الفاصل الزمني للإطار هو 30 ثانية ومعدل الإطارات هو 5 إطارات في الثانية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. ينشأ الفيديو من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الفيلم التكميلي 2: العدلات في Tg(lyz:Cxcr1-FT) (يسار) و Tg (lyz:Cxcr2-FT) (يمين) يرقات معدلة وراثيا تستجيب لجروح الزعانف. يبدأ الفيلم في غضون 10 دقائق بعد الجرح ويستمر لمدة 60 دقيقة. sfGFP (أخضر) ، tagRFP (أرجواني). الفاصل الزمني للإطار هو 30 ثانية ومعدل الإطارات هو 10 إطارات في الثانية. CHT = الأنسجة المكونة للدم الذيلي. VF = الزعنفة البطنية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. ينشأ الفيديو من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الفيلم التكميلي 3. أمثلة إضافية على العدلات من يرقة معدلة وراثيا Tg(lyz:Cxcr1- FT) مصابة (يرقة مختلفة عن تلك الموضحة في الفيديو 2) ، تم الحصول عليها بدقة أعلى ، تظهر استيعاب المستقبلات (قناة sfGFP الموضحة باللون الأخضر) عند التعبئة في CHT أو عند الدخول و chemotaxis في الزعنفة البطنية. الفاصل الزمني للإطار هو 30 ثانية ومعدل الإطارات هو 2 إطارا في الثانية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. ينشأ الفيديو من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الملف التكميلي 1: يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
تسمح الطريقة الموصوفة بالتصوير الحي لديناميات المستقبلات استجابة للروابط الداخلية في الموقع أثناء الاستجابة الالتهابية لتلف الأنسجة. يمكن توسيع استخدام مراسلات العدلات Cxcr1 / Cxcr2 ليشمل إعدادات فسيولوجية أخرى ، مثل العدوى أو نماذج الأورام أو أنواع أخرى من تلف الأنسجة14،25،26،27. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر خطوط الإنقاذ المعدلة وراثيا، التي يتم فيها قمع المستقبل الداخلي وإنقاذه بواسطة مستقبل متحور خارجي، أدوات مفيدة لتشريح أهمية أنماط هجرة العدلات المحددة في الاستجابات المناعية. على سبيل المثال ، تسبب طفرات مستقبلات Cxcr1 التي أضعفت إزالة الحساسية تجمعا أكثر بروزا في العدلات في المواقع الالتهابية14. يمكن استخدام هذا الكسب من النمط الظاهري الوظيفي لفهم دور تجمع العدلات في العمليات الفسيولوجية المختلفة ، على سبيل المثال ، إصلاح الجروح ، والأمراض المعدية ، أو تطور الورم ، واستكمال تجارب الضربة القاضية / الضربة القاضية للمستقبلات. وتوفر المنهجية أيضا أساسا لتوسيع نطاق المراسلين المتاحين. من المهم النظر في اختيار مراسل الفلورسنت ويعتمد على السؤال البيولوجي. وجدنا أن معدل الدوران التأسيسي لمستقبلات الكيموكين هذه في العدلات كان مرتفعا ، مقارنة بالخلايا الظهارية ، وأن المراسلين ذوي النضج السريع (على سبيل المثال ، sfGFP) كانوا مطالبين بالإبلاغ عن مستويات الغشاء في حالة ثابتة وحل الاختلافات حول تحفيز العدلات 8,14. وبالتالي ، فإن نسب الغشاء من sfGFP / tagRFP لا تنطبق على قياس الاستيعاب الناجم عن الليغاند في هذا النوع من الخلايا ، ولكن نمط tagRFP يسمح بتتبع المصائر داخل الخلايا للمستقبل ، والتي قد تكون مفيدة في بعض الدراسات. وجدنا أيضا أن الإشارة داخل الخلايا الأكثر تركيزا من tagRFP مفيدة لفحص اليرقات الفردية. وهناك نهج بديل لقياس مستويات المستقبلات في غشاء البلازما يتمثل في التعبير المشترك عن علامة غشاء الفلورسنت في العدلات إما في نفس الجين المحور9 أو في الجين14 المستقل المتحول. في السيناريو الأول ، سيوفر الجين المحور وسيلة إضافية لفحص الأسماك وستكون مستويات التعبير قابلة للمقارنة بين العلامة والمستقبل. سيكون النهج الأخير أكثر معيارية ، حيث يمكن دمج خط الزرد مع مراسل مستقبلات مع خطوط مراسل مختلفة. في كلتا الحالتين ، تجدر الإشارة إلى أن تحديد كمية الغشاء لمستويات المستقبلات يمثل تحديا في العدلات العنقودية (انظر أدناه). وأخيرا، نلاحظ أن التمديد المحتمل لهذا البروتوكول هو متابعة التصوير الحي بواسطة الكيمياء النسيجية المناعية لإجراء تحليلات توطين أكثر تفصيلا.
نظام Tol2 transgenesis راسخ7 وتم استخدام مروج الليزوزيم C على نطاق واسع للتعبير عن العدلات11,15. وبالتالي ، فإن نهج التكوين المتبادل مباشر نسبيا ومستوى التعبير الذي تم تحقيقه مع هذا المروج مرتفع بما يكفي لتوفير تباين كاف لتحليل ديناميكيات المستقبلات. أحد القيود المحتملة هو أن مستوى التعبير لا يلخص مستويات التعبير عن المستقبلات الذاتية. ويمكن نشر تقنيات كريسبر الجديدة لإنشاء خطوط غير مباشرة للمستقبلات ذات الأهمية الخاصة28. لا تزال هذه التقنيات مرهقة وقد لا تضمن مستويات التعبير المطلوبة للتصوير تحت الخلوي ، لكن تطويرها الناجح سيكون اختراقا مهما لفهم ديناميكيات الإشارات الذاتية. تعد عمليات التحقق الوظيفية مهمة لتفسير البيانات باستخدام تركيبات المستقبلات المعدلة وراثيا. على سبيل المثال ، يمكن استخدام اختبارات التعرف على الليغاند لإثبات أن بروتين الاندماج الفلوري وظيفي ويمكن استخدام إنقاذ الأنماط الظاهرية بالضربة القاضية لإثبات أن مستويات التعبير العدلة المعدلة وراثيا متوافقة مع الوظيفة14. وأخيرا، فإن الطريقة الأكثر مباشرة للتحقق من صحة اندماج المستقبلات هي استخدام اختبار وظيفي في المختبر مع مستقبلات موسومة إلى جانب الإصدارات14 غير المصنفة.
يعالج نهج القياس الكمي صعوبات محددة في تجزئة الأغشية الدقيقة في العدلات في الجسم الحي. في الخلايا ذات الطبيعة الظهارية ، يمكن تنفيذ القياس الكمي لمستويات المستقبلات تلقائيا عن طريق تطبيع مستويات مستقبلات الغشاء إلى علامة تحكم ، والتي يمكن التعبير عنها جنبا إلى جنب أو بشكل منفصل9. في الواقع ، لقد طبقنا مثل هذا النهج ، عند استخدام اختبار التعرف على الليغاند في أجنة المعدة14. ومع ذلك ، تخضع العدلات لتغيرات معقدة وسريعة في شكل الخلية في الجسم الحي ، مما يجعل تجزئة الغشاء صعبة في كل من 2D و 3D14. هذا أكثر تحديا عندما تتجمع العدلات ، والتي تحدث في العديد من الإعدادات الفسيولوجية29. يتغلب مقياس التباين على هذا القيد لأنه لا يتطلب تجزئة الغشاء ولكنه يعكس بدلا من ذلك الحالة العامة لتوزيع المستقبلات في الخلية (غشائية / ناعمة مقابل حويصلة / نقطة). من المهم ملاحظة أن مقياس التباين يمكن أن يتأثر بالتباين الكلي للصورة ، لذلك يلزم تطبيع قيم الخلايا الفردية إلى مرجع داخلي لحساب تباين الإشارة في الأجنة / العينات المختلفة. على سبيل المثال، استخدمنا متوسط قيمة تباين الخلايا للعدلات غير المستجيبة في CHT (أي العدلات التي تظل ثابتة ولا تهاجر إلى الزعنفة البطنية)14. وهناك احتمال إضافي يتمثل في التطبيع مع قيم التباين لعلامة تحكم في نفس الخلية. وهذا من شأنه أن يوفر حلا عندما لا يتوفر مرجع داخلي للخلايا غير المستجيبة وقد يحل على الأرجح الاختلافات الكمية الدقيقة في ديناميكيات المستقبلات بين الظروف المختلفة.
موقع التصوير هو متغير آخر يجب مراعاته. سبب اختيار جرح الزعنفة البطنية هنا ، على عكس نموذج جرح زعنفة الذيل الأكثر استخداما16,30 ، هو أن موقع الجرح قريب من موقع إقامة العدلات / أصل الهجرة. هذا يسرع الجدول الزمني للفحص ، حيث يستغرق الأمر وقتا قليلا نسبيا حتى تصل العدلات. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة لالتقاط سلوك الخلية في كل من أصل الهجرة (CHT) والموقع المستهدف للاهتمام (الجرح). هذا مهم هنا ، لأن الدقة المكانية والزمانية المطلوبة للتصوير تحت الخلوي يصعب دمجها مع مجال رؤية كبير أو مسح ضوئي متعدد المواضع. وبالتالي ، فإن فحص جرح الزعنفة البطنية يسمح بتتبع تطور استجابة الهجرة من أصل الهجرة والتقاط تقلبات المستقبلات غير المحددة في الخلايا التي لا تستجيب في وقت واحد. وكما ذكر أعلاه، فإن هذا الأخير مفيد لأغراض القياس الكمي لأنه يوفر مرجعا داخليا للديناميات غير المحددة. وفي نظم أخرى، قد لا يكون من الممكن الحصول على مثل هذا المرجع الداخلي، وفي هذه الحالة توفر قيم التباين لعلامة غشاء مشتركة التعبير عنها تحكما بديلا.
وباختصار، نتوقع أن تكون المنهجية قابلة للتطبيق على النظم الأخرى ويمكن نشرها لأغراض متنوعة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نفس المراسلين في إعدادات التهابية أخرى ، مثل إعدادات العدوى أو نماذج الأمراض الأخرى. يمكن توسيع ذخيرة خطوط مراسل مستقبلات الزرد إلى مستقبلات إشارات أخرى ، لفهم آليات الإشارة أو الإبلاغ عن ديناميكيات الليغاند في الجسم الحي. يمكن الجمع بين هذا النهج وتقنيات الضربة القاضية / الضربة القاضية لاستجواب الأساس الميكانيكي للديناميكيات المرصودة. على سبيل المثال ، يمكن أن يشير اضطراب تعبير الرباط إلى اعتماد الليغاند على ديناميكيات المستقبلات المرصودة. وفي المستقبل، نتوخى أن يتم زيادة صقل النظام ليشمل الإدخال غير المباشر للمراسلين. وفي نهاية المطاف، فإن النتائج التي تستخدم هذه المنهجية من شأنها أن توفر رؤى جديدة قيمة تتجاوز مجتمع أسماك الزرد، بالنظر إلى الحفاظ على مستقبلات الإشارات هذه في الثدييات والتحدي النسبي المتمثل في إجراء هذه الدراسات على الكائنات الحية الأكبر.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح
Acknowledgments
نشكر كريستين هولت وبيل هاريس على المساعدة في الفحص المجهري البؤري. نشكر دارين غيلمور على تركيبات العمود الفقري لمؤقت الفلورسنت وآنا هوتنلوتشر على ناقل العمود الفقري Tol2-Lyz. نشكر ستيف رينشو على خط Tg (mpx: GFP) i114 . وقد دعم هذا العمل مركز البحوث والبحوث (MR/L019523/1)، وصندوق ويلكوم الاستئماني [204845/Z/16/Z]؛ إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] ومنحة إسحاق نيوتن ترست 19.23 (ن). C.C. بدعم من منحة MRC DTP وجزئيا من قبل Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]؛ إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] منحة. تم دعم H.W. من قبل MRC DTP Studentship. تم دعم H.P. من خلال منحة الدكتوراه Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) وجزئيا من قبل Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]؛ منحة إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] و MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A.
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
