Summary
Her præsenterer vi en protokol til vurdering af de neurobeskyttende aktiviteter af testforbindelser i Caenorhabditis elegans, herunder polyglutaminaggregering, neuronal død og kemooavoidanceadfærd samt en eksemplarisk integration af flere fænotyper.
Abstract
Aldersrelateret misfoldning og aggregering af patogene proteiner er ansvarlige for flere neurodegenerative sygdomme. For eksempel er Huntingtons Sygdom (HS) hovedsageligt drevet af en CAG-nukleotid-gentagelse, der koder for en udvidet glutaminkanal i huntingtinprotein. Inhiberingen af polyglutamin (polyQ) aggregering og især aggregeringsassocieret neurotoksicitet er således en nyttig strategi til forebyggelse af HS og andre polyQ-associerede tilstande. Dette papir introducerer generaliserede eksperimentelle protokoller til vurdering af testforbindelsers neuroprotektive kapacitet mod HS ved hjælp af etablerede polyQ transgene Caenorhabditis elegans modeller. AM141-stammen vælges til polyQ-aggregeringsassayet, da en aldersassocieret fænotype af diskrete fluorescerende aggregater let kan observeres i dens kropsvæg på voksenstadiet på grund af muskelspecifik ekspression af polyQ: : YFP-fusionsproteiner. I modsætning hertil bruges HA759-modellen med stærkt udtryk for polyQ-udvidede kanaler i ASH-neuroner til at undersøge neuronal død og kemooavoidanceadfærd. For omfattende at evaluere målforbindelsernes neuroprotektive kapacitet præsenteres ovenstående testresultater i sidste ende som et radardiagram med profilering af flere fænotyper på en måde med direkte sammenligning og direkte visning.
Introduction
Progressiv neurodegeneration i HS involverer patogen mutant huntingtin med en unormal strækning af polyQ kodet af CAG trinukleotid gentager 1,2,3. Mutante huntingtinproteiner med mere end 37 glutamin-gentagelser er tilbøjelige til at samle sig og ophobes i hjernen hos HS-patienter og dyremodeller 4,5, hvilket i sidste ende fører til neurodegeneration6. På trods af den manglende klarhed om polyQ-aggregaternes rolle i sygdomspatologi5 er inhiberingen af polyQ-aggregering og dens tilknyttede toksicitet en nyttig terapeutisk strategi for HS og andre polyQ-sygdomme 4,7,8.
På grund af bevarelsen i neuronale signalveje og let at konstruere transgene sygdomsmodeller er Caenorhabditis elegans blevet anvendt i vid udstrækning som en vigtig modelorganisme til undersøgelse af neurologiske lidelser 9,10,11,12. For eksempel kan transgene C. elegans-modeller, der udtrykker aggregeringsudsatte polyQ-udvidelser, objektivt efterligne HS-lignende funktioner såsom selektivt neuronalt celletab, cytoplasmisk aggregatdannelse og adfærdsdefekter13. Undersøgelse af de potentielle virkninger af testprøver for at vende disse fænotyper i etablerede polyQ nematodemodeller har ført til identifikation af en række lovende terapeutiske kandidater, fx polysaccharider 7,14,15, oligosaccharider16, naturlige små molekyler17,18 og urteekstrakter og formler19,20.
Beskrevet her er to hoved polyQ C. elegans modeller og relevante protokoller for potentielle anvendelser som eksemplificeret ved undersøgelsen af astragalan, et polysaccharid isoleret fra Astragalus membranaceus7. Til polyQ-aggregeringsassayet i C. elegans er den anvendte model den transgene stamme AM141, som viser fluorescerende puncta spredt i sin kropsvægsmuskel, når den når voksenalderen på grund af ekspressionen af Q40::YFP-fusionsproteinet, en polyQ-kanal med 40 rester (polyQ40) smeltet sammen til gult fluorescerende protein (YFP)21,22 . Stammen HA759 blev brugt til at undersøge neuronal overlevelse og kemooavoidance adfærd, da den udtrykker både grønt fluorescerende protein (GFP) og Htn-Q150 (en human huntingtin-afledt polyQ-kanal med 150 rester) stærkt i ASH neuroner, men svagt i andre neuroner, hvilket resulterer i progressiv neurodegeneration og ASH-celledød 7,13. Et omfattende resumé af terapeutiske kandidaters neuroprotektive potentiale tilvejebringes ved at integrere resultater fra forskellige assays.
Protocol
BEMÆRK: Se tabel 1 for opskrifterne på opløsninger, der anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af materialer til Caenorhabditis elegans assay
- Vedligeholdelse af C. elegans stammer
- Få stammerne C. elegans (AM141 og HA759) og Escherichia coli (OP50 og NA22) (se materialetabellen).
- Nematoderne på NGM-pladen (nematodevækstmediet) vedligeholdes med E. coli OP50 ved 20 °C for AM14121 eller 15 °C for HA75923.
- Fremstilling af E. coli OP50 bakteriekultur
- Vælg en enkelt koloni af E. coli OP50 fra en Luria-Bertani (LB) stribeplade og inokuler den i 50 ml flydende LB-kultur.
- Op50-bakterierne inkuberes i en ryster ved 37 °C og 200 o /min indtil en optisk densitet på ~ 0,5 ved 570 nm (OD570).
- OP50-bakteriekulturen opbevares ved 4 °C, og den anvendes inden for to uger.
- Fremstilling af NGM-plader med OP50-bakterier
- Der tilsættes 20 g agar, 2,5 g pepton, 3,0 g NaCl og 975 ml deioniseret vand til en 1 liter autoklavebar flaske. Autoklave ved 121 °C i 30 min.
- Den flydende NGM-agarflaske anbringes på bænken for at afkøle til ~60 °C, og der tilsættes derefter følgende sterile stamopløsninger: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4, 1 ml 5 mg/ml kolesterol og 25 ml 1 M kaliumphosphat (pH 6,0).
- Hæld 20 ml NGM i en steril 90 mm petriskål, og lad pladerne stå på bænken for at afkøle og størkne. Hold pladerne på hovedet og lad dem tørre på bænken ved stuetemperatur i 2 dage.
- 200 μL af OP50-bakteriekulturen hældes på hver NGM-plade, og den fordeles jævnt med en steril glasbelægningsstang. Luk lågene, og inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
- NGM-pladerne, der er podet med OP50, opbevares i en plastkasse med et dæksel ved stuetemperatur og anvendes inden for to uger.
- Forberedelse af alderssynkroniseret C. elegans population
- Saml gravide voksne nematoder i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuger ved 1000 × g i 1 min. Vask tre gange og resuspend nematoderne i M9 buffer.
- Tilsæt et lige stort volumen blegemiddelopløsning og omrør forsigtigt i 3-5 min. Overvåg blegningen hver 15. sek. under et dissekeringsmikroskop.
BEMÆRK: Blegemiddelopløsningen skal fremstilles frisk før brug ved blanding af lige store mængder på 10% NaOCl og 1 M NaOH (tabel 1)20. - Når de fleste nematoder er brudt, skal du stoppe fordøjelsen ved at fortynde med M9-buffer. Centrifuger hurtigt for at fjerne supernatanten, og resuspender pelleten i M9-buffer for at gentage vasken tre gange.
- Resuspend pelleten i S medium. Lad nematoderesterne sætte sig ved tyngdekraften i 2-3 minutter, mens æggene forbliver i supernatanten.
- Aspirer supernatanten i et nyt sterilt mikrocentrifugerør. Saml æggene ved centrifugering ved 1000 × g i 1 min.
- Kassér ~80% af supernatanten, og æggene fordeles i en steril kolbe indeholdende 20 ml S-medium. Anbring kolben i en shaker, og inkuber æggene natten over uden mad ved 120 o / min for at opnå synkroniserede L1-nematoder.
2. PolyQ-aggregeringsassay
- Fremstilling af nematoder til polyQ-aggregeringsassayet
- Overfør 300-500 synkroniserede L1-larver af AM141 til hver brønd af en 48-brøndplade med 500 μL S-medium indeholdende OP50 (OD570 på 0,7-0,8) og 5 mg / ml astragalan, typisk en brønd pr. behandling i et tidspunkt.
- Forsegl pladen med parafilm og inkuberes ved 20 °C og 120 o / min i 24, 48, 72 og 96 timer.
- Høst nematoderne i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør og vask med M9 buffer >3 gange ved centrifugering (1000 × g i 1 min) for at fjerne den resterende OP50. Resuspend AM141 nematoderne i M9 buffer, og hold dem klar til billedoptagelse.
- Erhvervelse af fluorescerende billeder og dataanalyse
BEMÆRK: Data analyseres automatisk med dette billedbehandlingssystem med højt indhold. Hvis en automatiseret billeddannelsesenhed ikke er tilgængelig, kan en konventionel metode til fremstilling af en agarosepude til billedoptagelse anvendes til at opnå lignende ydeevne ved hjælp af et almindeligt fluorescerende mikroskop 7,15,17 (se trin 3.2 og 3.3).- Overfør 10-15 nematoder til hver brønd i en 384-brøndplade (endeligt volumen 80 μL pr. Brønd). Indstil 10 replikerbrønde for hver behandling.
- Tilsæt 10 μL 200 mM natriumazid til hver brønd for at lamme nematoderne og lade dem slå sig ned til bunden (5-10 min).
- Placer pladen i et billedbehandlingssystem med højt indhold for at hente fluorescerende billeder (se materialetabellen for enheds- og softwareoplysninger).
- Åbn billedoptagelsessoftwaren, og konfigurer følgende parametre.
- Åbn vinduet Opsætning af pladeanskaffelse , og opret et nyt eksperimentsæt og navn.
- Vælg Forstørrelse som 2x, Kamerabakke som 1 og Pladetype som 384-brøndplade.
- Indstil de brønde og steder (enkelt sted), der skal besøges.
- Vælg filteret fluoresceinisothiocyanat (FITC), og aktivér billedbaserede fokuseringsindstillinger.
- Indstil eksponeringen til 300 ms.
BEMÆRK: Ovenstående indstillinger kan testes og justeres for at optimere billedparametrene. - Gem indstillinger for billedoptagelse, og klik på knappen Indløs plade for at køre.
- Analyser billeddataene ved hjælp af billedanalysesoftwaren.
- Åbn vinduet Gennemse pladedata, og vælg testpladen til billedanalyse.
- Dobbeltklik på en testbrønd for at få vist dens billede.
- Vælg Tæl kerner som analysemetode, og klik på knappen Konfigurer indstillinger for at få vist et vindue til følgende indstillinger.
- Definer kildebilledet fra FITC-kanalen, og vælg standardalgoritmen.
- Indstil billedanalyseparametrene som følger: omtrentlig minimumsbredde = 10 μm (= 2 pixels); omtrentlig maksimal bredde = 50 μm (= 12 pixels); intensitet over lokal baggrund = 1.000-2.000 gråniveauer.
- Test de aktuelle indstillinger for at optimere analysemetoden.
- Gem indstillingerne og kør analysen på alle brønde.
BEMÆRK: Det tager ~ 20 minutter at afslutte analysen for en 384-brøndplade. - Eksporter de samlede kerner som det samlede antal Q40::YFP-aggregater i hver brønd.
- Tæl antallet af nematoder i hver brønd.
- Beregn det gennemsnitlige antal Q40::YFP-aggregater pr. nematode i hver gruppe, og anvend en ikke-lineær kurve, der passer til dataene fra hvert tidspunkt.
- Beregn hæmningsindekset ved hjælp af eq (1) nedenfor:
Hæmningsindeks =
(1)
HvorN-kontrol ogN-prøve er det gennemsnitlige antal Q40::YFP-aggregater i henholdsvis kontrol- og behandlingsgrupperne.
(1)3. PolyQ-medierede neurotoksicitetsassays
- Behandling af C. elegans med testprøver
- For at forberede nematoder til polyQ neurotoksicitetsassay overføres 300-500 synkroniserede L1 larver af HA759 til hver brønd af en 48-brøndplade med 500 μL S-medium indeholdende OP50 (OD570 på 0,7-0,8) og 5 mg / ml astragalan, typisk tre replikatbrønde til hver behandling.
- Pladen forsegles med parafilm, og den inkuberes ved 15 °C og 120 o/min i 3 dage23.
- Saml nematoderne ved centrifugering og vask 3-5 gange med M9 buffer. Resuspend nematoderne i M9 buffer til brug i neuronal overlevelse og undgåelse assays.
- Fremstilling af agarosepude
- Der tilsættes 2 g agarose til 100 ml M9-buffer (2%, w/v) og agaroseopløsningen opvarmes i en mikrobølgeovn til næsten kogning.
- Hæld 0,5 ml smeltet agarose på midten af et 1 mm tykt mikroskopiglasglasglas, der er placeret mellem to stykker 2 mm tykke glasplader. Dæk med et andet dias lodret. Når agarosen er kølet af og størknet, skal du forsigtigt fjerne det øverste dias.
- ASH neuronal overlevelse assay
- Tilsæt en dråbe 20 mM natriumazid på agarosepuden. Overfør 15-20 HA759 nematoder i dråben for at immobilisere dem.
- Placer en dækslip forsigtigt over nematoderne. Opbevar diaset under et fluorescensmikroskop udstyret med et digitalt kamera. Vælg en 40x objektiv linse og FITC filter til at detektere GFP-positive ASH neuroner i hovedet af nematoderne.
- Vælg mere end 50 nematoder i hver gruppe tilfældigt for at tælle antallet af nematoder med GFP-mærkede bilaterale ASH-neuroner i deres hovedregion7. Beregn overlevelsesraten for ASH-neuroner ved hjælp af eq (2) nedenfor.
Neuronal overlevelse (%) =
(2)
HvorN-overlevelse ogN-total er henholdsvis antallet af nematoder med GFP-positive ASH-neuroner og det samlede antal testede nematoder i hver gruppe.
- Osmotisk undgåelsesassay
- Opdel en fødevarefri NGM-tallerken (9 cm) i normale (N) og trap (T) zoner med en 8 M glycerol (~ 30 μL) linje i midten. Spred en 200 mM natriumazid (~ 20 μL) linje på ~ 1 cm væk fra glycerollinjen for at lamme nematoderne, der krydser gennem glycerolbarrieren ind i zone T.
- Overfør ~ 200 nematoder hver til zone N af tre replikatplader for hver gruppe. Tilsæt en dråbe på 1% butanedion (~ 2 μL) på Zone T (1 cm fra pladekanten) for at tiltrække nematoderne. Dæk straks låget på petriskålen, og inkuberes ved 23 °C i 90 min.
- Score antallet af nematoder på N- og T-zonerne under et mikroskop. Undgåelsesindekset beregnes ved hjælp af eq (3)20.
Undgåelsesindeks =
(3)
Hvor N og T er antallet af nematoder i henholdsvis N- og T-zoner. Data præsenteres som midler ± standardafvigelse (SD) af tre replikater, der er repræsentative for >3 uafhængige eksperimenter. - Udfør en uparret, tosidet t-test for at sammenligne data fra astragalan- og kontrolgrupperne.
(2)
(3)4. Oprettelse af et radardiagram
- Åbn grafsoftwaren, og importer data fra forskellige assays til et nyt ark. Indtast kolonnen A(X) som titlerne på radialakserne, kolonnen A(Y) som dataene fra kontrolgruppen og kolonnen B(Y) som dataene fra behandlingsgruppen.
- Vælg de nødvendige data, og klik på Plot | Specialiseret: Radarknap i værktøjslinjemenuen for at generere et radardiagram.
- Dobbeltklik på den radiale akse , og juster etiketterne Skaler, Marker og Marker for hver akse efter behov.
- Klik på Filer i menuen, og vælg Eksporter grafer for at gemme billedet som * .tiff.
BEMÆRK: Softwarewebstederne i materialetabellen indeholder detaljerede hjælpedokumenter og videotutorials om oprettelse af radardiagrammer.
Representative Results
Den transgene polyQ-stamme AM141 udtrykker stærkt Q40::YFP fusionsproteiner i sine kropsvægsmuskelceller 7,21. Som vist i figur 1A kan den diskrete aggregerede fænotype af denne stamme identificeres ved hjælp af den automatiserede billeddannelses- og analyseprotokol, der er beskrevet i denne artikel. Mængden af Q40::YFP-aggregater i AM141-nematoder steg signifikant efter 48 timer fra L1-stadiet. Denne tendens til at stige blev imidlertid hæmmet af astragalanbehandling (figur 1B), hvilket demonstrerede astragalans beskyttelsespotentiale mod polyQ-aggregering. Typisk kan enten 72 timer eller 96 timer nemt bruges som tidspunkter til at tælle Q40::YFP-aggregater for at evaluere testprøvernes antiaggregeringseffekt. I denne protokol blev de fluorescerende aggregater af AM141 nematode fanget af et automatiseret billeddannelsessystem, selvom fluorescensmikroskoper også kan anvendes til dette formål7.
C. elegans-stammen HA759 udtrykker både GFP-markøren og Htn-Q150 i sine sensoriske ASH-neuroner, hvilket fører til progressivt tab og dysfunktion af disse neuroner11,13. Nematoderne blev monteret på 2% agarosepuder for at bestemme ASH neuronal levedygtighed (figur 2A) og visualiseret mikroskopisk for at detektere ASH-neuronerne. Et tab af GFP-fluorescens i bilaterale ASH-neuroner i hovedregionerne af nematoder indikerer ASH neuronal død (figur 2B). Overlevelsesraten for ASH-neuroner i HA759-nematoder er <40 % i kontrolgruppen efter inkubation ved 15 °C i 3 dage 7,20, hvilket indikerer polyQ-medieret neurotoksicitet. Derfor kan dette ASH neuronale overlevelsesassay bruges til visuelt at evaluere virkningerne af testforbindelser på C. elegans neuroner, fx den neurobeskyttende virkning af astragalan, men ikke Poria glycan (figur 2C).
Da adfærdsdysfunktion er et vigtigt klinisk symptom i polyQ-sygdomme, er det kemosensoriske undgåelsesassay (figur 3A) ved hjælp af et stort antal HA759-nematoder designet som en forenklet test for at undersøge effekten af testprøver på det funktionelle tab af ASH-neuroner medieret af polyQ-aggregering. Som vist i figur 3B var undgåelsesindekset for HA759-nematoder i den ubehandlede kontrolgruppe ~0,5, svarende til hvad der tidligere blev rapporteret14. Interessant nok steg undgåelsesindekset til >0,6 i nematoderne behandlet med astragalan ved 15 ° C i 3 dage (figur 3B), hvilket viser en neurobeskyttende virkning af polysaccharidet mod adfærdsmæssige svækkelser.
For at evaluere testforbindelsernes samlede neuroprotektive kapacitet kan dataene fra ovenstående individuelle assays integreres og præsenteres som et radardiagram for flere fænotyper, hvilket gør det til et samlende træk ved polyQ-fænotyper, der er egnede til direkte sammenligning og direkte visning. Som vist i figur 4 er arealet af trekanten i astragalanbehandlingsgruppen større end kontrolgruppens, hvilket indikerer polysaccharidets antipolyQ-virkninger.
Figur 1: Astragalans virkning på polyQ40-aggregering. (A) Repræsentative billeder af AM141-nematoder efter behandling med eller uden astragalan i 96 timer ved 20 °C. De fluorescerende billeder (venstre paneler) blev erhvervet fra 384-brøndplader ved hjælp af et billeddannelses- og analysesystem med højt indhold, og Q40::YFP-aggregaterne (højre paneler) blev automatisk identificeret af systemet. Indsatser er de forstørrede visninger af nematodebilleder, der viser polyQ-aggregaterne. Skalabjælker = 500 μm. (B) Kvantificering af Q40::YFP-aggregater. Antallet af Q40::YFP-aggregater i AM141-nematoder blev overvåget ved hjælp af billeddannelsessystemet med højt indhold hver 24. time i 4 dage efter behandling med eller uden astragalan ved 20 °C. Ca. 100-150 nematoder i hver gruppe blev scoret for aggregater på hvert tidspunkt. Resultaterne vises som tilpassede kurver baseret på det gennemsnitlige antal aggregater pr. nematode. Forkortelser: polyQ = polyglutamin; YFP = gult fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Effekt af astragalan på Htn-Q150-medieret ASH neuronal død. (A) Skematisk diagram over agarose diasforberedelse. (B) Repræsentative mikrografer af HA759 nematoder med ASH neuronal overlevelse og død ved hjælp af 400x forstørrelse. Skalastænger = 20 μm. HA759-nematoderne blev fotograferet ved hjælp af et fluorescensmikroskop efter behandling med eller uden astragalan ved 15 °C i 3 dage fra L1. (C) Beskyttende virkning af astragalan mod polyQ-medieret ASH neuronal død. Poria glycan, et polysaccharid fra Poria cocos, blev brugt som kontrol. Data præsenteres som midler ± SD af tre replikater, der repræsenterer mere end tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en uparret, to-halet t-test for at sammenligne data fra kontrolgruppen med data fra astragalan- og Poria-glycangrupperne . *p < 0,05; ns = ingen signifikant. Forkortelse: GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Effekt af astragalan på Htn-Q150-medieret adfærdsmæssig dysfunktion. (A) Skematisk diagram over undgåelsesassaypladen. (B) Repræsentative resultater af undgåelsesassay. Undgåelsesindeks blev defineret som forholdet mellem nematoder i N-zonen og det samlede antal nematoder på pladen. Resultaterne præsenteres som midler ± SD af tre replikater, der repræsenterer tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse af undgåelsesindeks blev udført ved hjælp af en uparret, to-halet t-test. **p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Astragalans samlede neuroprotektive kapacitet. Data fra tre forskellige assays importeres til OriginPro-software til et radardiagram, som præsenteres for at profilere astragalans generelle effekt på flere fænotyper medieret af polyQ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Da polyQ-aggregering og proteotoksicitet er vigtige træk ved polyQ-lidelser, såsom Huntingtons Sygdom13, anbefaler vi brugen af flere modeller og metoder til omfattende evaluering af testforbindelsernes neurobeskyttende kapacitet, herunder polyQ-aggregeringsassayet i AM141-stammen, ASH neuronal overlevelsesassay i HA759-stammen og det kemosensoriske undgåelsesassay i HA759-stammen. De protokoller, der præsenteres her, er blevet brugt til at evaluere testprøvernes neuroprotektive kapacitet mod polyQ-toksicitet, herunder hæmmende virkninger på både polyQ-aggregering og tilhørende neurotoksicitet 7,14,15,16,17,19,20, hvilket viser deres potentiale i lægemiddelopdagelse for HS og andre polyQ-sygdomme.
Et automatiseret billeddannelses- og analysesystem introduceres til påvisning og tælling af polyQ-aggregater i polyQ-aggregeringsassayet. Denne metode har fordelene ved at være højgennemstrømning og tidseffektiv og resulterer i signifikant reducerede subjektive fejl i den besværlige tælleproces. For en hel plade med 384 brønde tager det kun <1 time at afslutte billedoptagelse og analyse. Den konventionelle mikroskopiske billeddannelsesmetode har imidlertid også vist lignende ydeevne i dette laboratorium uden brug af den automatiserede billeddannelsesenhed7.
I alt 100-150 nematoder pr. behandling anbefales i et typisk Q40::YFP-aggregeringsassay for hvert tidspunkt, som kan udføres i replikatbrønde indeholdende 10-15 nematoder hver. Det skal dog bemærkes, at L1 larver kan være mere følsomme over for nogle behandlinger eller højere koncentrationer. Derfor kan højere doser af testforbindelser hæmme deres vækst, hvilket fører til falsk-positive resultater på grund af langsom vækst og dermed forsinket polyQ-aggregering. Normalt kan der udføres et fødevareclearanceassay for at løse dette problem og sikre det passende koncentrationsområde for testforbindelser23.
HA759 transgene nematoder, der anvendes i polyQ neurotoksicitetsassays, udtrykker OSM-10::GFP og Htn-Q150, hvilket gør det muligt entydigt at identificere bilaterale ASH sensoriske neuroner. Derfor evalueres ASH-neuronoverlevelse ved tilstedeværelsen eller fraværet af GFP-ekspression; normalt er ~ 40-75% af ASH neuroner i kontrol nematoderne døde23,24. Interessant nok er pqe-1 (polyglutaminforstærker-1) genetisk mutant baggrund i HA759-stammen (pqe-1; Htn-Q150) accelererer polyQ-medieret toksicitet, hvilket fører til døden af de fleste ASH-neuroner inden for tre dage, selv ved 15 ° C, og derfor dyrkes denne stamme ved 15 ° C for neuronal overlevelsesassay, som tidligere rapporteret23,24.
Funktionelt tab af ASH-neuroner i HA759-nematoder kan forekomme før påvisning af celledød og proteinaggregater13; derfor er det osmotiske undgåelsesadfærdsassay afgørende for vurderingen af polyQ-medieret toksicitet. For at minimere den potentielle indvirkning af mindre aktive HA759-nematoder ved lav temperatur på adfærdsmæssige eksperimenter inkuberes undgåelsesassaypladerne i en befugtet 23 ° C inkubator snarere end ved 15 ° C som i neuronal overlevelsesassay ved hjælp af denne stamme. Derudover er det blevet rapporteret, at Htn-Q150 / OSM-10: : GFP transgene nematoder er meget følsomme over for næseberøring; derfor er en alternativ påvisning af ASH-neuronfunktion næseberøringsassay13.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker tidligere medlemmer af Huang Lab, der har hjulpet med at udvikle og forbedre de protokoller, der anvendes i dette papir, især Hanrui Zhang, Lingyun Xiao og Yanxia Xiang. Dette arbejde blev støttet af 111-projektet (bevillingsnummer B17018) og Natural Science Foundation of Hebei Province (tilskudsnummer H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
- Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L.
- Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
- Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
- Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
- Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
- Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
- Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
- Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
- Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
- Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
- Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
- Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
- Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
- Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
- Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
- Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
- Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
- Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).
