Summary
Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.
Abstract
Leeftijdsgebonden misvouwing en aggregatie van pathogene eiwitten zijn verantwoordelijk voor verschillende neurodegeneratieve ziekten. De ziekte van Huntington (ZvH) wordt bijvoorbeeld voornamelijk aangedreven door een CAG-nucleotide-herhaling die codeert voor een uitgebreid glutaminekanaal in huntingtine-eiwit. De remming van polyglutamine (polyQ) aggregatie en, in het bijzonder, aggregatie-geassocieerde neurotoxiciteit is dus een nuttige strategie voor de preventie van de ZvH en andere polyQ-geassocieerde aandoeningen. Dit artikel introduceert gegeneraliseerde experimentele protocollen om de neuroprotectieve capaciteit van teststoffen tegen de ZvH te beoordelen met behulp van gevestigde polyQ transgene Caenorhabditis elegans modellen. De AM141-stam wordt gekozen voor de polyQ-aggregatietest omdat een leeftijdsgebonden fenotype van discrete fluorescerende aggregaten gemakkelijk kan worden waargenomen in de lichaamswand in het volwassen stadium als gevolg van spierspecifieke expressie van polyQ: : YFP-fusie-eiwitten. Daarentegen wordt het HA759-model met sterke expressie van polyQ-geëxpandeerde kanalen in ASH-neuronen gebruikt om neuronale dood en chemofaidancegedrag te onderzoeken. Om de neuroprotectieve capaciteit van doelverbindingen uitgebreid te evalueren, worden de bovenstaande testresultaten uiteindelijk gepresenteerd als een radargrafiek met profilering van meerdere fenotypen op een manier van directe vergelijking en directe weergave.
Introduction
Progressieve neurodegeneratie bij de ZvH omvat pathogeen mutant huntingtine met een abnormaal stuk polyQ gecodeerd door CAG trinucleotide herhaalt 1,2,3. Gemuteerde huntingtine-eiwitten met meer dan 37 glutamine-herhalingen zijn gevoelig voor aggregering en accumulatie in de hersenen van ZvH-patiënten en diermodellen 4,5, wat uiteindelijk leidt tot neurodegeneratie6. Ondanks het gebrek aan duidelijkheid over de rol van polyQ-aggregaten in ziektepathologie5, is de remming van polyQ-aggregatie en de bijbehorende toxiciteit een nuttige therapeutische strategie voor de ZvH en andere polyQ-ziekten 4,7,8.
Vanwege het behoud in neuronale signaleringsroutes en gemakkelijk te construeren transgene ziektemodellen, is Caenorhabditis elegans op grote schaal gebruikt als een belangrijk modelorganisme voor het onderzoek naar neurologische aandoeningen 9,10,11,12. Transgene C. elegans-modellen die aggregatiegevoelige polyQ-uitbreidingen tot expressie brengen, kunnen bijvoorbeeld objectief ZvH-achtige kenmerken nabootsen, zoals selectief neuronaal celverlies, cytoplasmatische aggregaatvorming en gedragsdefecten13. Onderzoek naar de mogelijke effecten van testmonsters om deze fenotypen in gevestigde polyQ-nematodenmodellen om te keren, heeft geleid tot de identificatie van een verscheidenheid aan veelbelovende therapeutische kandidaten, bijvoorbeeld polysacchariden 7,14,15, oligosacchariden16, natuurlijke kleine moleculen17,18 en kruidenextracten en formules19,20.
Hier worden twee belangrijke polyQ C. elegans-modellen en relevante protocollen voor potentiële toepassingen beschreven, zoals geïllustreerd door de studie over astragalan, een polysaccharide geïsoleerd uit Astragalus membranaceus7. Voor de polyQ-aggregatietest in C. elegans is het gebruikte model de transgene stam AM141, die fluorescerende puncta laat zien die bij het bereiken van de volwassenheid in zijn lichaamswandspier is verspreid als gevolg van de expressie van het Q40: : YFP-fusie-eiwit, een polyQ-kanaal van 40 residuen (polyQ40) gefuseerd tot geel fluorescerend eiwit (YFP)21,22 . De stam HA759 werd gebruikt om neuronaal overlevings- en chemoavoidancegedrag te onderzoeken, omdat het zowel groen fluorescerend eiwit (GFP) als Htn-Q150 (een van menselijk huntingtine afgeleid polyQ-kanaal van 150 residuen) sterk tot expressie brengt in ASH-neuronen, maar zwak in andere neuronen, wat resulteert in progressieve neurodegeneratie en ASH-celdood 7,13. Een uitgebreide samenvatting van het neuroprotectieve potentieel van therapeutische kandidaten wordt gegeven door resultaten van verschillende testen te integreren.
Protocol
OPMERKING: Zie tabel 1 voor de recepten van oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding van materialen voor de Caenorhabditis elegans-test
- Onderhoud van C. elegans stammen
- Verkrijgen van C. elegans (AM141 en HA759) en Escherichia coli (OP50 en NA22) stammen (zie de tabel met materialen).
- Houd de aaltjes op de nematodengroeimedia (NGM) plaat gezaaid met E. coli OP50 op 20 °C voor AM14121 of 15 °C voor HA75923.
- Bereiding van E. coli OP50 bacteriekweek
- Kies een enkele kolonie E. coli OP50 uit een Luria-Bertani (LB) streepplaat en ent deze in tot 50 ml vloeibare LB-cultuur.
- Incubeer de OP50-bacteriën in een shaker bij 37 °C en 200 tpm tot een optische dichtheid van ~0,5 bij 570 nm (OD570).
- Bewaar de OP50 bacteriecultuur bij 4 °C en gebruik deze binnen twee weken.
- Bereiding van NGM-platen met OP50-bacteriën
- Voeg 20 g agar, 2,5 g pepton, 3,0 g NaCl en 975 ml gedeïoniseerd water toe aan een autoclaveerbare fles van 1 l. Autoclaaf bij 121 °C gedurende 30 min.
- Plaats de vloeibare NGM-agarfles op de bank om af te koelen tot ~ 60 ° C en voeg vervolgens de volgende steriele stamoplossingen toe: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml cholesterol en 25 ml 1 M kaliumfosfaat (pH 6,0).
- Giet 20 ml NGM in een steriele petrischaal van 90 mm en laat de borden op de bank liggen om af te koelen en te stollen. Houd de borden ondersteboven en laat ze 2 dagen op kamertemperatuur op de bank drogen.
- Doseer 200 μL van de OP50 bacteriecultuur op elke NGM-plaat en verdeel gelijkmatig met een steriele glazen coatingstaaf. Sluit de deksels en incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
- Bewaar de met OP50 bezaaide NGM-platen in een plastic doos met deksel bij kamertemperatuur en gebruik binnen twee weken.
- Voorbereiding van leeftijdsgesynchroniseerde C. elegans populatie
- Verzamel gravid volwassen nematoden in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 1 minuut op 1000 × g . Was drie keer en resuspenseer de aaltjes in M9 buffer.
- Voeg een gelijk volume bleekoplossing toe en roer voorzichtig gedurende 3-5 minuten. Controleer het bleken om de 15 s onder een ontleedmicroscoop.
OPMERKING: De bleekoplossing moet vóór gebruik vers worden bereid door gelijke volumes van 10% NaOCl en 1 M NaOH te mengen (tabel 1)20. - Zodra de meeste nematoden zijn afgebroken, stopt u de spijsvertering door te verdunnen met M9-buffer. Centrifugeer snel om het supernatant te verwijderen en resuspenseer de pellet in M9-buffer om het wassen drie keer te herhalen.
- Resuspendeer de pellet in S medium. Laat de nematodenresten 2-3 minuten door de zwaartekracht bezinken terwijl de eieren in het supernatant blijven.
- Giet het supernatant op in een nieuwe steriele microcentrifugebuis. Verzamel de eieren door centrifugeren op 1000 × g gedurende 1 min.
- Gooi ~ 80% van het supernatant weg en breng de eieren over in een steriele kolf met 20 ml S-medium. Plaats de kolf in een shaker en broed de eieren een nacht zonder voedsel bij 120 rpm uit om gesynchroniseerde L1-nematoden te verkrijgen.
2. PolyQ-aggregatietest
- Voorbereiding van nematoden voor de polyQ-aggregatietest
- Breng 300-500 gesynchroniseerde L1-larven van AM141 over naar elke put van een 48-well plaat met 500 μL S-medium met OP50 (OD570 van 0,7-0,8) en 5 mg / ml astragalan, meestal één put per behandeling gedurende één tijdstip.
- Sluit de plaat af met parafilm en incubeer bij 20 °C en 120 tpm gedurende 24, 48, 72 en 96 uur.
- Oogst de aaltjes in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en was met M9-buffer >3 keer door centrifugatie (1000 × g gedurende 1 minuut) om de resterende OP50 te verwijderen. Resuspendeer de AM141-nematoden in M9-buffer en houd ze klaar voor beeldacquisitie.
- Acquisitie van fluorescerende beelden en data-analyse
OPMERKING: Gegevens worden automatisch geanalyseerd met dit high-content imaging-systeem. Als er geen geautomatiseerd beeldvormingsapparaat beschikbaar is, kan een conventionele methode om een agarosepad voor beeldacquisitie voor te bereiden worden gebruikt om vergelijkbare prestaties te bereiken met behulp van een gemeenschappelijke fluorescerende microscoop 7,15,17 (zie stappen 3.2 en 3.3).- Breng 10-15 nematoden over in elke put in een plaat met 384 putten (eindvolume 80 μL per put). Stel 10 repliceerputten in voor elke behandeling.
- Voeg 10 μL 200 mM natriumazide toe aan elke put om de nematoden te verlammen en laat ze naar de bodem zakken (5-10 min).
- Plaats de plaat in een beeldverwerkingssysteem met een hoog gehalte om fluorescerende beelden te verkrijgen (zie de materiaaltabel voor informatie over apparaten en software).
- Open de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en stel de volgende parameters in.
- Open het venster Plate Acquisition Setup en maak een nieuwe experimentset en -naam.
- Selecteer Vergroting als 2x, Camera binning als 1 en Plaattype als 384-well plaat.
- Stel de putten en sites (enkele site) in die moeten worden bezocht.
- Selecteer het filter fluoresceïneisothiocyanaat (FITC) en schakel beeldgebaseerde scherpstelopties in.
- Stel de belichting in op 300 ms.
OPMERKING: De bovenstaande instellingen kunnen worden getest en aangepast om de beeldparameters te optimaliseren. - Sla de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen op en klik op de knop Plaat verwerven om uit te voeren.
- Analyseer de beeldgegevens met behulp van de beeldanalysesoftware.
- Open het venster Testplaatgegevens en selecteer de testplaat voor beeldanalyse.
- Dubbelklik op een testvak om de afbeelding weer te geven.
- Selecteer de Count Nuclei als de analysemethode en klik op de knop Instellingen configureren om een venster te openen voor de volgende instellingen.
- Definieer de bronafbeelding van het FITC-kanaal en selecteer het standaardalgoritme.
- Stel de parameters voor de beeldanalyse als volgt in: geschatte minimumbreedte = 10 μm (= 2 pixels); geschatte maximale breedte = 50 μm (= 12 pixels); intensiteit boven lokale achtergrond = 1.000-2.000 grijsniveaus.
- Test de huidige instellingen om de analysemethode te optimaliseren.
- Sla de instellingen op en voer de analyse uit op alle putten.
OPMERKING: Het duurt ~ 20 minuten om de analyse voor één 384-well plaat te voltooien. - Exporteer de Total Nuclei als het totale aantal Q40::YFP-aggregaten in elke put.
- Tel het aantal aaltjes in elke put.
- Bereken het gemiddelde aantal Q40::YFP-aggregaten per nematode in elke groep en pas een niet-lineaire curve toe die past bij de gegevens vanaf elk tijdstip.
- Bereken de remmingsindex met behulp van eq (1) hieronder:
Remmingsindex =
(1)
WaarbijN-controle enN-monster het gemiddelde aantal Q40::YFP-aggregaten in respectievelijk de controlegroep en de behandelingsgroep zijn.
(1)3. PolyQ-gemedieerde neurotoxiciteitstests
- Behandeling van C. elegans met testmonsters
- Om nematoden voor te bereiden op de polyQ neurotoxiciteitstest, breng 300-500 gesynchroniseerde L1-larven van HA759 over naar elke put van een 48-well plaat met 500 μL S-medium met OP50 (OD570 van 0,7-0,8) en 5 mg / ml astragalan, meestal drie repliceerputten voor elke behandeling.
- Sluit de plaat af met parafilm en incubeer bij 15 °C en 120 tpm gedurende 3 dagen23.
- Verzamel de aaltjes door centrifugeren en was 3-5 keer met M9 buffer. Resuspendeer de nematoden in M9-buffer voor gebruik in neuronale overlevings- en vermijdingstests.
- Bereiding van agarose pad
- Voeg 2 g agarose toe aan 100 ml M9-buffer (2%, w/v) en verwarm de agarose-oplossing in een magnetron tot bijna-kokend.
- Doseer 0,5 ml gesmolten agarose op het midden van een 1 mm dikke microscopieglasplaat geplaatst tussen twee stukken van 2 mm dikke glasplaten. Dek af met een andere schuif verticaal. Zodra de agarose is afgekoeld en gestold, verwijdert u voorzichtig de bovenste schuif.
- ASH neuronale overlevingstest
- Voeg een druppel van 20 mM natriumazide toe aan de agarose pad. Breng 15-20 HA759-nematoden over in de druppel om ze te immobiliseren.
- Leg voorzichtig een deklip over de aaltjes. Bewaar de dia onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera. Selecteer een 40x objectief lens en FITC filter om GFP-positieve ASH neuronen in het hoofdgebied van de nematoden te detecteren.
- Selecteer willekeurig meer dan 50 nematoden in elke groep om het aantal nematoden te tellen met GFP-gelabelde bilaterale ASH-neuronen in hun hoofdgebied7. Bereken de overlevingskans van ASH-neuronen met behulp van eq (2) hieronder.
Neuronale overleving (%) =
(2)
WaarbijN-overleving enN-totaal respectievelijk het aantal nematoden met GFP-positieve ASH-neuronen en het totale aantal geteste nematoden in elke groep zijn.
- Osmotische vermijdingstest
- Verdeel een voedselvrije NGM-plaat (9 cm) in normale (N) en val (T) zones door een 8 M glycerol (~ 30 μL) lijn in het midden. Verdeel een 200 mM natriumazide (~ 20 μL) lijn op ~ 1 cm afstand van de glycerollijn om de nematoden die door de glycerolbarrière naar Zone T gaan te verlammen.
- Breng ~ 200 nematoden elk over op Zone N van drie replicaatplaten voor elke groep. Voeg een druppel van 1% butanedion (~2 μL) toe aan Zone T (1 cm van de plaatrand) om de aaltjes aan te trekken. Dek het deksel van de petrischaal onmiddellijk af en incubeer gedurende 90 minuten bij 23 °C.
- Scoor het aantal aaltjes op de N- en T-zones onder een microscoop. Bereken de vermijdingsindex met behulp van eq (3)20.
Vermijdingsindex =
(3)
Waarbij N en T het aantal aaltjes in respectievelijk N- en T-zones zijn. Gegevens worden gepresenteerd als middel ± standaarddeviatie (SD) van drie replicaties, representatief voor >3 onafhankelijke experimenten. - Voer een ongepaarde, tweezijdige t-test uit om de gegevens van de astragalan- en controlegroepen te vergelijken.
(2)
(3)4. Een radarkaart maken
- Open de grafische software en importeer gegevens van verschillende testen in een nieuw blad. Voer de kolom A(X) in als de titels van de radiale assen, de kolom A(Y) als de gegevens van de controlegroep en de kolom B(Y) als de gegevens van de behandelingsgroep.
- Selecteer de gewenste gegevens en klik op Plot | Gespecialiseerd: Radarknop in het werkbalkmenu om een radardiagram te genereren.
- Dubbelklik op de radiale as en pas de labels Schaal, Vink en Vink van elke as zo nodig aan.
- Klik op Bestand in het menu en selecteer Grafieken exporteren om de afbeelding op te slaan als *.tiff.
OPMERKING: De softwarewebsites in de materiaaltabel bieden gedetailleerde helpdocumenten en videozelfstudies voor het maken van radardiagrammen.
Representative Results
De transgene polyQ-stam AM141 brengt Q40::YFP-fusie-eiwitten sterk tot expressie in de lichaamswandspiercellen 7,21. Zoals weergegeven in figuur 1A, kan het discrete geaggregeerde fenotype van deze stam worden geïdentificeerd door het geautomatiseerde beeldvormings- en analyseprotocol dat in dit artikel wordt beschreven. De hoeveelheid Q40::YFP-aggregaten in AM141-nematoden nam aanzienlijk toe na 48 uur vanaf het L1-stadium. Deze neiging tot toename werd echter geremd door astragalanbehandeling (figuur 1B), wat het beschermende potentieel van astragalan tegen polyQ-aggregatie aantoont. Doorgaans kan 72 h of 96 h gemakkelijk worden gebruikt als de tijdspunten om Q40::YFP-aggregaten te tellen om het anti-aggregatie-effect van testmonsters te evalueren. In dit protocol werden de fluorescerende aggregaten van AM141-nematoden opgevangen door een geautomatiseerd beeldvormingssysteem, hoewel fluorescentiemicroscopen ook voor dit doel kunnen worden gebruikt7.
De C. elegans-stam HA759 drukt zowel de GFP-marker als Htn-Q150 uit in zijn sensorische ASH-neuronen, wat leidt tot progressief verlies en disfunctie van deze neuronen11,13. De nematoden werden gemonteerd op 2% agarose pads om de ASH neuronale levensvatbaarheid te bepalen (figuur 2A) en microscopisch gevisualiseerd om de ASH neuronen te detecteren. Een verlies van GFP-fluorescentie in bilaterale ASH-neuronen in de hoofdgebieden van nematoden duidt op de NEURONALE DOOD VAN ASH (Figuur 2B). De overlevingskans van ASH-neuronen in HA759-nematoden is <40% in de controlegroep na incubatie bij 15 °C gedurende 3 dagen 7,20, wat wijst op polyQ-gemedieerde neurotoxiciteit. Daarom kan deze ASH neuronale overlevingstest worden gebruikt om de effecten van testverbindingen op C. elegans-neuronen visueel te evalueren, bijvoorbeeld het neuroprotectieve effect van astragalan maar niet Poria-glycaan (figuur 2C).
Aangezien gedragsdisfunctie een belangrijk klinisch symptoom is bij polyQ-ziekten, is de chemosensorische vermijdingstest (figuur 3A) met behulp van grote aantallen HA759-nematoden ontworpen als een vereenvoudigde test om het effect van testmonsters op het functionele verlies van ASH-neuronen gemedieerd door polyQ-aggregatie te onderzoeken. Zoals te zien is in figuur 3B, was de vermijdingsindex van HA759-nematoden in de onbehandelde controlegroep ~ 0,5, vergelijkbaar met wat eerder werd gemeld14. Interessant is dat de vermijdingsindex steeg tot >0,6 in de nematoden behandeld met astragalan bij 15 °C gedurende 3 dagen (figuur 3B), wat een neuroprotectief effect van de polysaccharide tegen gedragsstoornissen aantoont.
Om de algehele neuroprotectieve capaciteit van teststoffen te evalueren, kunnen de gegevens van de bovenstaande individuele testen worden geïntegreerd en gepresenteerd als een radargrafiek voor meerdere fenotypen, waardoor het een verenigend kenmerk is van polyQ-fenotypen die geschikt zijn voor directe vergelijking en directe weergave. Zoals te zien is in figuur 4, is het gebied van de driehoek in de astragalanbehandelingsgroep groter dan dat van de controlegroep, wat wijst op de anti-polyQ-effecten van de polysaccharide.
Figuur 1: Effect van astragalan op polyQ40-aggregatie. (A) Representatieve beelden van AM141-nematoden na behandeling met of zonder astragalan gedurende 96 uur bij 20 °C. De fluorescerende beelden (linkerpanelen) werden verkregen uit 384-well platen met behulp van een high-content beeldvormings- en analysesysteem, en de Q40: : YFP-aggregaten (rechterpanelen) werden automatisch door het systeem geïdentificeerd. Inzetstukken zijn de vergrote weergaven van nematodenafbeeldingen die de polyQ-aggregaten laten zien. Schaalstaven = 500 μm. (B) Kwantificering van Q40::YFP-aggregaten. Het aantal Q40::YFP-aggregaten in AM141-nematoden werd elke 24 uur na behandeling met of zonder astragalan bij 20 °C gemonitord met behulp van het beeldvormingssysteem met hoge inhoud. Ongeveer 100-150 nematoden in elke groep werden op elk tijdstip gescoord voor aggregaten. De resultaten worden weergegeven als aangepaste curven op basis van het gemiddelde aantal aggregaten per nematode. Afkortingen: polyQ = polyglutamine; YFP = geel fluorescerend eiwit; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effect van astragalan op Htn-Q150-gemedieerde ASH neuronale dood. (A) Schematisch diagram van agarose diavoorbereiding. (B) Representatieve microfoto's van HA759-nematoden met ASH neuronale overleving en dood met behulp van 400x vergroting. Schaalstaven = 20 μm. De HA759-nematoden werden gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop na behandeling met of zonder astragalan bij 15 °C gedurende 3 dagen vanaf L1. (C) Beschermend effect van astragalan tegen polyQ-gemedieerde ASH neuronale dood. Poria glycan, een polysaccharide van Poria cocos, werd gebruikt als controle. Gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD van drie replicaties, representatief voor meer dan drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde, tweezijdige t-test om gegevens van de controlegroep te vergelijken met die van de astragalan- en Poria-glycaangroepen. *p < 0,05; ns = niet significant. Afkorting: GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effect van astragalan op Htn-Q150-gemedieerde gedragsdisfunctie. (A) Schematisch diagram van de vermijdingstestplaat. (B) Representatieve resultaten van de ontwijkingstest. Vermijdingsindex werd gedefinieerd als de verhouding van nematoden in de N-zone tot het totale aantal nematoden op de plaat. De resultaten worden gepresenteerd als middel ± SD van drie replicaties, representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse van de vermijdingsindex werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde, tweezijdige t-test. **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Totale neuroprotectieve capaciteit van astragalan. Gegevens van drie verschillende assays worden geïmporteerd in OriginPro-software om een radarkaart te maken, die wordt gepresenteerd om het algemene effect van astragalan op meerdere fenotypen gemedieerd door polyQ te profileren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Aangezien polyQ-aggregatie en proteotoxiciteit belangrijke kenmerken zijn van polyQ-aandoeningen, zoals de ziekte van Huntington13, bevelen we het gebruik van meerdere modellen en methoden aan om de neuroprotectieve capaciteit van testverbindingen uitgebreid te evalueren, waaronder de polyQ-aggregatietest in de AM141-stam, de ASH neuronale overlevingstest in de HA759-stam en de chemosensorische vermijdingstest in de HA759-stam. De hier gepresenteerde protocollen zijn gebruikt om de neuroprotectieve capaciteiten van testmonsters tegen polyQ-toxiciteit te evalueren, inclusief remmende effecten op zowel polyQ-aggregatie als geassocieerde neurotoxiciteit 7,14,15,16,17,19,20, wat hun potentieel aantoont in het ontdekken van geneesmiddelen voor de ZvH en andere polyQ-ziekten.
Een geautomatiseerd beeldvormings- en analysesysteem wordt geïntroduceerd voor de detectie en telling van polyQ-aggregaten in de polyQ-aggregatietest. Deze methode heeft de voordelen dat het een hoge doorvoer en tijdsefficiënt is en resulteert in aanzienlijk verminderde subjectieve fouten in het moeizame telproces. Voor een volledige 384-well plaat duurt het slechts <1 uur om beeldacquisitie en -analyse te voltooien. De conventionele microscopische beeldvormingsmethode heeft echter ook vergelijkbare prestaties in dit laboratorium laten zien zonder gebruik te maken van het geautomatiseerde beeldvormingsapparaat7.
Een totaal van 100-150 nematoden per behandeling worden aanbevolen in een typische Q40::YFP-aggregatietest voor elk tijdstip, die kan worden uitgevoerd in replicerende putten die elk 10-15 nematoden bevatten. Er moet echter worden opgemerkt dat L1-larven gevoeliger kunnen zijn voor sommige behandelingen of hogere concentraties. Daarom kunnen hogere doses teststoffen hun groei remmen, wat leidt tot vals-positieve resultaten als gevolg van langzame groei en dus vertraagde polyQ-aggregatie. Gewoonlijk kan een voedselklaringstest worden uitgevoerd om dit probleem aan te pakken en het juiste concentratiebereik van teststoffente waarborgen 23.
De HA759 transgene nematoden die worden gebruikt in polyQ neurotoxiciteitstests coexpressie OSM-10::GFP en Htn-Q150, waardoor het mogelijk is om bilaterale ASH sensorische neuronen ondubbelzinnig te identificeren. Vandaar dat de overleving van ASH-neuronen wordt geëvalueerd door de aan- of afwezigheid van GFP-expressie; meestal zijn ~40-75% van de ASH-neuronen in de controlenematodendood 23,24. Interessant is dat de pqe-1 (polyglutamine enhancer-1) genetische mutante achtergrond in de HA759-stam (pqe-1; Htn-Q150) versnelt polyQ-gemedieerde toxiciteit, wat leidt tot de dood van de meeste ASH-neuronen binnen drie dagen, zelfs bij 15 °C, en daarom wordt deze stam gekweekt bij 15 °C voor de neuronale overlevingstest, zoals eerder gemeld23,24.
Functioneel verlies van ASH-neuronen in HA759-nematoden kan optreden vóór de detectie van celdood en eiwitaggregaten13; daarom is de osmotische vermijdingsgedragstest essentieel voor de beoordeling van polyQ-gemedieerde toxiciteit. Om de potentiële impact van minder actieve HA759-nematoden bij lage temperatuur op gedragsexperimenten te minimaliseren, worden de vermijdingstestplaten geïncubeerd in een bevochtigde incubator van 23 °C in plaats van bij 15 °C zoals in de neuronale overlevingstest met behulp van deze stam. Daarnaast is gemeld dat Htn-Q150/OSM-10::GFP transgene nematoden zeer gevoelig zijn voor neusaanraking; daarom is een alternatieve detectie van de ASH-neuronfunctie de neusaanrakingstest13.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We bedanken voormalige leden van het Huang Lab die hebben geholpen bij het ontwikkelen en verbeteren van de protocollen die in dit artikel worden gebruikt, met name Hanrui Zhang, Lingyun Xiao en Yanxia Xiang. Dit werk werd ondersteund door het 111 Project (subsidienummer B17018) en de Natural Science Foundation van de provincie Hebei (subsidienummer H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
- Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L.
- Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
- Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
- Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
- Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
- Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
- Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
- Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
- Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
- Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
- Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
- Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
- Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
- Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
- Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
- Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
- Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
- Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).
