Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar las actividades neuroprotectoras de los compuestos de prueba en Caenorhabditis elegans, incluida la agregación de poliglutamina, la muerte neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia, así como una integración ejemplar de múltiples fenotipos.
Abstract
El plegamiento incorrecto relacionado con la edad y la agregación de proteínas patógenas son responsables de varias enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, la enfermedad de Huntington (EH) es impulsada principalmente por una repetición de nucleótido CAG que codifica un tracto de glutamina expandido en la proteína huntingtina. Por lo tanto, la inhibición de la agregación de poliglutamina (polyQ) y, en particular, la neurotoxicidad asociada a la agregación es una estrategia útil para la prevención de la EH y otras afecciones asociadas a la poliQ. Este artículo introduce protocolos experimentales generalizados para evaluar la capacidad neuroprotectora de los compuestos de prueba contra la EH utilizando modelos establecidos de Caenorhabditis elegans transgénicos poliQ. La cepa AM141 se elige para el ensayo de agregación polyQ ya que un fenotipo asociado a la edad de agregados fluorescentes discretos se puede observar fácilmente en su pared corporal en la etapa adulta debido a la expresión específica del músculo de las proteínas de fusión polyQ::YFP. En contraste, el modelo HA759 con una fuerte expresión de tractos expandidos por polyQ en las neuronas ASH se utiliza para examinar la muerte neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia. Para evaluar exhaustivamente la capacidad neuroprotectora de los compuestos objetivo, los resultados de las pruebas anteriores se presentan en última instancia como un gráfico de radar con perfiles de múltiples fenotipos en una forma de comparación directa y visualización directa.
Introduction
La neurodegeneración progresiva en la EH implica huntingtina mutante patógena con un estiramiento anormal de poliQ codificado por repeticiones de trinucleótidos CAG 1,2,3. Las proteínas huntingtina mutantes con más de 37 repeticiones de glutamina son propensas a agregarse y acumularse en los cerebros de pacientes con EH y modelos animales 4,5, lo que finalmente conduce a la neurodegeneración6. A pesar de la falta de claridad sobre los roles de los agregados de polyQ en la patología de la enfermedad5, la inhibición de la agregación de polyQ y su toxicidad asociada es una estrategia terapéutica útil para la EH y otras enfermedades poliQ 4,7,8.
Debido a la conservación en las vías de señalización neuronal y a los modelos de enfermedades transgénicas fáciles de construir, Caenorhabditis elegans ha sido ampliamente utilizado como un importante organismo modelo para la investigación de trastornos neurológicos 9,10,11,12. Por ejemplo, los modelos transgénicos de C. elegans que expresan expansiones poliQ propensas a la agregación pueden imitar objetivamente características similares a la EH, como la pérdida selectiva de células neuronales, la formación de agregados citoplasmáticos y los defectos de comportamiento13. La investigación de los efectos potenciales de las muestras de prueba para revertir estos fenotipos en modelos de nematodos poliQ establecidos ha llevado a la identificación de una variedad de candidatos terapéuticos prometedores, por ejemplo, polisacáridos 7,14,15, oligosacáridos16, moléculas pequeñas naturales 17,18 y extractos y fórmulas herbales19,20.
Aquí se describen dos modelos principales de polyQ C. elegans y protocolos relevantes para aplicaciones potenciales, como lo ejemplifica el estudio sobre astragalan, un polisacárido aislado de Astragalus membranaceus7. Para el ensayo de agregación de polyQ en C. elegans, el modelo utilizado es la cepa transgénica AM141, que muestra puncta fluorescente dispersa en su músculo de la pared corporal al llegar a la edad adulta debido a la expresión de la proteína de fusión Q40::YFP, un tracto polyQ de 40 residuos (polyQ40) fusionado con proteína fluorescente amarilla (YFP)21,22 . La cepa HA759 se utilizó para examinar la supervivencia neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia, ya que expresa tanto la proteína fluorescente verde (GFP) como Htn-Q150 (un tracto poliQ derivado de la huntingtina humana de 150 residuos) fuertemente en las neuronas ASH pero débilmente en otras neuronas, lo que resulta en neurodegeneración progresiva y muerte celular ASH 7,13. Se proporciona un resumen completo del potencial neuroprotector de los candidatos terapéuticos mediante la integración de los resultados de diferentes ensayos.
Protocol
NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer las recetas de las soluciones utilizadas en este protocolo.
1. Preparación de materiales para el ensayo Caenorhabditis elegans
- Mantenimiento de cepas de C. elegans
- Obtener cepas de C. elegans (AM141 y HA759) y Escherichia coli (OP50 y NA22) (ver la Tabla de Materiales).
- Mantener los nematodos en la placa de medios de crecimiento de nematodos (NGM) sembrada con E. coli OP50 a 20 °C para AM14121 o 15 °C para HA75923.
- Preparación del cultivo bacteriano de E. coli OP50
- Elija una sola colonia de E. coli OP50 de una placa de rayas de Luria-Bertani (LB) e inocularla en 50 ml de cultivo líquido de LB.
- Incubar la bacteria OP50 en un agitador a 37 °C y 200 rpm hasta una densidad óptica de ~0,5 a 570 nm (OD570).
- Guarde el cultivo bacteriano OP50 a 4 °C y úselo en un plazo de dos semanas.
- Preparación de placas NGM con bacterias OP50
- Agregue 20 g de agar, 2.5 g de peptona, 3.0 g de NaCl y 975 ml de agua desionizada a una botella autoclavable de 1 L. Autoclave a 121 °C durante 30 min.
- Coloque la botella de agar NGM líquido en el banco para que se enfríe a ~ 60 ° C, y luego agregue las siguientes soluciones madre estériles: 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 1 M MgSO4, 1 ml de 5 mg / ml de colesterol y 25 ml de 1 M de fosfato de potasio (pH 6.0).
- Vierta 20 ml de NGM en una placa de Petri estéril de 90 mm y deje las placas en el banco para que se enfríen y solidifiquen. Mantenga las placas boca abajo y déjelas secar en el banco a temperatura ambiente durante 2 días.
- Dispense 200 μL del cultivo bacteriano OP50 en cada placa NGM y extiéndala uniformemente con una varilla de recubrimiento de vidrio estéril. Cierre las tapas e incube las placas durante la noche a 37 °C.
- Guarde las placas NGM sembradas con OP50 en una caja de plástico con una cubierta a temperatura ambiente y úselas dentro de las dos semanas.
- Preparación de la población de C. elegans sincronizada por edad
- Recolecte nematodos adultos grávidos en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y centrífuga a 1000 × g durante 1 min. Lavar tres veces y volver a suspender los nematodos en el tampón M9.
- Agregue un volumen igual de solución de lejía y agite suavemente durante 3-5 min. Controle el blanqueamiento cada 15 s bajo un microscopio de disección.
NOTA: La solución de lejía debe prepararse frescamente antes de su uso mezclando volúmenes iguales de NaOCl al 10% y 1 M de NaOH (Tabla 1)20. - Una vez que la mayoría de los nematodos están rotos, detenga la digestión diluyendo con el tampón M9. Centrifuga rápidamente para retirar el sobrenadante y resuspende el pellet en tampón M9 para repetir el lavado tres veces.
- Resuspendir el pellet en S medio. Deje que los residuos de nematodos se asienten por gravedad durante 2-3 minutos mientras los huevos permanecen en el sobrenadante.
- Aspire el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Recoger los huevos por centrifugación a 1000 × g durante 1 min.
- Deseche ~ 80% del sobrenadante y transfiera los huevos a un matraz estéril que contenga 20 ml de medio S. Coloque el matraz en una coctelera e incube los huevos durante la noche sin alimento a 120 rpm para obtener nematodos L1 sincronizados.
2. Ensayo de agregación PolyQ
- Preparación de nematodos para el ensayo de agregación polyQ
- Transfiera 300-500 larvas L1 sincronizadas de AM141 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 μL de medio S que contenga OP50 (OD570 de 0.7-0.8) y 5 mg / ml de astragalan, típicamente un pocillo por tratamiento durante un punto de tiempo.
- Selle la placa con parafilm e incube a 20 °C y 120 rpm durante 24, 48, 72 y 96 h.
- Cosechar los nematodos en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y lavar con tampón M9 >3 veces por centrifugación (1000 × g durante 1 min) para eliminar el OP50 restante. Resuspenda los nematodos AM141 en el búfer M9 y manténgalos listos para la adquisición de imágenes.
- Adquisición de imágenes fluorescentes y análisis de datos
NOTA: Los datos se analizan automáticamente con este sistema de imágenes de alto contenido. Si no se dispone de un dispositivo de imagen automatizado, se puede utilizar un método convencional para preparar una almohadilla de agarosa para la adquisición de imágenes para lograr un rendimiento similar mediante el uso de un microscopio fluorescente común 7,15,17 (ver pasos 3.2 y 3.3).- Transfiera de 10 a 15 nematodos a cada pozo en una placa de 384 pocillos (volumen final de 80 μL por pozo). Establezca 10 pozos de réplica para cada tratamiento.
- Agregue 10 μL de azida de sodio de 200 mM a cada pozo para paralizar los nematodos y permitir que se asienten hasta el fondo (5-10 min).
- Coloque la placa en un sistema de imágenes de alto contenido para adquirir imágenes fluorescentes (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el dispositivo y el software).
- Abra el software de adquisición de imágenes y configure los siguientes parámetros.
- Abra la ventana Configuración de adquisición de placas y cree un nuevo conjunto de experimentos y un nuevo nombre.
- Seleccione Ampliación como 2x, Agrupación de cámara como 1 y Tipo de placa como placa de 384 pocillos.
- Establezca los pozos y sitios (un solo sitio) que se visitarán.
- Seleccione el filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y habilite las opciones de enfoque basadas en imágenes.
- Establezca la exposición en 300 ms.
NOTA: La configuración anterior se puede probar y ajustar para optimizar los parámetros de imagen. - Guarde la configuración de adquisición de imágenes y haga clic en el botón Adquirir placa para ejecutar.
- Analice los datos de la imagen utilizando el software de análisis de imágenes.
- Abra la ventana Revisar datos de placa y seleccione la placa de prueba para el análisis de imágenes.
- Haga doble clic en un pozo de prueba para mostrar su imagen.
- Seleccione Count Nuclei como método de análisis y haga clic en el botón Configurar opciones para abrir una ventana para las siguientes configuraciones.
- Defina la imagen de origen del canal FITC y seleccione el algoritmo estándar.
- Establezca los parámetros de análisis de imagen de la siguiente manera: ancho mínimo aproximado = 10 μm (= 2 píxeles); ancho máximo aproximado = 50 μm (= 12 píxeles); intensidad por encima del fondo local = 1.000-2.000 niveles de gris.
- Pruebe la configuración actual para optimizar el método de análisis.
- Guarde la configuración y ejecute el análisis en todos los pozos.
NOTA: Se tarda ~ 20 minutos en terminar el análisis de una placa de 384 pocillos. - Exporte el Total de Núcleos como el número total de agregados Q40::YFP en cada pozo.
- Cuente el número de nematodos en cada pozo.
- Calcule el número promedio de agregados Q40::YFP por nematodo en cada grupo y aplique una curva no lineal ajustada a los datos de cada punto de tiempo.
- Calcule el índice de inhibición usando eq (1) a continuación:
Índice de inhibición =
(1)
Donde Ncontrol y Nmuestra son el número promedio de agregados Q40::YFP en los grupos de control y tratamiento, respectivamente.
(1)3. Ensayos de neurotoxicidad mediados por PolyQ
- Tratamiento de C. elegans con muestras de prueba
- Para preparar nematodos para el ensayo de neurotoxicidad polyQ, transfiera 300-500 larvas L1 sincronizadas de HA759 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 μL de medio S que contenga OP50 (OD570 de 0.7-0.8) y 5 mg / ml de astragalan, típicamente tres pocillos replicados para cada tratamiento.
- Selle la placa con parafilm e incube a 15 °C y 120 rpm durante 3 días23.
- Recoger los nematodos por centrifugación y lavar 3-5 veces con tampón M9. Resuspend los nematodos en el tampón M9 para su uso en ensayos de supervivencia neuronal y evitación.
- Preparación de la almohadilla de agarosa
- Agregue 2 g de agarosa a 100 ml de tampón M9 (2%, p/v) y caliente la solución de agarosa en un microondas hasta casi hervir.
- Dispense 0,5 ml de agarosa fundida en el centro de un portaobjetos de vidrio microscopía de 1 mm de espesor colocado entre dos piezas de placas de vidrio de 2 mm de espesor. Cubra con otra diapositiva verticalmente. Una vez que la agarosa se enfríe y se solidifique, retire suavemente la corredera superior.
- Ensayo de supervivencia neuronal ASH
- Agregue una gota de azida de sodio de 20 mM sobre la almohadilla de agarosa. Transfiera 15-20 nematodos HA759 a la gota para inmovilizarlos.
- Coloque un cubrehojas suavemente sobre los nematodos. Mantenga la diapositiva bajo un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital. Seleccione una lente de objetivo 40x y un filtro FITC para detectar neuronas ASH GFP positivas en la región de la cabeza de los nematodos.
- Seleccione más de 50 nematodos en cada grupo al azar para contar el número de nematodos con neuronas ASH bilaterales marcadas con GFP en su región de cabeza7. Calcule la tasa de supervivencia de las neuronas ASH utilizando eq (2) a continuación.
Supervivencia neuronal (%) =
(2)
Donde Nsupervivencia y Ntotal son el número de nematodos con neuronas ASH GFP positivas y el número total de nematodos probados en cada grupo, respectivamente.
- Ensayo de evitación osmótica
- Divida una placa NGM libre de alimentos (9 cm) en zonas normales (N) y trampa (T) por una línea de glicerol de 8 M (~ 30 μL) en el medio. Extienda una línea de azida de sodio de 200 mM (~ 20 μL) a ~ 1 cm de distancia de la línea de glicerol para paralizar los nematodos que cruzan a través de la barrera de glicerol hacia la Zona T.
- Transfiera ~ 200 nematodos cada uno a la Zona N de tres placas replicadas para cada grupo. Agregue una gota de butanediona al 1% (~ 2 μL) en la zona T (1 cm desde el borde de la placa) para atraer a los nematodos. Cubra la tapa de la placa de Petri inmediatamente e incube a 23 °C durante 90 min.
- Puntúe el número de nematodos en las zonas N y T bajo un microscopio. Calcule el índice de evitación utilizando eq (3)20.
Índice de evitación =
(3)
Donde N y T son el número de nematodos en las zonas N y T, respectivamente. Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (DE) de tres réplicas, representativas de >3 experimentos independientes. - Realice una prueba en T de dos colas no apareadas para comparar los datos de los grupos de astragalan y control.
(2)
(3)4. Creación de un gráfico de radar
- Abra el software de gráficos e importe datos de diferentes ensayos en una nueva hoja. Introduzca la columna A(X) como los títulos de los ejes radiales, la columna A(Y) como los datos del grupo de control y la columna B(Y) como los datos del grupo de tratamiento.
- Seleccione los datos requeridos y haga clic en Trazar | Especializado: Botón Radar en el menú de la barra de herramientas para generar un gráfico de radar.
- Haga doble clic en el eje radial y ajuste las etiquetas Escala, Tick y Tick de cada eje según sea necesario.
- Haga clic en Archivo en el menú y seleccione Exportar gráficos para guardar la imagen como *.tiff.
NOTA: Los sitios web de software en la Tabla de materiales proporcionan documentos de ayuda detallados y tutoriales en video sobre la creación de gráficos de radar.
Representative Results
La cepa poliQ transgénica AM141 expresa fuertemente proteínas de fusión Q40::YFP en sus células musculares de la pared corporal 7,21. Como se muestra en la Figura 1A, el fenotipo agregado discreto de esta cepa se puede identificar mediante el protocolo automatizado de imágenes y análisis descrito en este artículo. La cantidad de agregados Q40::YFP en nematodos AM141 aumentó significativamente después de 48 h desde la etapa L1. Sin embargo, esta tendencia al aumento fue inhibida por el tratamiento con astragalan (Figura 1B), demostrando el potencial protector del astragalan frente a la agregación de polyQ. Por lo general, 72 h o 96 h se pueden usar convenientemente como puntos de tiempo para contar los agregados Q40: : YFP para evaluar el efecto antiagregación de las muestras de prueba. En este protocolo, los agregados fluorescentes del nematodo AM141 fueron capturados por un sistema automatizado de imágenes, aunque también se pueden utilizar microscopios de fluorescencia para este propósito7.
La cepa ha759 de C. elegans expresa tanto el marcador GFP como Htn-Q150 en sus neuronas sensoriales ASH, lo que lleva a la pérdida progresiva y la disfunción de estas neuronas11,13. Los nematodos se montaron en almohadillas de agarosa al 2% para determinar la viabilidad neuronal de ASH (Figura 2A) y se visualizaron microscópicamente para detectar las neuronas ASH. Una pérdida de fluorescencia GFP en neuronas ASH bilaterales en las regiones de la cabeza de los nematodos indica la muerte neuronal ASH (Figura 2B). La tasa de supervivencia de las neuronas ASH en los nematodos HA759 es del <40% en el grupo control después de la incubación a 15 °C durante 3 días 7,20, lo que indica neurotoxicidad mediada por poliQ. Por lo tanto, este ensayo de supervivencia neuronal ASH se puede utilizar para evaluar visualmente los efectos de los compuestos de prueba en las neuronas de C. elegans, por ejemplo, el efecto neuroprotector del astragalan pero no del glicano de Poria (Figura 2C).
Como la disfunción del comportamiento es un síntoma clínico importante en las enfermedades polyQ, el ensayo de evitación quimiosensorial (Figura 3A) utilizando un gran número de nematodos HA759 está diseñado como una prueba simplificada para examinar el efecto de las muestras de prueba en la pérdida funcional de las neuronas ASH mediada por la agregación polyQ. Como se muestra en la Figura 3B, el índice de evitación de los nematodos HA759 en el grupo de control no tratado fue de ~ 0.5, similar a lo que se informó anteriormente14. Curiosamente, el índice de evitación aumentó a >0,6 en los nematodos tratados con astragalan a 15 °C durante 3 días (Figura 3B), demostrando un efecto neuroprotector del polisacárido frente a las deficiencias conductuales.
Para evaluar la capacidad neuroprotectora general de los compuestos de prueba, los datos de los ensayos individuales anteriores se pueden integrar y presentar como un gráfico de radar para múltiples fenotipos, lo que lo convierte en una característica unificadora de los fenotipos poliQ adecuados para la comparación directa y la visualización directa. Como se muestra en la Figura 4, el área del triángulo en el grupo de tratamiento con astragalan es mayor que la del grupo de control, lo que indica los efectos anti-polyQ del polisacárido.
Figura 1: Efecto del astragalan sobre la agregación de poliQ40. (A) Imágenes representativas de nematodos AM141 después del tratamiento con o sin astragalan durante 96 h a 20 °C. Las imágenes fluorescentes (paneles izquierdos) se adquirieron de placas de 384 pocillos utilizando un sistema de imágenes y análisis de alto contenido, y los agregados Q40::YFP (paneles derechos) fueron identificados automáticamente por el sistema. Los recuadros son las vistas ampliadas de las imágenes de nematodos que muestran los agregados polyQ. Barras de escala = 500 μm. (B) Cuantificación de agregados Q40::YFP. El número de agregados Q40::YFP en nematodos AM141 se monitorizó utilizando el sistema de imágenes de alto contenido cada 24 h durante 4 días después del tratamiento con o sin astragalan a 20 °C. Aproximadamente 100-150 nematodos en cada grupo fueron calificados para agregados en cada punto de tiempo. Los resultados se muestran como curvas ajustadas basadas en el número medio de agregados por nematodo. Abreviaturas: polyQ = poliglutamina; YFP = proteína fluorescente amarilla; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto del astragalan en la muerte neuronal ASH mediada por Htn-Q150. (A) Diagrama esquemático de la preparación de diapositivas de agarosa. (B) Micrografías representativas de nematodos HA759 con supervivencia neuronal ASH y muerte utilizando un aumento de 400x. Barras de escala = 20 μm. Los nematodos HA759 fueron fotografiados utilizando un microscopio de fluorescencia después del tratamiento con o sin astragalan a 15 °C durante 3 días a partir de L1. (C) Efecto protector del astragalan contra la muerte neuronal ASH mediada por poliQ. Poria glycan, un polisacárido de Poria cocos, se utilizó como control. Los datos se presentan como medias ± SD de tres réplicas, representativas de más de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t de dos colas no apareadas para comparar los datos del grupo control con los de los grupos de astragalan y Poria glycan. *p < 0,05; ns = no significativo. Abreviatura: GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efecto del astragalan en la disfunción conductual mediada por Htn-Q150. (A) Diagrama esquemático de la placa de ensayo de evitación. (B) Resultados representativos del ensayo de evitación. El índice de evitación se definió como la relación entre los nematodos en la zona N y el número total de nematodos en la placa. Los resultados se presentan como medios ± SD de tres réplicas, representativas de tres experimentos independientes. El análisis estadístico del índice de evitación se realizó mediante una prueba t de dos colas no apareada. **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Capacidad neuroprotectora global del astragalan. Los datos de tres ensayos diferentes se importan al software OriginPro para crear un gráfico de radar, que se presenta para perfilar el efecto general de astragalan en múltiples fenotipos mediados por polyQ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Como la agregación de polyQ y la proteotoxicidad son características importantes de los trastornos de polyQ, como la enfermedad de Huntington13, recomendamos el uso de múltiples modelos y métodos para evaluar exhaustivamente la capacidad neuroprotectora de los compuestos de prueba, incluido el ensayo de agregación de polyQ en la cepa AM141, el ensayo de supervivencia neuronal ASH en la cepa HA759 y el ensayo de evitación quimiosensorial en la cepa HA759. Los protocolos aquí presentados se han utilizado para evaluar las capacidades neuroprotectoras de las muestras de ensayo frente a la toxicidad del poliQ, incluyendo efectos inhibitorios tanto sobre la agregación del poliQ como sobre la neurotoxicidad asociada 7,14,15,16,17,19,20, demostrando su potencial en el descubrimiento de fármacos para la EH y otras enfermedades poliQ.
Se introduce un sistema automatizado de imágenes y análisis para la detección y el recuento de agregados poliQ en el ensayo de agregación poliQ. Este método tiene las ventajas de ser de alto rendimiento y eficiente en el tiempo y da como resultado errores subjetivos significativamente reducidos en el laborioso proceso de conteo. Para una placa completa de 384 pocillos, solo se necesitan <1 h para finalizar la adquisición y el análisis de la imagen. Sin embargo, el método de imagen microscópica convencional también ha mostrado un rendimiento similar en este laboratorio sin utilizar el dispositivo de imagen automatizado7.
Se recomienda un total de 100-150 nematodos por tratamiento en un ensayo de agregación Q40::YFP típico para cada punto de tiempo, que se puede realizar en pozos replicados que contienen 10-15 nematodos cada uno. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las larvas de L1 pueden ser más sensibles a algunos tratamientos o concentraciones más altas. Por lo tanto, dosis más altas de compuestos de prueba podrían inhibir su crecimiento, lo que lleva a resultados falsos positivos debido al crecimiento lento y, por lo tanto, a la agregación de polyQ retrasada. Por lo general, se puede realizar un ensayo de aclaramiento de alimentos para abordar esta preocupación y garantizar el rango de concentración adecuado de los compuestos de prueba23.
Los nematodos transgénicos HA759 utilizados en los ensayos de neurotoxicidad poliQ coexpresan OSM-10::GFP y Htn-Q150, lo que permite identificar inequívocamente las neuronas sensoriales ASH bilaterales. Por lo tanto, la supervivencia de la neurona ASH se evalúa por la presencia o ausencia de expresión de GFP; por lo general, ~ 40-75% de las neuronas ASH en los nematodos de control están muertas23,24. Curiosamente, el fondo mutante genético pqe-1 (potenciador de poliglutamina-1) en la cepa HA759 (pqe-1; Htn-Q150) acelera la toxicidad mediada por poliQ, lo que lleva a la muerte de la mayoría de las neuronas ASH en tres días, incluso a 15 ° C, y por lo tanto esta cepa se cultiva a 15 ° C para el ensayo de supervivencia neuronal, como se informó anteriormente23,24.
La pérdida funcional de neuronas ASH en nematodos HA759 puede ocurrir antes de la detección de muerte celular y agregados de proteínas13; por lo tanto, el ensayo de comportamiento de evitación osmótica es esencial para la evaluación de la toxicidad mediada por poliQ. Para minimizar el impacto potencial de los nematodos HA759 menos activos a baja temperatura en los experimentos de comportamiento, las placas de ensayo de evitación se incuban en una incubadora humidificada de 23 ° C en lugar de a 15 ° C como en el ensayo de supervivencia neuronal utilizando esta cepa. Además, se ha informado que los nematodos transgénicos Htn-Q150/OSM-10::GFP son altamente sensibles al tacto nasal; por lo tanto, una detección alternativa de la función de la neurona ASH es el ensayo de contacto nasal13.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a los ex miembros del Laboratorio Huang que han ayudado a desarrollar y mejorar los protocolos utilizados en este documento, en particular, Hanrui Zhang, Lingyun Xiao y Yanxia Xiang. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto 111 (número de subvención B17018) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hebei (número de subvención H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
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