Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки нейропротекторной активности тестовых соединений в Caenorhabditis elegans, включая агрегацию полиглутамина, гибель нейронов и поведение химиообнаружения, а также образцовую интеграцию нескольких фенотипов.
Abstract
Возрастное неправильное сворачивание и агрегация патогенных белков ответственны за несколько нейродегенеративных заболеваний. Например, болезнь Гентингтона (БГ) в основном обусловлена ЦАГ-нуклеотидным повтором, который кодирует расширенный глютаминовый тракт в белке гентингтина. Таким образом, ингибирование агрегации полиглутамина (polyQ) и, в частности, агрегационно-ассоциированной нейротоксичности является полезной стратегией профилактики БГ и других полиQ-ассоциированных состояний. В данной работе представлены обобщенные экспериментальные протоколы для оценки нейропротекторной способности тестовых соединений против БГ с использованием установленных моделей polyQ transgenic Caenorhabditis elegans . Штамм AM141 выбран для анализа агрегации polyQ, поскольку возрастной фенотип дискретных флуоресцентных агрегатов можно легко наблюдать в стенке его тела на взрослой стадии из-за мышечной экспрессии белков слияния polyQ::YFP. Напротив, модель HA759 с сильной экспрессией полиQ-расширенных трактов в нейронах ASH используется для изучения гибели нейронов и поведения химиопопущения. Для всесторонней оценки нейропротекторной способности целевых соединений приведенные выше результаты испытаний в конечном итоге представляются в виде радиолокационной диаграммы с профилированием нескольких фенотипов способом прямого сравнения и прямого просмотра.
Introduction
Прогрессирующая нейродегенерация при БГ включает патогенный мутантный гентингтин с аномальным растяжением polyQ, кодируемым CAG тринуклеотидными повторами 1,2,3. Мутантные белки гентингтина с более чем 37 повторами глутамина склонны к агрегированию и накоплению в мозге пациентов с БГ и животных моделей 4,5, что в конечном итоге приводит к нейродегенерации6. Несмотря на отсутствие ясности в отношении роли агрегатов polyQ в патологии заболевания5, ингибирование агрегации polyQ и связанной с ней токсичности является полезной терапевтической стратегией для БГ и других заболеваний polyQ 4,7,8.
Благодаря сохранению в нейронных сигнальных путях и простых в построении трансгенных моделей заболеваний, Caenorhabditis elegans широко используется в качестве основного модельного организма для исследования неврологических расстройств 9,10,11,12. Например, трансгенные модели C. elegans, экспрессирующие склонные к агрегации расширения polyQ, могут объективно имитировать HD-подобные особенности, такие как селективная потеря нейронных клеток, формирование цитоплазматического агрегата и поведенческие дефекты13. Исследование потенциальных эффектов тестовых образцов для обращения вспять этих фенотипов в установленных моделях нематод polyQ привело к идентификации различных перспективных терапевтических кандидатов, например, полисахаридов 7,14,15, олигосахаридов16, природных малых молекул17,18 и растительных экстрактов и формул19,20.
Здесь описаны две основные модели polyQ C. elegans и соответствующие протоколы для потенциальных применений, примером которых является исследование астрагалана, полисахарида, выделенного из Astragalus membranaceus7. Для анализа агрегации polyQ у C. elegans используется трансгенный штамм AM141, который показывает флуоресцентную пункту, диспергированную в мышце стенки тела при достижении зрелого возраста из-за экспрессии белка слияния Q40::YFP, тракта polyQ из 40 остатков (polyQ40), слитого с желтым флуоресцентным белком (YFP)21,22 . Штамм HA759 был использован для изучения выживаемости нейронов и хемоэкономического поведения, поскольку он экспрессирует как зеленый флуоресцентный белок (GFP), так и Htn-Q150 (человеческий гентингтиновый тракт polyQ из 150 остатков) сильно в нейронах ASH, но слабо в других нейронах, что приводит к прогрессирующей нейродегенерации и гибели клеток ASH 7,13. Всестороннее резюме нейропротекторного потенциала терапевтических кандидатов обеспечивается путем интеграции результатов различных анализов.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты решений, используемых в этом протоколе, см. в таблице 1 .
1. Подготовка материалов для анализа Caenorhabditis elegans
- Поддержание штаммов C. elegans
- Получение штаммов C. elegans (AM141 и HA759) и Escherichia coli (OP50 и NA22) (см. Таблицу материалов).
- Поддерживайте нематод на пластине среды роста нематод (NGM), засеянной E. coli OP50 при 20 °C для AM14121 или 15 °C для HA75923.
- Получение бактериальной культуры E. coli OP50
- Выберите одну колонию E. coli OP50 из пластины полосы Лурия-Бертани (LB) и привите ее в 50 мл жидкой культуры LB.
- Инкубируйте бактерии OP50 в шейкере при 37 °C и 200 об/мин до оптической плотности ~0,5 при 570 нм (OD570).
- Храните бактериальную культуру OP50 при температуре 4 °C и используйте ее в течение двух недель.
- Приготовление пластин NGM с бактериями OP50
- Добавьте 20 г агара, 2,5 г пептона, 3,0 г NaCl и 975 мл деионизированной воды в автоклавируемую бутылку объемом 1 л. Автоклав при 121 °C в течение 30 мин.
- Поместите бутылку с жидким агаром NGM на скамейку для охлаждения до ~60 °C, а затем добавьте следующие стерильные растворы: 1 мл 1 M CaCl2, 1 мл 1 M MgSO4, 1 мл 5 мг /мл холестерина и 25 мл 1 М фосфата калия (рН 6,0).
- Налейте 20 мл NGM в стерильную 90-миллиметровую чашку Петри и оставьте тарелки на скамейке для охлаждения и затвердевания. Держите тарелки вверх ногами и дайте им высохнуть на скамейке при комнатной температуре в течение 2 дней.
- Распределите 200 мкл бактериальной культуры OP50 на каждую пластину NGM и равномерно распределите стерильным стеклянным стержнем. Закройте крышки и высиживайте пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
- Храните пластины NGM, засеянные OP50, в пластиковой коробке с крышкой при комнатной температуре и используйте в течение двух недель.
- Подготовка синхронизированной по возрасту популяции C. elegans
- Собрать гравидных взрослых нематод в стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 мл и центрифугу по 1000 × г в течение 1 мин. Промыть три раза и повторно суспендировать нематод в буфере М9.
- Добавить равный объем отбеливающего раствора и осторожно перемешивать в течение 3-5 мин. Контролируйте отбеливание каждые 15 с под рассекающим микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отбеливающий раствор должен быть приготовлен свежим перед использованием путем смешивания равных объемов 10% NaOCl и 1 M NaOH (Таблица 1)20. - Как только большинство нематод будут разрушены, остановите пищеварение, разбавив буфером M9. Быстро центрифуга для удаления супернатанта и повторного суспендирования гранулы в буфере M9 для повторения промывки три раза.
- Повторно суспендировать гранулу в S-среде. Дайте остаться остаткам нематод под действием силы тяжести в течение 2-3 минут, пока яйца остаются в надосадочном веществе.
- Аспирируйте супернатант в новую стерильную микроцентрифужную трубку. Собрать яйца центрифугированием при 1000 × г в течение 1 мин.
- Выбросьте ~80% супернатанта и переложите яйца в стерильную колбу, содержащую 20 мл S-среды. Поместите колбу в шейкер и высиживайте яйца на ночь без пищи со скоростью 120 оборотов в минуту, чтобы получить синхронизированные нематоды L1.
2. Агрегационный анализ PolyQ
- Подготовка нематод к агрегационному анализу polyQ
- Перенос 300-500 синхронизированных личинок L1 AM141 в каждую лунку 48-луночной пластины с 500 мкл S-среды, содержащей OP50 (OD570 0,7-0,8) и 5 мг/мл астрагалана, обычно по одной лунке на обработку в течение одного периода времени.
- Запечатайте пластину парапленкой и инкубируйте при 20 °C и 120 об/мин в течение 24, 48, 72 и 96 ч.
- Соберите нематод в стерильной микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл и промыть буфером M9 >3 раза центрифугированием (1000 × г в течение 1 мин) для удаления оставшегося OP50. Повторно суспендируйте нематоды AM141 в буфере M9 и держите их готовыми к получению изображения.
- Получение флуоресцентных изображений и анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные автоматически анализируются с помощью этой системы визуализации с высоким содержанием. Если автоматизированное устройство визуализации недоступно, для достижения аналогичной производительности можно использовать обычный метод подготовки агароновой прокладки для получения изображения с помощью обычного флуоресцентного микроскопа 7,15,17 (см. шаги 3.2 и 3.3).- Перенесите 10-15 нематод в каждую скважину в 384-луночной пластине (конечный объем 80 мкл на скважину). Установите 10 реплицированных лунок для каждой обработки.
- Добавьте 10 мкл 200 мМ азида натрия в каждую лунку, чтобы парализовать нематод и дать им осесть на дно (5-10 мин).
- Поместите пластину в систему визуализации с высоким содержанием для получения флуоресцентных изображений (см. Таблицу материалов для информации об устройстве и программном обеспечении).
- Откройте программное обеспечение для получения изображений и настройте следующие параметры.
- Откройте окно Настройка сбора пластин и создайте новый набор и имя эксперимента.
- Выберите Увеличение как 2x, Камера биннинг как 1 и Тип пластины как пластина с 384 скважинами.
- Установите скважины и участки (один участок) для посещения.
- Выберите фильтр изотиоцианата флуоресцеина (FITC) и включите параметры фокусировки на основе изображения.
- Установите значение экспозиции 300 мс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные настройки могут быть протестированы и скорректированы для оптимизации параметров изображения. - Сохраните настройки получения изображений и нажмите кнопку «Получить пластину» для запуска.
- Анализируйте данные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
- Откройте окно Данные обзорной пластины и выберите Тестовую пластину для анализа изображений.
- Дважды щелкните по пробной скважине, чтобы отобразить ее изображение.
- Выберите Count Nuclei в качестве метода анализа и нажмите кнопку Configure Settings (Настроить параметры ), чтобы открыть окно для следующих параметров.
- Определите исходное изображение из канала FITC и выберите стандартный алгоритм.
- Задайте параметры анализа изображения следующим образом: приблизительная минимальная ширина = 10 мкм (= 2 пикселя); приблизительная максимальная ширина = 50 мкм (= 12 пикселей); интенсивность выше локального фона = 1000-2000 серых уровней.
- Протестируйте текущие настройки для оптимизации метода анализа.
- Сохраните настройки и запустите анализ на всех скважинах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для завершения анализа одной плиты из 384 скважин требуется ~20 минут. - Экспортируйте общее количество ядер как общее количество агрегатов Q40::YFP в каждой скважине.
- Подсчитайте количество нематод в каждой лунке.
- Рассчитайте среднее число агрегатов Q40::YFP на нематоду в каждой группе и примените нелинейную кривую, подходящую к данным из каждой точки времени.
- Рассчитайте индекс торможения, используя eq (1) ниже:
Индекс торможения =
(1)
ГдеN контрольная и N выборка представляют собой среднее число агрегатов Q40::YFP в контрольной и лечебной группах, соответственно.
(1)3. ПолиQ-опосредованные анализы нейротоксичности
- Обработка C. elegans с помощью тестовых образцов
- Чтобы подготовить нематод к анализу нейротоксичности polyQ, перенесите 300-500 синхронизированных личинок L1 HA759 в каждую лунку 48-луночной пластины с 500 мкл среды S, содержащей OP50 (OD570 0,7-0,8) и 5 мг/мл астрагалана, обычно три реплицируемые лунки для каждого лечения.
- Запечатайте пластину парапленкой и инкубируйте при 15 °C и 120 об/мин в течение 3 дней23.
- Соберите нематод центрифугированием и промыть 3-5 раз буфером М9. Повторное суспендирование нематод в буфере M9 для использования в анализах выживания нейронов и избегания.
- Приготовление агарозной прокладки
- Добавьте 2 г агарозы в 100 мл буфера M9 (2%, мас./об.) и нагрейте раствор агарозы в микроволновой печи до почти кипячения.
- Нанесите 0,5 мл расплавленной агарозы на центр стекольного стекла толщиной 1 мм, помещенного между двумя кусками стеклянных пластин толщиной 2 мм. Накройте еще одним слайдом по вертикали. Как только агароза остынет и затвердеет, аккуратно удалите верхний слайд.
- Анализ выживания нейронов ASH
- Добавьте каплю 20 мМ азида натрия на агарозную прокладку. Переведите 15-20 нематод HA759 в каплю, чтобы обездвижить их.
- Аккуратно положите крышку поверх нематод. Держите затвор под флуоресцентным микроскопом, оснащенным цифровой камерой. Выберите объектив 40x и фильтр FITC для обнаружения GFP-положительных нейронов ASH в области головы нематод.
- Выберите более 50 нематод в каждой группе случайным образом, чтобы подсчитать количество нематод с GFP-мечеными двусторонними нейронами ASH в области головы7. Рассчитайте выживаемость нейронов ASH, используя eq (2) ниже.
Выживание нейронов (%) =
(2)
ГдеN выживаемость и Nобщее количество нематод с GFP-положительными нейронами ASH и общее количество протестированных нематод в каждой группе соответственно.
- Осмотический анализ избегания
- Разделите пластину NGM без пищи (9 см) на нормальную (N) и ловушку (T) зоны с помощью линии 8 М глицерина (~ 30 мкл) посередине. Распределите линию азида натрия 200 мМ (~ 20 мкл) на расстоянии ~ 1 см от линии глицерина, чтобы парализовать нематод, пересекающих глицериновый барьер, в зону T.
- Перенесите ~ 200 нематод каждая в зону N из трех реплицированных пластин для каждой группы. Добавьте каплю 1% бутандиона (~ 2 мкл) в зону T (1 см от края пластины), чтобы привлечь нематод. Немедленно накройте крышку чашки Петри и высиживайте при 23 °C в течение 90 мин.
- Оцените количество нематод в N и T зонах под микроскопом. Рассчитайте индекс избегания, используя eq (3)20.
Индекс избегания =
(3)
Где N и T — число нематод в N и T зонах соответственно. Данные представлены в виде средств ± стандартного отклонения (SD) трех реплик, представляющих независимые эксперименты >3. - Выполните непарный, двуххвостый т-тест для сравнения данных из астрагаланской и контрольной групп.
(2)
(3)4. Создание радиолокационной карты
- Откройте графическое программное обеспечение и импортируйте данные из разных анализов на новый лист. Введите столбец A(X) в качестве заголовков радиальных осей, столбец A(Y) в качестве данных из контрольной группы и столбец B(Y) в качестве данных из группы обработки.
- Выберите необходимые данные и нажмите на Plot | Специализированный: кнопка Radar в меню панели инструментов для создания радарной диаграммы.
- Дважды щелкните радиальную ось и при необходимости отрегулируйте метки Масштаб, Тик и Тик каждой оси.
- Нажмите «Файл» в меню и выберите «Экспорт графиков», чтобы сохранить изображение как *.tiff.
ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-сайты программного обеспечения в Таблице материалов содержат подробные справочные документы и видеоуроки по созданию радиолокационных карт.
Representative Results
Трансгенный штамм polyQ AM141 сильно экспрессирует белки слияния Q40::YFP в мышечных клетках стенки тела 7,21. Как показано на рисунке 1A, дискретный совокупный фенотип этого штамма может быть идентифицирован с помощью автоматизированного протокола визуализации и анализа, описанного в этой статье. Количество агрегатов Q40::YFP в нематодах AM141 значительно увеличилось через 48 ч от стадии L1. Однако эта тенденция к увеличению была ингибирована лечением астрагаланом (рисунок 1B), демонстрируя защитный потенциал астрагалана против агрегации polyQ. Обычно 72 ч или 96 ч можно удобно использовать в качестве временных точек для подсчета агрегатов Q40::YFP для оценки антиагрегационного эффекта тестовых образцов. В этом протоколе флуоресцентные агрегаты нематоды AM141 были захвачены автоматизированной системой визуализации, хотя флуоресцентные микроскопы также могут быть использованы для этой цели7.
Штамм C. elegans HA759 экспрессирует как маркер GFP, так и Htn-Q150 в своих сенсорных нейронах ASH, что приводит к прогрессирующей потере и дисфункции этих нейронов11,13. Нематоды были установлены на 2% агарозных прокладках для определения жизнеспособности нейронов ASH (рисунок 2A) и визуализированы микроскопически для обнаружения нейронов ASH. Потеря флуоресценции GFP в двусторонних нейронах ASH в областях головы нематод указывает на гибель нейронов ASH (рисунок 2B). Выживаемость нейронов ASH у нематод HA759 составляет <40% в контрольной группе после инкубации при 15 °C в течение 3 дней 7,20, что указывает на полиQ-опосредованную нейротоксичность. Следовательно, этот анализ выживания нейронов ASH может быть использован для визуальной оценки воздействия тестовых соединений на нейроны C. elegans, например, нейропротекторного эффекта астрагалана, но не гликана Poria (рисунок 2C).
Поскольку поведенческая дисфункция является основным клиническим симптомом при заболеваниях polyQ, хемосенсорный анализ избегания (рисунок 3A) с использованием большого количества нематод HA759 разработан как упрощенный тест для изучения влияния тестовых образцов на функциональную потерю нейронов ASH, опосредованную агрегацией polyQ. Как показано на рисунке 3B, индекс избегания нематод HA759 в необработанной контрольной группе составил ~ 0,5, аналогично тому, что сообщалось ранее14. Интересно, что индекс избегания увеличился до >0,6 у нематод, получавших астрагалан при 15 °C в течение 3 дней (рисунок 3B), демонстрируя нейропротекторный эффект полисахарида против поведенческих нарушений.
Для оценки общей нейропротекторной способности тестовых соединений данные вышеуказанных отдельных анализов могут быть интегрированы и представлены в виде радиолокационной диаграммы для нескольких фенотипов, что делает ее объединяющей особенностью фенотипов polyQ, подходящей для прямого сравнения и прямого просмотра. Как показано на фиг.4, площадь треугольника в группе лечения астрагалана больше, чем у контрольной группы, что указывает на антиполиКВ эффекты полисахарида.
Рисунок 1: Влияние астрагалана на агрегацию polyQ40. (A) Репрезентативные изображения нематод AM141 после обработки астрагаланом или без него в течение 96 ч при 20 °C. Флуоресцентные изображения (левые панели) были получены с пластин 384 скважин с использованием системы визуализации и анализа высокого содержания, а агрегаты Q40::YFP (правые панели) были автоматически идентифицированы системой. Вставки представляют собой увеличенные изображения нематод, показывающие агрегаты polyQ. Шкала баров = 500 мкм. (B) Количественная оценка агрегатов Q40::YFP. Количество агрегатов Q40::YFP в нематодах AM141 контролировали с помощью системы визуализации с высоким содержанием каждые 24 ч в течение 4 дней после лечения астрагаланом или без него при 20 °C. Приблизительно 100-150 нематод в каждой группе были оценены по агрегатам в каждый момент времени. Результаты показаны в виде установленных кривых, основанных на среднем количестве агрегатов на нематоду. Сокращения: polyQ = полиглутамин; YFP = желтый флуоресцентный белок; FITC = изотиоцианат флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние астрагалана на Htn-Q150-опосредованную гибель нейронов ASH. (A) Принципиальная схема подготовки агарозного слайда. (B) Репрезентативные микроснимки нематод HA759 с выживанием и гибелью нейронов ASH с использованием 400-кратного увеличения. Шкала стержней = 20 мкм. Нематоды HA759 фотографировались с помощью флуоресцентного микроскопа после лечения астрагаланом или без него при 15 °C в течение 3 дней от L1. (C) Защитное действие астрагалана против полиQ-опосредованной гибели нейронов ASH. В качестве контроля использовался гликан Poria, полисахарид из кокосового ореха Poria. Данные представлены в виде средств ± SD трех реплик, представляющих более трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием непарного двуххвостого т-теста для сравнения данных контрольной группы с данными групп астрагалана и гликана Пория . *p < 0,05; ns = не значимый. Аббревиатура: GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние астрагалана на поведенческую дисфункцию, опосредованную Htn-Q150. (A) Принципиальная схема пластины анализа избегания. (B) Репрезентативные результаты анализа избегания. Индекс избегания определялся как отношение нематод в N зоне к общему числу нематод на пластине. Результаты представлены в виде средств ± SD трех реплик, представляющих три независимых эксперимента. Статистический анализ индекса избегания проводили с использованием непарного, двуххвостого т-теста. **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Общая нейропротекторная способность астрагалана. Данные из трех различных анализов импортируются в программное обеспечение OriginPro для создания радиолокационной диаграммы, которая представлена для профилирования общего влияния астрагалана на несколько фенотипов, опосредованных polyQ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Discussion
Поскольку агрегация polyQ и протеотоксичность являются важными особенностями расстройств polyQ, таких как болезнь Гентингтона13, мы рекомендуем использовать несколько моделей и методов для всесторонней оценки нейропротекторной способности тестовых соединений, включая анализ агрегации polyQ в штамме AM141, анализ выживания нейронов ASH в штамме HA759 и анализ хемосенсорного избегания в штамме HA759. Представленные здесь протоколы были использованы для оценки нейропротекторной способности тестовых образцов против токсичности polyQ, включая ингибирующее воздействие как на агрегацию polyQ, так и на связанную нейротоксичность 7,14,15,16,17,19,20, демонстрируя их потенциал в открытии лекарств для БГ и других заболеваний polyQ.
Внедрена автоматизированная система визуализации и анализа для обнаружения и подсчета агрегатов polyQ в агрегационном анализе polyQ. Этот метод имеет преимущества в том, что он является высокопроизводительным и эффективным по времени и приводит к значительному снижению субъективных ошибок в трудоемком процессе подсчета. Для всей пластины из 384 скважин требуется всего <1 ч, чтобы завершить получение и анализ изображения. Однако обычный метод микроскопической визуализации также показал аналогичную производительность в этой лаборатории без использования автоматизированного устройства визуализации7.
В общей сложности 100-150 нематод за обработку рекомендуются в типичном анализе агрегации Q40: YFP для каждой точки времени, который может быть выполнен в реплицированных лунках, содержащих 10-15 нематод каждая. Однако следует отметить, что личинки L1 могут быть более чувствительными к некоторым обработкам или более высоким концентрациям. Поэтому более высокие дозы тестовых соединений могут ингибировать их рост, что приводит к ложноположительным результатам из-за медленного роста и, таким образом, задержки агрегации polyQ. Обычно для решения этой проблемы и обеспечения соответствующего диапазона концентраций исследуемых соединений23 может быть выполнен анализ пищевого клиренса.
Трансгенные нематоды HA759, используемые в анализах нейротоксичности polyQ, совместно экспрессируют OSM-10::GFP и Htn-Q150, что позволяет однозначно идентифицировать двусторонние сенсорные нейроны ASH. Следовательно, выживаемость нейронов ASH оценивается по наличию или отсутствию экспрессии GFP; Обычно ~ 40-75% нейронов ASH в контрольных нематодах мертвы23,24. Интересно, что генетический мутантный фон pqe-1 (усилитель полиглутамина-1) в штамме HA759 (pqe-1; Htn-Q150) ускоряет полиQ-опосредованную токсичность, приводя к гибели большинства нейронов ASH в течение трех дней, даже при 15 °C, и поэтому этот штамм выращивается при 15 °C для анализа выживания нейронов, как сообщалось ранее23,24.
Функциональная потеря нейронов ASH у нематод HA759 может произойти до обнаружения гибели клеток и белковых агрегатов13; поэтому осмотический анализ поведения избегания имеет важное значение для оценки токсичности, опосредованной полиQ. Чтобы свести к минимуму потенциальное влияние менее активных нематод HA759 при низкой температуре на поведенческие эксперименты, пластины для анализа избегания инкубируют в увлажненном инкубаторе с температурой 23 ° C, а не при 15 ° C, как в анализе выживания нейронов с использованием этого штамма. Кроме того, сообщалось, что трансгенные нематоды Htn-Q150/OSM-10::GFP очень чувствительны к прикосновению носа; следовательно, альтернативным обнаружением функции нейрона ASH является анализ прикосновения кносу 13.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим бывших членов Лаборатории Хуан, которые помогли разработать и улучшить протоколы, используемые в этой статье, в частности, Ханруй Чжан, Линъюнь Сяо и Янься Сян. Эта работа была поддержана проектом 111 (номер гранта B17018) и Фондом естественных наук провинции Хэбэй (номер гранта H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
- Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L.
- Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
- Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
- Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
- Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
- Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
- Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
- Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
- Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
- Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
- Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
- Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
- Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
- Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
- Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
- Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
- Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
- Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).
