Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere nevrobeskyttende aktiviteter av testforbindelser i Caenorhabditis elegans, inkludert polyglutaminaggregering, nevronal død og kjemoavoidansadferd, samt en eksemplarisk integrasjon av flere fenotyper.
Abstract
Aldersrelatert feilfolding og aggregering av patogene proteiner er ansvarlige for flere nevrodegenerative sykdommer. For eksempel er Huntingtons sykdom (HS) hovedsakelig drevet av en CAG-nukleotidrepetisjon som koder for en utvidet glutaminkanal i huntingtin-protein. Dermed er hemming av polyglutamin (polyQ) aggregering og spesielt aggregeringsassosiert nevrotoksisitet en nyttig strategi for forebygging av HS og andre polyQ-assosierte tilstander. Denne artikkelen introduserer generaliserte eksperimentelle protokoller for å vurdere den nevrobeskyttende kapasiteten til testforbindelser mot HS ved bruk av etablerte polyQ-transgene Caenorhabditis elegans-modeller . AM141-stammen er valgt for polyQ-aggregeringsanalysen, da en aldersassosiert fenotype av diskrete fluorescerende aggregater lett kan observeres i kroppsveggen på voksenstadiet på grunn av muskelspesifikt uttrykk av polyQ: YFP-fusjonsproteiner. I motsetning til dette brukes HA759-modellen med sterkt uttrykk for polyQ-utvidede kanaler i ASH-nevroner til å undersøke nevronal død og kjemoavoidansadferd. For å evaluere den nevrobeskyttende kapasiteten til målforbindelser, presenteres de ovennevnte testresultatene til slutt som et radardiagram med profilering av flere fenotyper på en måte som direkte sammenligning og direkte visning.
Introduction
Progressiv nevrodegenerasjon ved HS involverer patogen mutert huntingtin med en unormal strekning av polyQ kodet av CAG trinukleotid som gjentar 1,2,3. Muterte huntingtinproteiner med mer enn 37 glutaminrepetisjoner er tilbøyelige til å aggregere og akkumuleres i hjernen til HS-pasienter og dyremodeller 4,5, noe som til slutt fører til nevrodegenerasjon6. Til tross for mangelen på klarhet om rollene til polyQ-aggregater i sykdomspatologi5, er inhibering av polyQ-aggregering og tilhørende toksisitet en nyttig terapeutisk strategi for HS og andre polyQ-sykdommer 4,7,8.
På grunn av bevaring i nevronale signalveier og lett å konstruere transgene sykdomsmodeller, har Caenorhabditis elegans blitt mye brukt som en viktig modellorganisme for undersøkelse av nevrologiske lidelser 9,10,11,12. For eksempel kan transgene C. elegans-modeller som uttrykker aggregeringsutsatte polyQ-utvidelser objektivt etterligne HS-lignende egenskaper som selektivt nevroncelletap, cytoplasmatisk aggregatdannelse og atferdsdefekter13. Undersøkelse av de potensielle effektene av testprøver for å reversere disse fenotypene i etablerte polyQ nematodemodeller har ført til identifisering av en rekke lovende terapeutiske kandidater, for eksempel polysakkarider 7,14,15, oligosakkarider16, naturlige små molekyler17,18 og urteekstrakter og formler19,20.
Beskrevet her er to hovedmodeller av polyQ C. elegans og relevante protokoller for potensielle anvendelser som eksemplifisert ved studien på astragalan, et polysakkarid isolert fra Astragalus membranaceus7. For polyQ-aggregeringsanalysen i C. elegans er modellen som brukes den transgene stammen AM141, som viser fluorescerende puncta spredt i kroppsveggmuskelen når den når voksen alder på grunn av uttrykket av Q40: YFP-fusjonsproteinet, en polyQ-kanal på 40 rester (polyQ40) smeltet til gult fluorescerende protein (YFP) 21,22 . Stammen HA759 ble brukt til å undersøke nevronoverlevelse og kjemoavoidansadferd da den uttrykker både grønt fluorescerende protein (GFP) og Htn-Q150 (en human huntingtin-avledet polyQ-kanal på 150 rester) sterkt i ASH-nevroner, men svakt i andre nevroner, noe som resulterer i progressiv nevrodegenerasjon og ASH-celledød 7,13. En omfattende oppsummering av det nevrobeskyttende potensialet til terapeutiske kandidater er gitt ved å integrere resultater fra forskjellige analyser.
Protocol
MERK: Se tabell 1 for oppskrifter av løsninger som brukes i denne protokollen.
1. Forberedelse av materialer til Caenorhabditis elegans analyse
- Vedlikehold av C. elegans stammer
- Skaff C. elegans (AM141 og HA759) og Escherichia coli (OP50 og NA22) stammer (se materialtabellen).
- Vedlikehold nematodene på NGM-platen (nematode growth media) sådd med E. coli OP50 ved 20 °C for AM14121 eller 15 °C for HA75923.
- Fremstilling av E. coli OP50 bakteriekultur
- Velg en enkelt koloni av E. coli OP50 fra en Luria-Bertani (LB) strekplate og inokuler den til 50 ml flytende LB-kultur.
- Inkuber OP50-bakteriene i en shaker ved 37 °C og 200 o/min til en optisk tetthet på ~0,5 ved 570 nm (OD570).
- Oppbevar OP50 bakteriekultur ved 4 °C og bruk den innen to uker.
- Fremstilling av NGM-plater med OP50 bakterier
- Tilsett 20 g agar, 2,5 g pepton, 3,0 g NaCl og 975 ml avionisert vann til en 1 L autoklaverbar flaske. Autoklav ved 121 °C i 30 min.
- Plasser den flytende NGM-agarflasken på benken for å avkjøles til ~60 °C, og tilsett deretter følgende sterile stamløsninger: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg/ml kolesterol og 25 ml 1 M kaliumfosfat (pH 6,0).
- Hell 20 ml NGM i en steril 90 mm petriskål, og la tallerkenene ligge på benken for å avkjøles og stivne. Hold platene opp ned og la dem tørke på benken ved romtemperatur i 2 dager.
- Dispenser 200 μL av OP50 bakteriekultur på hver NGM-plate og fordel jevnt med en steril glassbeleggstang. Lukk lokkene og rug platene over natten ved 37 °C.
- Oppbevar NGM-platene sådd med OP50 i en plastboks med et deksel ved romtemperatur og bruk innen to uker.
- Forberedelse av alderssynkronisert C. elegans befolkning
- Samle gravide voksne nematoder i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuge ved 1000 × g i 1 minutt. Vask tre ganger og resuspender nematoder i M9 buffer.
- Tilsett et like stort volum blekemiddelløsning og omrør forsiktig i 3-5 minutter. Overvåk bleking hver 15 s under et dissekeringsmikroskop.
MERK: Blekemiddeloppløsningen må tilberedes ferskt før bruk ved å blande like store mengder 10 % NaOCl og 1 M NaOH (tabell 1)20. - Når de fleste nematoder er ødelagt, stopp fordøyelsen ved å fortynne med M9 buffer. Sentrifuger raskt for å fjerne supernatanten og sett pelleten i M9-buffer for å gjenta vasken tre ganger.
- Resuspender pelleten i S medium. La nematoderestene slå seg ned av tyngdekraften i 2-3 minutter mens eggene forblir i supernatanten.
- Aspirer supernatanten inn i et nytt sterilt mikrosentrifugerør. Samle eggene ved sentrifugering ved 1000 × g i 1 min.
- Kast ~80 % av supernatanten og overfør eggene til en steril kolbe som inneholder 20 ml S medium. Legg kolben i en shaker og rug eggene over natten uten mat ved 120 o / min for å oppnå synkroniserte L1-nematoder.
2. PolyQ aggregering analyse
- Fremstilling av nematoder for polyQ aggregeringsanalyse
- Overfør 300-500 synkroniserte L1 larver av AM141 til hver brønn av en 48-brønns plate med 500 μL S-medium som inneholder OP50 (OD570 på 0,7-0,8) og 5 mg / ml astragalan, vanligvis en brønn per behandling for ett tidspunkt.
- Forsegl platen med parafilm og inkuber ved 20 °C og 120 o/min i 24, 48, 72 og 96 timer.
- Høst nematodene i et sterilt mikrosentrifugerrør på 1,5 ml og vask med M9-buffer >3 ganger ved sentrifugering (1000 × g i 1 min) for å fjerne gjenværende OP50. Resuspender AM141 nematoder i M9 buffer, og hold dem klare for bildeinnsamling.
- Innsamling av fluorescerende bilder og dataanalyse
MERK: Data analyseres automatisk med dette bildebehandlingssystemet med høyt innhold. Hvis en automatisert bildebehandlingsenhet ikke er tilgjengelig, kan en konvensjonell metode for å klargjøre en agarosepute for bildeinnsamling brukes til å oppnå lignende ytelse ved å bruke et vanlig fluorescerende mikroskop 7,15,17 (se trinn 3.2 og 3.3).- Overfør 10-15 nematoder til hver brønn i en plate med 384 brønner (endelig volum 80 μL per brønn). Sett 10 replikasjonsbrønner for hver behandling.
- Tilsett 10 μL 200 mM natriumazid til hver brønn for å lamme nematodene og la dem slå seg ned til bunnen (5-10 min).
- Plasser platen i et bildesystem med høyt innhold for å få fluorescerende bilder (se materialtabellen for enhets- og programvareinformasjon).
- Åpne bildeopptaksprogramvaren og sett opp følgende parametere.
- Åpne vinduet Plateinnhentingsoppsett og opprett et nytt eksperimentsett og navn.
- Velg Forstørrelse som 2x, Kamera binning som 1, og Plate type som 384-brønn plate.
- Angi brønnene og nettstedene (enkeltsted) som skal besøkes.
- Velg filteret fluoresceinisotiocyanat (FITC) og aktiver bildebaserte fokuseringsalternativer.
- Sett eksponeringen som 300 ms.
MERK: Innstillingene ovenfor kan testes og justeres for å optimalisere bildeparametrene. - Lagre innstillinger for bildeinnhenting og klikk på Skaff plate-knappen for å kjøre.
- Analyser bildedataene ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren.
- Åpne vinduet Gjennomgangsplatedata og velg Testplate for bildeanalyse.
- Dobbeltklikk på en testbrønn for å vise bildet.
- Velg Count Nuclei som analysemetode og klikk på Konfigurer innstillinger-knappen for å få frem et vindu for følgende innstillinger.
- Definer kildebildet fra FITC-kanalen, og velg Standardalgoritme.
- Angi bildeanalyseparametrene som følger: omtrentlig minimumsbredde = 10 μm (= 2 piksler); omtrentlig maksimal bredde = 50 μm (= 12 piksler); intensitet over lokal bakgrunn = 1.000-2.000 grånivåer.
- Test gjeldende innstillinger for å optimalisere analysemetoden.
- Lagre innstillingene og kjør analysen på alle brønnene.
MERK: Det tar ~ 20 minutter å fullføre analysen for en 384-brønns plate. - Eksporter totalkjernene som totalt antall Q40::YFP aggregater i hver brønn.
- Telle antall nematoder i hver brønn.
- Beregn gjennomsnittlig antall Q40::YFP-aggregater per nematode i hver gruppe, og bruk en ikke-lineær kurvetilpasning på dataene fra hvert tidspunkt.
- Beregn hemmingsindeksen ved hjelp av eq (1) nedenfor:
Hemming indeks =
(1)
HvorN-kontroll ogN-prøve er gjennomsnittlig antall Q40::YFP-aggregater i henholdsvis kontroll- og behandlingsgruppene.
(1)3. PolyQ-medierte nevrotoksisitetsanalyser
- Behandling av C. elegans med testprøver
- For å forberede nematoder for polyQ nevrotoksisitetsanalyse, overfør 300-500 synkroniserte L1 larver av HA759 til hver brønn av en 48-brønns plate med 500 μL S-medium som inneholder OP50 (OD570 på 0,7-0,8) og 5 mg / ml astragalan, vanligvis tre replikasjonsbrønner for hver behandling.
- Forsegl platen med parafilm og rug ved 15 °C og 120 o/min i 3 dager23.
- Samle nematoder ved sentrifugering og vask 3-5 ganger med M9 buffer. Resuspender nematodene i M9 buffer for bruk i nevronale overlevelses- og unngåelsesanalyser.
- Forberedelse av agarosepute
- Tilsett 2 g agarose til 100 ml M9-buffer (2 %, w/v) og varm agaroseoppløsningen i mikrobølgeovn til nærkoking.
- Dispenser 0,5 ml smeltet agarose på midten av en 1 mm tykk mikroskopiglassglassplate plassert mellom to stykker 2 mm tykke glassplater. Dekk med et annet lysbilde vertikalt. Når agarose kjøler seg ned og er størknet, fjern forsiktig toppsklien.
- ASH neuronal overlevelse analyse
- Tilsett en dråpe 20 mM natriumazid på agaroseputen. Overfør 15-20 HA759 nematoder inn i dråpen for å immobilisere dem.
- Plasser en coverlip forsiktig over nematoder. Hold lysbildet under et fluorescensmikroskop utstyrt med et digitalkamera. Velg en 40x objektivlinse og FITC-filter for å oppdage GFP-positive ASH-nevroner i hodeområdet til nematodene.
- Velg mer enn 50 nematoder i hver gruppe tilfeldig for å telle antall nematoder med GFP-merkede bilaterale ASH-nevroner i hodeområdet7. Beregn overlevelsesraten for ASH-nevroner ved hjelp av eq (2) nedenfor.
Nevronal overlevelse (%) =
(2)
HvorN-overlevelse og Ntotalt er antall nematoder med GFP-positive ASH-nevroner og totalt antall testede nematoder i hver gruppe, henholdsvis.
- Osmotisk unngåelsesanalyse
- Del en matfri NGM-tallerken (9 cm) i normale (N) og felle (T) soner med en 8 M glyserol (~ 30 μL) linje i midten. Spred en 200 mM natriumazidlinje (~ 20 μL) ved ~ 1 cm fra glyserollinjen for å lamme nematodene som krysser gjennom glyserolbarrieren til sone T.
- Overfør ~ 200 nematoder hver til sone N av tre replikasjonsplater for hver gruppe. Tilsett en dråpe på 1% butanedion (~ 2 μL) på sone T (1 cm fra platekanten) for å tiltrekke nematoder. Dekk lokket på petriskålen umiddelbart, og rug ved 23 °C i 90 minutter.
- Score antall nematoder på N- og T-sonene under et mikroskop. Beregn unngåelsesindeksen ved hjelp av eq (3)20.
Unngåelsesindeks =
(3)
Hvor N og T er antall nematoder i henholdsvis N- og T-soner. Data presenteres som midler ± standardavvik (SD) av tre replikasjoner, representative for >3 uavhengige eksperimenter. - Utfør en uparret, tosidig t-test for å sammenligne dataene fra astragalan og kontrollgruppene.
(2)
(3)4. Opprette et radarkart
- Åpne grafikkprogramvaren og importer data fra forskjellige analyser til et nytt ark. Skriv inn A(X)-kolonnen som titlene på radiaksene, A(Y)-kolonnen som dataene fra kontrollgruppen og B(Y)-kolonnen som dataene fra behandlingsgruppen.
- Velg de nødvendige dataene og klikk på Plot | Spesialisert: Radarknapp i verktøylinjemenyen for å generere et radardiagram.
- Dobbeltklikk på sirkelaksen, og juster etikettene Skala, Kryss av og Kryss av for hver akse etter behov.
- Klikk på Fil i menyen og velg Eksporter grafer for å lagre bildet som * .tiff.
MERK: Programvarenettstedene i materialtabellen gir detaljerte hjelpedokumenter og videoopplæringer om å lage radardiagrammer.
Representative Results
Den transgene polyQ-stammen AM141 uttrykker sterkt Q40::YFP-fusjonsproteiner i muskelcellene i kroppsveggen 7,21. Som vist i figur 1A, kan den diskrete aggregerte fenotypen av denne stammen identifiseres ved hjelp av den automatiserte bilde- og analyseprotokollen beskrevet i denne artikkelen. Mengden Q40::YFP aggregater i AM141 nematoder økte betydelig etter 48 timer fra L1-stadiet. Denne tendensen til økning ble imidlertid hemmet av astragalanbehandling (figur 1B), noe som viste det beskyttende potensialet til astragalan mot polyQ-aggregering. Vanligvis kan enten 72 timer eller 96 timer enkelt brukes som tidspunkt for å telle Q40::YFP-aggregater for å evaluere antiaggregeringseffekten av testprøver. I denne protokollen ble fluorescerende aggregater av AM141 nematode fanget av et automatisert bildebehandlingssystem, selv om fluorescensmikroskoper også kan brukes til dette formålet7.
C. elegans-stammen HA759 uttrykker både GFP-markøren og Htn-Q150 i sine sensoriske ASH-nevroner, noe som fører til progressivt tap og dysfunksjon av disse nevronene 11,13. Nematodene ble montert på 2% agaroseputer for å bestemme ASH-nevronens levedyktighet (figur 2A) og visualisert mikroskopisk for å oppdage ASH-nevronene. Et tap av GFP-fluorescens i bilaterale ASH-nevroner i hodeområdene til nematoder indikerer ASH-nevrondøden (figur 2B). Overlevelsesraten for ASH-nevroner i HA759-nematoder er <40 % i kontrollgruppen etter inkubasjon ved 15 °C i 3 dager 7,20, noe som indikerer polyQ-mediert nevrotoksisitet. Derfor kan denne ASH-nevronale overlevelsesanalysen brukes til å visuelt evaluere effekten av testforbindelser på C. elegans-nevroner, for eksempel den nevrobeskyttende effekten av astragalan, men ikke Poria-glykan (figur 2C).
Siden atferdsdysfunksjon er et viktig klinisk symptom ved polyQ-sykdommer, er den kjemosensoriske unngåelsesanalysen (figur 3A) ved bruk av et stort antall HA759-nematoder utformet som en forenklet test for å undersøke effekten av testprøver på det funksjonelle tapet av ASH-nevroner mediert av polyQ-aggregering. Som vist i figur 3B var unngåelsesindeksen for HA759-nematoder i den ubehandlede kontrollgruppen ~0,5, tilsvarende det som tidligere er rapportert14. Interessant nok økte unngåelsesindeksen til >0,6 i nematodene behandlet med astragalan ved 15 °C i 3 dager (figur 3B), noe som viser en nevroprotektiv effekt av polysakkaridet mot atferdssvikt.
For å evaluere den totale nevrobeskyttende kapasiteten til testforbindelser, kan dataene fra de ovennevnte individuelle analysene integreres og presenteres som et radardiagram for flere fenotyper, noe som gjør det til et samlende trekk ved polyQ-fenotyper som er egnet for direkte sammenligning og direkte visning. Som vist i figur 4 er arealet av trekanten i astragalan-behandlingsgruppen større enn kontrollgruppen, noe som indikerer polysakkaridets antipolyQ-effekter.
Figur 1: Effekt av astragalan på polyQ40-aggregering. (A) Representative bilder av AM141-nematoder etter behandling med eller uten astragalan i 96 timer ved 20 °C. De fluorescerende bildene (venstre paneler) ble hentet fra 384-brønns plater ved hjelp av et bilde- og analysesystem med høyt innhold, og Q40: : YFP-aggregatene (høyre paneler) ble automatisk identifisert av systemet. Innfelt er forstørrede visninger av nematodebilder som viser polyQ-aggregatene. Skalastenger = 500 μm. (B) Kvantifisering av Q40::YFP aggregater. Antall Q40::YFP-aggregater i AM141-nematoder ble overvåket ved hjelp av høyinnholdsbildesystemet hver 24. time i 4 dager etter behandling med eller uten astragalan ved 20 °C. Omtrent 100-150 nematoder i hver gruppe ble skåret for aggregater ved hvert tidspunkt. Resultatene er vist som tilpassede kurver basert på gjennomsnittlig antall aggregater per nematode. Forkortelser: polyQ = polyglutamin; YFP = gul fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekt av astragalan på Htn-Q150-mediert ASH nevronal død. (B) Representative mikrografer av HA759 nematoder med ASH nevronal overlevelse og død ved bruk av 400x forstørrelse. Skala barer = 20 μm. HA759-nematodene ble fotografert med fluorescensmikroskop etter behandling med eller uten astragalan ved 15 °C i 3 dager fra L1. (C) Beskyttende effekt av astragalan mot polyQ-mediert ASH nevronal død. Poria glykan, et polysakkarid fra Poria cocos, ble brukt som kontroll. Data presenteres som midler ± SD av tre replikasjoner, representative for mer enn tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en uparret, tosidig t-test for å sammenligne data fra kontrollgruppen med data fra astragalan- og Poria-glykangruppene. *p < 0,05; ns = ingen signifikant. Forkortelse: GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av astragalan på Htn-Q150-mediert atferdsdysfunksjon. (A) Skjematisk diagram over unngåelsesanalyseplaten. (B) Representative resultater av unngåelsesanalyse. Unngåelsesindeks ble definert som forholdet mellom nematoder i N-sonen og det totale antall nematoder på platen. Resultatene presenteres som midler ± SD av tre replikasjoner, representative for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse av unngåelsesindeks ble utført med uparret, tosidig t-test. **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Total nevroprotektiv kapasitet av astragalan. Data fra tre forskjellige analyser importeres til OriginPro-programvaren til et radardiagram, som presenteres for å profilere den generelle effekten av astragalan på flere fenotyper mediert av polyQ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Siden polyQ-aggregering og proteotoksisitet er viktige trekk ved polyQ-lidelser, som Huntingtons sykdom13, anbefaler vi bruk av flere modeller og metoder for omfattende evaluering av testforbindelsenes nevrobeskyttende kapasitet, inkludert polyQ-aggregeringsanalysen i AM141-stammen, ASH-nevronal overlevelsesanalysen i HA759-stammen og den kjemosensoriske unngåelsesanalysen i HA759-stammen. Protokollene som presenteres her har blitt brukt til å evaluere testprøvers nevroprotektive kapasitet mot polyQ-toksisitet, inkludert hemmende effekter på både polyQ-aggregering og assosiert nevrotoksisitet 7,14,15,16,17,19,20, noe som demonstrerer deres potensial i legemiddeloppdagelse for HS og andre polyQ-sykdommer.
Et automatisert bilde- og analysesystem er introdusert for deteksjon og telling av polyQ-aggregater i polyQ-aggregeringsanalysen. Denne metoden har fordelene ved å være høy gjennomstrømning og tidseffektiv og resulterer i betydelig reduserte subjektive feil i den arbeidskrevende telleprosessen. For en hel plate med 384 brønner tar det bare <1 time å fullføre bildeinnhenting og analyse. Imidlertid har den konvensjonelle mikroskopiske bildemetoden også vist lignende ytelse i dette laboratoriet uten å bruke den automatiserte bildeenheten7.
Totalt 100-150 nematoder per behandling anbefales i en typisk Q40::YFP aggregeringsanalyse for hvert tidspunkt, som kan utføres i replikasjonsbrønner som inneholder 10-15 nematoder hver. Det skal imidlertid bemerkes at L1 larver kan være mer følsomme for noen behandlinger eller høyere konsentrasjoner. Derfor kan høyere doser av testforbindelser hemme veksten, noe som fører til falske positive resultater på grunn av langsom vekst og dermed forsinket polyQ-aggregering. Vanligvis kan en matklareringsanalyse utføres for å løse denne bekymringen og sikre riktig konsentrasjonsområde for testforbindelser23.
DE HA759-transgene nematodene som brukes i polyQ nevrotoksisitet analyserer coexpress OSM-10::GFP og Htn-Q150, noe som gjør det mulig å entydig identifisere bilaterale ASH sensoriske nevroner. Derfor evalueres ASH-nevronoverlevelse ved tilstedeværelse eller fravær av GFP-uttrykk; vanligvis er ~ 40-75% av ASH-nevronene i kontrollnematodene døde23,24. Interessant nok er pqe-1 (polyglutamin enhancer-1) genetisk mutant bakgrunn i HA759-stammen (pqe-1; Htn-Q150) akselererer polyQ-mediert toksisitet, noe som fører til død av de fleste ASH-nevroner innen tre dager, selv ved 15 ° C, og derfor dyrkes denne stammen ved 15 ° C for nevronal overlevelsesanalyse, som tidligere rapportert23,24.
Funksjonstap av ASH-nevroner i HA759-nematoder kan forekomme før påvisning av celledød og proteinaggregater13; Derfor er analysen av osmotisk unngåelsesatferd avgjørende for vurdering av polyQ-mediert toksisitet. For å minimere den potensielle effekten av mindre aktive HA759-nematoder ved lav temperatur på atferdseksperimenter, inkuberes unngåelsesanalyseplatene i en fuktet 23 °C-inkubator i stedet for ved 15 °C som i nevronoverlevelsesanalysen ved bruk av denne stammen. I tillegg er det rapportert at Htn-Q150/OSM-10::GFP transgene nematoder er svært følsomme for neseberøring; derfor er en alternativ påvisning av ASH-nevronfunksjonen neseberøringsanalysen13.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker tidligere medlemmer av Huang Lab som har bidratt til å utvikle og forbedre protokollene som brukes i denne artikkelen, spesielt Hanrui Zhang, Lingyun Xiao og Yanxia Xiang. Dette arbeidet ble støttet av 111-prosjektet (tilskuddsnummer B17018) og Natural Science Foundation of Hebei-provinsen (tilskuddsnummer H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
- Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L.
- Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
- Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
- Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
- Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
- Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
- Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
- Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
- Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
- Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
- Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
- Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
- Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
- Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
- Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
- Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
- Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
- Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).
