Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Abstract

Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie- als beeldverwerkingssoftware hebben cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) tot de voorkeursmethode gemaakt voor structuurbiologen om structuren met hoge resolutie van een breed scala aan macromoleculen te bepalen. Meerdere softwaresuites zijn beschikbaar voor nieuwe en deskundige gebruikers voor beeldverwerking en structuurberekening, die dezelfde basisworkflow stroomlijnen: films die door de microscoopdetectoren zijn verkregen, ondergaan correctie voor beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) schatting. Vervolgens worden deeltjesafbeeldingen geselecteerd en geëxtraheerd uit gemiddelde filmframes voor iteratieve 2D- en 3D-classificatie, gevolgd door 3D-reconstructie, verfijning en validatie. Omdat verschillende softwarepakketten verschillende algoritmen gebruiken en verschillende niveaus van expertise vereisen om te werken, verschillen de 3D-kaarten die ze genereren vaak in kwaliteit en resolutie. Gebruikers dragen dus regelmatig gegevens over tussen verschillende programma's voor optimale resultaten. Dit artikel biedt een handleiding voor gebruikers om door een workflow te navigeren in de populaire softwarepakketten: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een bijna atomaire resolutiestructuur van het adeno-geassocieerde virus (AAV) te verkrijgen. We beschrijven eerst een beeldverwerkingspijplijn met cryoSPARC v3, omdat de efficiënte algoritmen en gebruiksvriendelijke GUI gebruikers in staat stellen om snel tot een 3D-kaart te komen. In de volgende stap gebruiken we PyEM en interne scripts om deeltjescoördinaten van de beste kwaliteit 3D-reconstructie verkregen in cryoSPARC v3 naar RELION-3 en Scipion 3 te converteren en over te dragen en 3D-kaarten opnieuw te berekenen. Ten slotte schetsen we stappen voor verdere verfijning en validatie van de resulterende structuren door algoritmen van RELION-3 en Scipion 3 te integreren. In dit artikel beschrijven we hoe u drie verwerkingsplatforms effectief kunt gebruiken om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets voor het bepalen van de structuur met hoge resolutie.

Introduction

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) en single-particle analysis (SPA) maken structuurbepaling mogelijk van een breed scala aan biomoleculaire assemblages in hun gehydrateerde toestand, waardoor de rollen van deze macromoleculen in atomair detail worden verlicht. Verbeteringen in microscoopoptiek, computerhardware en beeldverwerkingssoftware hebben het mogelijk gemaakt om structuren van biomoleculen te bepalen met een resolutie die verder reikt dan 2 Å1,2,3. Meer dan 2.300 cryo-EM-structuren werden in 2020 in de Protein Data Bank (PDB) gedeponeerd, vergeleken met 192 structuren in 20144, wat aangeeft dat cryo-EM de voorkeursmethode is geworden voor veel structuurbiologen. Hier beschrijven we een workflow die drie verschillende SPA-programma's combineert voor structuurbepaling met hoge resolutie (figuur 1).

Het doel van SPA is om 3D-volumes van een doelmonster te reconstrueren uit luidruchtige 2D-beelden die zijn vastgelegd door een microscoopdetector. Detectoren verzamelen beelden als films met individuele frames van hetzelfde gezichtsveld. Om het monster te behouden, worden frames verzameld met een lage elektronendosis en hebben ze dus een slechte signaal-ruisverhouding (SNR). Bovendien kan blootstelling aan elektronen beweging induceren binnen de verglaasde cryo-EM-rasters, wat resulteert in beeldvervaging. Om deze problemen op te lossen, worden frames uitgelijnd om te corrigeren voor door stralen geïnduceerde beweging en gemiddeld om een micrograaf met een verhoogde SNR op te leveren. Deze micrografieën ondergaan vervolgens een CTF-schatting (Contrast Transfer Function) om rekening te houden met de effecten van onscherpte en aberraties die door de microscoop worden opgelegd. Uit de CTF-gecorrigeerde micrografieën worden individuele deeltjes geselecteerd, geëxtraheerd en gesorteerd in 2D-klassegemiddelden die verschillende oriëntaties vertegenwoordigen die door het monster in glasachtig ijs worden aangenomen. De resulterende homogene verzameling deeltjes wordt gebruikt als input voor ab initio 3D-reconstructie om een grof model of modellen te genereren, die vervolgens iteratief worden verfijnd om een of meer structuren met hoge resolutie te produceren. Na de reconstructie worden structurele verfijningen uitgevoerd om de kwaliteit en resolutie van de cryo-EM-kaart verder te verbeteren. Ten slotte wordt ofwel een atoommodel rechtstreeks afgeleid van de kaart, ofwel is de kaart uitgerust met atoomcoördinaten die elders zijn verkregen.

Er zijn verschillende softwarepakketten beschikbaar om de hierboven beschreven taken uit te voeren, waaronder Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 en andere. Hoewel deze programma's vergelijkbare verwerkingsstappen volgen, gebruiken ze verschillende algoritmen, bijvoorbeeld om deeltjes te selecteren, initiële modellen te genereren en reconstructies te verfijnen. Bovendien vereisen deze programma's een variërend niveau van gebruikerskennis en interventie om te werken, omdat sommige afhankelijk zijn van de fijnafstelling van parameters die als een hindernis voor nieuwe gebruikers kunnen fungeren. Deze discrepanties resulteren vaak in kaarten met inconsistente kwaliteit en resolutie op verschillende platforms14, waardoor veel onderzoekers ertoe worden aangezet meerdere softwarepakketten te gebruiken om resultaten te verfijnen en te valideren. In dit artikel belichten we het gebruik van cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een hoge resolutie 3D-reconstructie te verkrijgen van AAV, een veelgebruikte vector voor gentherapie15. De bovengenoemde softwarepakketten zijn gratis voor academische gebruikers; cryoSPARC v3 en Scipion 3 vereisen licenties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Een nieuw cryoSPARC v3-project maken en gegevens importeren

OPMERKING: Gegevens werden verkregen aan de Oregon Health and Science University (OHSU) in Portland met behulp van een 300 kV Titan Krios elektronenmicroscoop uitgerust met een Falcon 3 directe elektronendetector. Beelden werden verzameld in een telmodus met een totale dosis van 28,38 e−/Å2 gefractioneerd over 129 frames en een onscherptebereik van -0,5 μm tot -2,5 μm, bij een pixelgrootte van 1,045 Å met behulp van EPU. De sample van AAV-DJ werd verzorgd door het personeel van OHSU.

  1. Open cryoSPARC v3 in een webbrowser en klik op de kop Projecten . Selecteer + Toevoegen om een nieuw project te maken. Geef het project dienovereenkomstig een titel en geef een pad naar een bestaande map waar taken en gegevens worden opgeslagen.
  2. Maak een werkruimte voor het project door het project te openen, op + Toevoegen te klikken en Nieuwe werkruimte te selecteren. Geef de werkruimte een titel en klik op Maken.
  3. Navigeer naar de nieuwe werkruimte en open de Taakbouwer in het rechterdeelvenster. Op dit tabblad worden alle functies weergegeven die beschikbaar zijn in cryoSPARC v3. Klik op Films importeren en geef het filmpad op, het referentiebestandspad op en stel acquisitieparameters als volgt in: Raw Pixel Size 1.045 Å, Accelerating Voltage 300 kV, Spherical Aberration 2.7 mm, Total Exposure Dose 28.38 e-/Å^2.
  4. Klik op Wachtrij, selecteer een rijstrook om de taak en een werkruimte uit te voeren en klik op Maken.
    OPMERKING: De acquisitieparameters zijn afhankelijk van monster en microscoop.

2. CryoSPARC v3 - filmuitlijning en CTF-schatting

  1. Open Patch Motion Correction (Multi). Voor deze taak zijn de films die in stap 1.3 zijn geïmporteerd als invoer vereist. Open de taakkaart films importeren in de werkruimte en sleep de Imported_movies uitvoer naar de tijdelijke aanduiding voor films voor de nieuwe taak. Zet de taak in de wachtrij.
    OPMERKING: Zie de cryoSPARC-zelfstudie16 voor meer informatie over de cryoSPARC-methoden die in dit artikel worden beschreven.
  2. Om CTF-schatting uit te voeren, opent u Patch CTF Estimation (Multi). Voer de micrografieën in die in stap 2.1 zijn gegenereerd en zet de taak in de wachtrij.
  3. Om de gemiddelde en CTF-gecorrigeerde micrografieën te inspecteren en een subset te selecteren voor verdere verwerking, opent u Curate Exposures en voert u de blootstellingen in die zijn verkregen in stap 2.2. Zet de taak in de wachtrij.
  4. Nadat de taak in de wachtmodus is gegaan, klikt u op het tabblad Interactie op de taakkaart, past u parameterdrempels aan en accepteert of weigert u individuele micrografieën voor verdere verwerking. Accepteer microfoto's met goed op elkaar afgestemde geschatte en experimentele CTF's (figuur 2) en gooi die met hoog astigmatisme, slechte CTF-pasvorm en dik ijs weg.
  5. Stel tijdens het verwerken van de huidige gegevens de bovengrens van astigmatisme in op 400 Å, CTF-pasvormresolutie op 5 Å en relatieve ijsdikte op 2. Klik op Gereed om de micrografieën voor downstream-verwerking te selecteren.

3. CryoSPARC v3 - handmatige en sjabloongebaseerde deeltjesverzameling

  1. Open Handmatige kiezer, voer de geaccepteerde belichtingen uit de stappen 2.4-2.5 in en plaats de taak in de wachtrij . Klik op het tabblad Interactief , stel de doosgrootte (px) in op 300 en klik op een paar honderd deeltjes over meerdere micrografieën en vermijd het selecteren van overlappende deeltjes. Hier werden 340 deeltjes over 29 microfoto's geselecteerd. Als u klaar bent, klikt u op Klaar met plukken! Extract deeltjes.
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van handmatige deeltjesverzameling om sjablonen voor automatische selectie te genereren. Er zijn echter ook andere methoden beschikbaar17.
  2. Om sjablonen voor geautomatiseerde deeltjesverzameling te genereren, klikt u op 2D-classificatie en voert u de deeltjesprikkers in die in stap 3.1 zijn gegenereerd. Wijzig het aantal 2D-klassen in 10 en zet de taak in de wachtrij .
  3. Open 2D-klassen selecteren. Voer de deeltjes en klassegemiddelden in die zijn verkregen in stap 3.2 en klik op het tabblad Interactief . Selecteer representatieve 2D-klassen met goede SNR en klik op Gereed.
    OPMERKING: De klasgemiddelden weerspiegelen verschillende deeltjesweergaven. Selecteer klassegemiddelden die elke weergave weergeven. Het doel is om goed gedefinieerde sjablonen te produceren die verschillende weergaven van het monster vertegenwoordigen voor geautomatiseerde picking.
  4. Open Sjabloonkiezer en voer de 2D-klassen in die zijn geselecteerd in stap 3.3 en micrografieën uit stap 2.4-2.5. Stel de deeltjesdiameter (Å) in op 220 Å en zet de taak in de wachtrij .
  5. Als u de geautomatiseerde picks wilt inspecteren, opent u Select Particle Picks, voert u de deeltjes en micrografieën in die in stap 3.4 zijn gegenereerd en plaatst u de taak in de wachtrij.
  6. Klik op de taakkaart Particle Picks selecteren op het tabblad Interactief en stel de boxgrootte (px) in op 300. Klik op een individuele micrograaf, pas het laagdoorlaatfilter aan totdat deeltjes duidelijk zichtbaar zijn en stel de NCC-drempel (Normalized Cross Correlation) in op 0,41 en de vermogensdrempel tussen 54000 en 227300 .
  7. Inspecteer verschillende microfoto's en pas, indien nodig, de drempelwaarden zo aan dat de meeste deeltjes worden geselecteerd zonder vals-positieven op te nemen. Als u klaar bent, klikt u op Klaar met plukken! Extract deeltjes.
    OPMERKING: Echte deeltjes hebben meestal een hoge NCC- en vermogensscore, wat aangeeft dat ze vergelijkbaar zijn met de sjabloon en respectievelijk een hoge SNR hebben.
  8. Open Extract from Micrographs en voer de micrographs en deeltjes uit stap 3.7 in. Stel de grootte van de geëxtraheerde doos (px) in op 300 en zet de taak in de wachtrij .

4. CryoSPARC v3 - 2D classificatie

  1. Klik op 2D-classificatie en voer de geëxtraheerde deeltjes uit stap 3.8 in. Stel het aantal 2D-klassen in op 50 en zet de taak in de wachtrij .
  2. Als u de beste 2D-klassen voor verdere verwerking wilt selecteren, opent u 2D-klassen selecteren. Voer de deeltjes en klassegemiddelden in die zijn verkregen in stap 4.1. Klik op het tabblad Interactief en kies 2D-klassen op basis van de resolutie en het aantal deeltjes in de klasse (figuur 3). Selecteer geen klassen die artefacten bevatten. Klik na het selecteren op Gereed.
    OPMERKING: Gewoonlijk zijn meerdere rondes van 2D-classificatie vereist om deeltjes te verwijderen die niet convergeren in verschillende, goed gedefinieerde klassen. Voer zoveel 2D-classificatierondes uit als nodig is om dergelijke deeltjes uit de dataset te verwijderen (figuur 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio reconstructie en homogene verfijning

  1. Om een initieel 3D-volume te genereren, opent u Ab-initio Reconstruction en voert u de deeltjes in die zijn verkregen in stap 4.2 of uit de uiteindelijke 2D-classificatie. Pas symmetrie aan op icosaëderaal. Zet de taak in de wachtrij.
    OPMERKING: Symmetrie is afhankelijk van het monster en moet dienovereenkomstig worden gewijzigd. Gebruik, indien onbekend, C1-symmetrie.
  2. Open homogene verfijning. Voer het volume uit stap 5.1 en deeltjes uit 4.2 of de uiteindelijke 2D-classificatie in. Wijzig de symmetrie en wachtrij de taak. Wanneer de taak is voltooid, inspecteert u de FSC-curve (Fourier Shell Correlation) en downloadt u het volume om te onderzoeken in UCSF Chimera18.

6. Deeltjescoördinaten exporteren van cryoSPARC v3 en importeren naar RELION-3 met PyEM

OPMERKING: Deeltjescoördinaten bevatten informatie over de locatie van individuele deeltjes in elke micrograaf. Overdracht van coördinaten in plaats van deeltjesstapels naar RELION-3 maakt het mogelijk om verfijningsstappen uit te voeren die anders niet beschikbaar zouden zijn. Voor het polijsten van deeltjes is bijvoorbeeld toegang tot initiële filmframes vereist. Daarom, voordat u deeltjescoördinaten van cryoSPARC v3 naar RELION-3 exporteert, importeert u films en voert u bewegingscorrectie en CTF-schatting uit in RELION-3. Zie de RELION-3 tutorial19 voor meer informatie.

  1. Navigeer naar de RELION-3 project directory en start RELION-3.
  2. Open Importeren vanuit de taaktypebrowser en geef het pad naar de films en acquisitieparameters op zoals in stap 1.3.
  3. Als u bewegingscorrectie wilt uitvoeren, gebruikt u UCSF MotionCor220 via de RELION-3 GUI, opent u Bewegingscorrectie en stelt u de standaardparameters in zoals in de UCSF MotionCor2-handleiding21. Voer het pad in naar de films die in stap 6.2 zijn geïmporteerd. Geef op het tabblad Beweging het pad op naar het uitvoerbare bestand motioncor2.
    OPMERKING: MotionCor2 kan parallel worden uitgevoerd met behulp van meerdere GPU's.
  4. Voer CTF-schattingen uit met CTFFIND-4.122 via de RELION-3 GUI. Open CTF Estimation en voer de micrographs.star in die in stap 6.3 is gegenereerd. Geef op het tabblad CTFFIND-4.1 het pad naar het uitvoerbare bestand CTFFIND-4.1 op en stel parameters in zoals in de RELION-3.1 tutorial19.
  5. Om deeltjesstapels van cryoSPARC v3 naar RELION-3 te importeren, moeten ze eerst worden geëxporteerd vanuit cryoSPARC v3. Open in cryoSPARC v3 de taakkaart van de 2D-klassetaak selecteren uit stap 4.2 of de uiteindelijke 2D-classificatie. Klik op het tabblad Details op Taak exporteren. Met de exporttaak wordt het particles_exported.cs bestand uitgevoerd.
  6. Voordat deeltjescoördinaten van cryoSPARC v3 naar RELION-3 worden geïmporteerd, moet het particles_exported.cs-bestand uit stap 6.5 worden geconverteerd naar .star-indeling. Gebruik PyEM23 om het particles_exported.cs bestand naar .star-indeling door de volgende opdracht uit te voeren: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. Klik in RELION-3 op het tabblad Handmatige picking en voer op het tabblad I/O de microfoto's van CTF-verfijning in die zijn beschreven in stap 6.4. Voer op het tabblad Display de volgende parameters in: Deeltjesdiameter (A): 220, Lowpass-filter (A): -1, Schaal voor CTF-afbeelding: 0,5. Voer de taak uit. Een map met de naam ManualPick wordt gegenereerd in de RELION-3-thuismap.
    OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om een handmatige orderverzamelmapstructuur te maken in RELION-3. Tijdens het handmatig picken wordt een enkel .star-bestand met coördinaten van geplukte deeltjes gemaakt voor elke gemiddelde micrograaf die wordt gebruikt voor het picken in de RELION-3 GUI.
  8. Navigeer naar de map met het particles_exported.star-bestand uit stap 6.6 en voer een zelfgeschreven script uit dat een enkel manualpick.star-bestand produceert voor elke gemiddelde micrograaf die wordt gebruikt voor het kiezen van cryo-SPARC v3-deeltjes, die hebben bijgedragen aan de uiteindelijke 2D-classificatie die in stap 6.5 is geëxporteerd. De resulterende coördinatenbestanden worden opgeslagen in de map ManualPick/Movies.
  9. Ga terug naar RELION-3 en open de handmatige picktaak opnieuw. Klik op Doorgaan. Dit geeft deeltjes weer die eerder zijn geplukt in cryoSPARC v3 in de RELION-3 GUI. Inspecteer een paar microfoto's om te controleren of de overdracht van deeltjescoördinaten is bereikt en of deeltjes correct zijn geselecteerd.

7. RELION-3 - Deeltjesextractie en 2D-classificatie

  1. Klik op Deeltjesextractie. Voer op het tabblad I/O de CTF-gecorrigeerde microfoto's uit stap 6.4 en coördinaten uit stap 6.9 in. Klik op het tabblad Extract en wijzig de deeltjesdoosgrootte (pix) in 300. Voer de taak uit.
  2. Voer 2D-classificatie uit om de deeltjesset die in cryoSPARC v3 wordt gegenereerd verder te reinigen om een reconstructie met een hogere resolutie te bereiken. Klik op 2D-classificatie en voer op het tabblad I/O het particles.star-bestand in dat in stap 7.1 is gegenereerd. Stel op het tabblad Optimalisatie het aantal klassen in op 50 en de maskerdiameter (A) op 280. Voer de taak uit.
    OPMERKING: Het masker moet het hele deeltje omvatten.
  3. Als u de beste 2D-klassen wilt kiezen, klikt u op de methode Subsetselectie , voert u het bestand _model.star uit stap 7.2 in en voert u de taak uit. Selecteer klassen zoals beschreven in stap 4.2.
  4. Herhaal stap 7.2 en 7.3 om niet-convergerende deeltjes te verwijderen.

8. RELION-3 - 3D-verfijning, maskercreatie en nabewerking

  1. Gebruik de kaart die is gegenereerd in cryoSPARC v3 (stap 5.2) als een eerste model voor 3D-verfijning in RELION-3. Selecteer de importmethode en stel de volgende parameters in op het tabblad I/O : Raw-films/micrografieën importeren: Nee, Onbewerkte invoerbestanden: Films/*.mrc.
  2. Geef het MTF-bestand op en voer de filmacquisitieparameters in zoals beschreven in stap 1.3. Selecteer op het tabblad Overige de cryoSPARC v3-kaart als invoerbestand, wijzig Node Type in 3D-referentie (.mrc) en Voer de taak uit.
  3. Selecteer Automatisch 3D-verfijnen en stel op het tabblad I/O Invoerafbeeldingen in als het bestand particles.star uit stap 7.3 of de laatste selectietaak. Geef de cryoSPARC v3 reconstructie als referentiekaart. Klik op het tabblad Referentie en wijzig initial low-pass filter (Å) in 50 en symmetrie in icosaëderaal. Wijzig op het tabblad Optimalisatie de maskerdiameter (Å) in 280 en voer de taak uit.
  4. Nadat de run is voltooid, opent u run_class001.mrc in UCSF Chimera.
  5. Klik in UCSF Chimera op Extra en selecteer onder Volumegegevens de optie VolumeViewer. Dit opent een nieuw venster om de volume-instellingen aan te passen. Wijzig stap 1 en pas de schuifregelaar aan totdat u de niveauwaarde bereikt waarop de kaart geen ruis bevat. Noteer deze waarde, omdat deze in de volgende stap wordt gebruikt voor het maken van maskers.
  6. De kaart die wordt geproduceerd door automatische verfijning weerspiegelt niet de echte FSC, omdat ruis van het omringende oplosmiddel de resolutie verlaagt. Maak voor de nabewerking een masker om het monster te onderscheiden van het oplosmiddelgebied.
    1. Klik op Masker maken en voer run_class001.mrc in stap 8.3.
    2. Klik op het tabblad Masker en pas de parameters als volgt aan: Lowpass Filter Map (Å): 10, Pixelgrootte (Å): 1.045, Initial Binarization Threshold: de niveauwaarde verkregen in stap 8.5, Breid binaire kaart zoveel pixels uit: 3 en voeg een soft-edge toe van zoveel pixels: 3. Voer de taak uit .
  7. Onderzoek het masker in UCSF Chimera. Als het masker te strak is, vergroot u Het uitbreiden van binaire kaart zoveel pixels en/of voeg een zachte rand van zoveel pixels toe. Het is belangrijk om een masker met zachte randen te maken, omdat een scherp masker kan leiden tot overfitting.
  8. Klik op Nabewerking en op het tabblad I/O, voer de halve kaarten in die in stap 8.3 zijn gemaakt en maskeer vanaf 8.6. Stel de gekalibreerde pixelgrootte in op 1,045 Å. Voer op het tabblad Verscherpen het volgende in: Schatting B-Factor Automatisch?: Ja, Laagste resolutie voor Auto-B Fit (A): 10, Gebruik uw eigen B-Factor?: Nee. Stel op het tabblad Filter Fsc-weging overslaan? in op Nee. Voer de taak uit.

9. RELION-3 - Polijsttraining en deeltjespolijsten

  1. Voordat u corrigeert voor door de deeltjesbundel geïnduceerde beweging, gebruikt u eerst de trainingsmodus om optimale bewegingssporen voor de dataset te identificeren. Open Bayesian Polishing en voer op het tabblad I/O de bewegingsgecorrigeerde micrografieën uit stap 6.3, deeltjes uit stap 8.3 en postprocess .star-bestand uit stap 8.8 in. Klik op het tabblad Training en stel de volgende parameters in: Optimale parameters trainen: Ja, Fractie van fourierpixels voor testen: 0,5, Gebruik zoveel deeltjes: 5000. Voer de taak uit.
    OPMERKING: Dit script produceert opt_params_all_groups.txt bestand in de Map RELION-3 Pools met geoptimaliseerde polijstparameters die nodig zijn voor het uitvoeren van de volgende stap.
  2. Zodra de trainingstaak is voltooid, klikt u op Bayesian Polishing. Klik op het tabblad Training en stel Optimale parameters trainen in op Nee. Selecteer het tabblad Pools en geef in Geoptimaliseerd parameterbestand het pad op naar het opt_params_all_groups.txt bestand uit stap 9.1. Klik op Uitvoeren.
  3. Herhaal 3D-verfijning (stap 8.3) en nabewerking (stap 8.8) met een set gepolijste deeltjes.

10. RELION-3 - CTF en verfijningen per deeltje

  1. Als u aberraties van hogere orde wilt schatten, opent u CTF Refinement en selecteert u op het tabblad I/O onder Particles het pad naar het STAR-bestand met gepolijste deeltjes uit de recente Refine 3D-taak (run_data.star).
    1. Stel onder Postprocess Star File het pad in naar de uitvoer van de laatste nabewerkingstaak (stap 9.3).
    2. Selecteer het tabblad Aanpassen en stel de volgende parameters in: Schatting (anisotrope vergroting): Nee, CTF-parameteraanpassing uitvoeren? Nee, Schatting Beamtilt: Ja, Ook Trefoil schatten? Ja, schatting 4e orde abberations? Ja. Voer de taak uit.
  2. Herhaal stap 10.1 met behulp van deeltjes (van Refine3D) die zijn gegenereerd in de vorige taak (particles_ctf_refine.star). Wijzig op het tabblad Aanpassen de schatting (anisotrope vergroting) in Ja en Voer de taak uit.
  3. Herhaal stap 10.2 met als invoer deeltjes (van Refine3D) die in de vorige taak zijn geproduceerd (particles_ctf_refine.star). Stel op het tabblad Fit de volgende parameters in: Schatting (anisotrope vergroting): Nee, CTF Parameter Fitting uitvoeren?: Ja, Fit Defocus?: Per-deeltje, Fit Astigmatisme? Per-micrograaf, Fit B-factor?: Nee, Fit Phase-Shift: Nee, Estimate Beamtilt?: Nee, Schatting 4e Orde Aberraties?: Nee. Voer het uit .
    OPMERKING: Aangezien het deeltje voldoende contrast heeft, kan het tabblad Fit Astigmatism? worden ingesteld op Per-deeltje. Voor deze dataset verbeterde per-deeltjes astigmatisme de kwaliteit en resolutie van de kaart niet.
  4. Herhaal 3D-verfijning met de deeltjes uit stap 10.3 en stel op het tabblad I/O de optie Solvent-Flattened FSC's gebruiken in op ja. Wanneer u klaar bent met uitvoeren, voert u een nabewerkingstaak uit (stap 8.8) en onderzoekt u de kaart in UCSF Chimera (stap 5.2).

11. Relion-3 deeltjescoördinaten en 3D-kaart overbrengen naar Scipion 3

  1. Om de RELION-3-kaart verder te verfijnen en te valideren, importeert u eerst het volume en de deeltjes van de laatste nabewerkingstaak (stap 10.4) naar Scipion 3. Start Scipion 3 en maak een nieuw project.
  2. Selecteer in het linkerdeelvenster Protocollen de vervolgkeuzelijst Importeren en klik op Deeltjes importeren. Wijzig de volgende parameters: Importeren uit: RELION-3, Star File: postprocess.star en geef acquisitieparameters op zoals in stap 1.3. Klik op Uitvoeren.
  3. Klik op de vervolgkeuzelijst Importeren en selecteer Volumes importeren. Geef onder Importeren van het pad naar de RELION-3 kaart. Wijzig pixelgrootte (bemonsteringsfrequentie) Å/px in 1,045 en voer uit.

12. Scipion 3 - Hoge - resolutie verfijning

  1. Voer eerst een globale uitlijning uit. Selecteer de vervolgkeuzelijst Verfijnen in het deelvenster Protocollen en klik op Xmipp3 - highres24. Voer de geïmporteerde deeltjes en volumes uit stap 11.2 en 11.3 in als respectievelijk Afbeeldingen op ware grootte en Initiële volumes en stel de symmetriegroep in op icosaëderaal. Kies op het tabblad Afbeeldingsuitlijning onder Hoektoewijzing de optie Globaal en stel de maximale doelresolutie in op 3 Å en Voer de taak uit.
  2. Wanneer de taak is voltooid, klikt u op Resultaten analyseren. Klik in het nieuwe venster op het UCSF Chimera-pictogram om het verfijnde volume te bekijken. Klik bovendien op Display Resolution Plots (FSC) om te zien hoe de FSC is veranderd na de verfijning, evenals Plot Histogram met hoekige wijzigingen om te zien of de Euler-hoektoewijzingen zijn gewijzigd.
    OPMERKING: Afhankelijk van de resolutie van de RELION-3-invoerstructuur kan deze stap meerdere keren worden herhaald met verschillende waarden die zijn ingesteld voor de maximale doelresolutie op het tabblad Hoektoewijzing . Zie voor meer informatie de Scipion tutorial25.
  3. Herhaal stap 12.1 met een lokale uitlijning. Kopieer de vorige taak en wijzig Select Previous Run naar Xmipp3 - highres Global. Wijzig op het tabblad Hoektoewijzing de afbeeldingsuitlijning in Lokaal. Stel de maximale doelresolutie in op 2,1 Å.
  4. Onderzoek de verfijnde kaart in UCSF Chimera en analyseer de verandering in FSC- en hoektoewijzingen (stap 12.2). Herhaal lokale verfijning totdat de resolutie niet verbetert en de hoektoewijzingen zijn geconvergeerd, waarbij de maximale doelresolutie indien nodig wordt aangepast.
  5. De uitvoerkaart van Scipion 3 kan extra worden aangepast en geslepen in Phenix26.

13. Scipion 3 - Kaartvalidatie

  1. Onderzoek de lokale resolutie van de uiteindelijke kaart gegenereerd in Xmipp3 - highres. Open Xmipp - local MonoRes27 en voer het uiteindelijke volume van de vorige taak en het masker in dat in stap 8.6 is gegenereerd. Stel het resolutiebereik in van 1 tot 6 Å met een interval van 0,1 Å en voer de taak uit.
  2. Wanneer u klaar bent met uitvoeren, klikt u op Resultaten analyseren en bekijkt u het resolutiehistogram en volumesegmenten gekleurd door resolutie.
  3. Om te zien of deeltjes goed zijn uitgelijnd, opent u Multireference Alignability28 en voert u de deeltjes en het volume uit stap 12.3 in. Klik op Resultaten analyseren om de validatieplot weer te geven. Idealiter moeten alle punten rond (1.0,1.0) worden geclusterd.
  4. Open Xmipp3 - Valideer overfitting. Voer de deeltjes en volumes uit stap 12.3 in. Wanneer u klaar bent met hardlopen, analyseert u de resultaten en inspecteert u het overfittingsperceel. Kruising van de uitgelijnde Gaussiaanse ruis en uitgelijnde deeltjescurven duidt op overfitting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben een uitgebreide SPA-pijplijn gepresenteerd om een structuur met hoge resolutie te verkrijgen met behulp van drie verschillende verwerkingsplatforms: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3. Figuur 1 en figuur 4 geven een overzicht van de algemene verwerkingsworkflow en tabel 1 geeft details over verfijningsprotocollen. Deze protocollen werden gebruikt tijdens verfijningen van een 2,3 Å-structuur van AAV, waardoor een resolutie in de buurt van Nyquist werd bereikt.

Films werden eerst geïmporteerd naar cryoSPARC v3 en vervolgens motion- en CTF-gecorrigeerd om gemiddelde micrografieën te genereren. Bij het selecteren van micrografieën voor verdere verwerking is het belangrijk om die te kiezen met een goede CTF-fit en een laag astigmatisme (figuur 2), omdat het opnemen van micrografen van slechte kwaliteit latere verwerkingsstadia kan belemmeren, wat resulteert in een reconstructie met een lagere resolutie. 27.364 deeltjes werden vervolgens geplukt en geëxtraheerd uit de geselecteerde micrografieën. Omdat de diameter van de AAV ongeveer 220 Å is en de pixelgrootte 1,045 Å, is een doosgrootte van 300 px gebruikt. Vervolgens werd iteratieve 2D-classificatie gebruikt om artefacten en deeltjes te verwijderen die niet convergeren naar stabiele klassen. Voorbeelden van geselecteerde en uitgesloten 2D-klassegemiddelden zijn weergegeven in figuur 3. Het is ook belangrijk op te merken dat klassegemiddelden die verschillende conformaties van het specimen weerspiegelen, afzonderlijk moeten worden verfijnd om meerdere 3D-reconstructies te produceren. In een dergelijk geval moeten meerdere ab initio-startvolumes worden berekend. Hier werden 26.741 deeltjes geselecteerd en gebruikt voor ab initio modellering en homogene verfijning van een enkele 2,9 Å-structuur.

Na het overbrengen van coördinaten van deeltjes die in cryoSPARC v3 naar RELION-3 waren geplukt, voerden we vier extra rondes van 2D-classificatie uit totdat de dataset convergeerde naar stabiele 2D-klassen. De hierboven beschreven 2D-classificatie verwijderde nog eens 3.154 deeltjes uit de dataset. Met behulp van de structuur gegenereerd in cryoSPARC v3 als een eerste model, produceerde 3D-verfijning in RELION-3 een structuur met een bijna equivalente resolutie van 2,95 Å. Latere structurele verfijningen, waaronder bewegingscorrectie per deeltje en CTF-verfijningen, verhoogden de resolutie tot 2,61 Å. Een volledige lijst van verfijningen die we hebben uitgevoerd, is weergegeven in tabel 1. Het volume berekend in RELION-3 werd vervolgens verder verfijnd in Scipion 3 met behulp van meerdere rondes van hoge resolutie verfijning (Xmipp3 - highres). Tijdens volgende verfijningsrondes werden nog eens 3.186 deeltjes uit de dataset verwijderd, wat resulteerde in een definitieve set van 20.401 deeltjes, die een 2,3 Å-reconstructie van AAV produceerde (figuur 5 en figuur 6). Gezien de pixelgrootte van 1,045 Å hebben onze verfijningen dus bijna de Nyquist-limiet bereikt. FSC-curven die structuren vertegenwoordigen die met elk programma zijn berekend, zijn weergegeven in figuur 6. Deze FSC-curven geven de toename van de resolutie gedurende de workflow aan. Omdat de resolutie van punt tot punt in de kaart kan verschillen, is het vaak beter om de verdeling van lokale resolutieschattingen in de kaart weer te geven in plaats van een enkele resolutieschatting te rapporteren volgens een enkel criterium (bijvoorbeeld 0,143-criterium) van de FSC-curve. Daarom hebben we een dergelijke analyse uitgevoerd met Xmipp - MonoRes in Scipion 3. Figuur 7 toont een vergelijking van lokale resolutieschattingen voor kaarten verkregen met cryoSPARC v3 en Scipion 3. Resolutieschattingen bij vier verschillende segmenten door de structuren (figuur 7A,B) en resolutiehistogrammen (figuur 7C) tonen duidelijk de incrementele verbetering van de lokale resolutie tussen de kaarten gedurende de workflow. De FSC-curve berekend met behulp van het programma Xmipp3 - highres in Scipion 3 geeft aan dat de Nyquist-limiet is bereikt (figuur 6), wat suggereert dat de schatting van de resolutie zeer waarschijnlijk wordt beperkt door ondersampling29. De MonoRes-analyse in figuur 7C, samen met een zorgvuldige analyse van de EM-kaart en kaart die past bij atoomcoördinaten van AAV (figuur 5), suggereert echter dat een adequatere resolutieschatting voor de kaart 2,3 Å is. Een soortgelijke strategie die de fsc- en monores-resolutieramingen met elkaar verzoent, is eerder gepresenteerd24,25. Omdat resolutieschattingen kunnen worden beïnvloed door het masker dat wordt gebruikt tijdens verfijningsstappen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het masker geen enkel deel van de dichtheid uitsluit. Het masker dat in deze studie werd gebruikt, overlapte met de 3D-reconstructies en is weergegeven in figuur 7D. De geleidelijke toename van de resolutie in de gepresenteerde workflow benadrukt het voordeel van het gebruik van algoritmen uit meerdere SPA-softwarepakketten om een hoogwaardige en hoge resolutie 3D-reconstructie te bereiken.

In-situ modelbouw of het uitrusten van de kaart met een reeds bestaand atoommodel kan dienen als kwaliteitscontrole voor de berekende structuur. We hebben de uiteindelijke kaart in UCSF Chimera gevisualiseerd en de kaart voorzien van een eerder gepubliceerd atoommodel (PDB ID: 7kfr)30. Figuur 5 toont gebieden van de cryo-EM-kaart die zijn uitgerust met atoomcoördinaten van AAV. Goed gedefinieerde EM-dichtheden maken het mogelijk om zijketens van individuele aminozuren, watermoleculen en magnesiumionen aan te passen en bevestigen de overeenstemming van de cryo-EM-kaart met het atoommodel.

Figure 1
Figuur 1: Volledige SPA-workflow voor cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 en Phenix 1.18. Stappen die zijn voltooid in cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 en Phenix 1.18 worden aangeduid met respectievelijk paarse, oranje, groene en grijze vakken. De tijd die nodig is voor het voltooien van elke stap met behulp van de verwerkingsserver die is uitgerust met 8 GPU's, 40 CPU's en 750 GB RAM, wordt gespecificeerd in elke afzonderlijke doos. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Selectie van micrografen voor downstream-verwerking in cryoSPARC v3. (A) Micrografieën met goed op elkaar afgestemde geschatte en experimentele Thon-ringen werden gebruikt voor verdere verwerking, terwijl die met hoog astigmatisme en slechte pasvorm (B) werden weggegooid. Micrografieën met CTF-fit boven 5 Å, astigmatisme boven 400 Å en relatieve ijsdikte onder 2 werden verwijderd uit verdere verwerking, d.w.z. 70/395 microfoto's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: 2D-klassen selecteren. 2D-klassegemiddelden met goed gedefinieerde klassen worden geselecteerd (A) en die met lage resolutie, ruis en partiële deeltjes worden afgewezen (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Workflow en representatieve resultaten voor AAV-verwerking over cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3. Stappen voltooid in cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 worden aangeduid met respectievelijk paarse, oranje en groene pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Hoge-resolutie structuur van AAV toont goed gedefinieerde EM-dichtheden die verschillende secundaire structuurelementen en individuele aminozuurzijketens vertegenwoordigen. (A) Een laatste kaart van AAV. (B) Een deel van de kaart dat bètabladen voorstelt, voorzien van atoomcoördinaten van AAV (PDB ID: 7kfr)30. (C) Kaartdichtheden die individuele aminozuren vertegenwoordigen. Van links naar rechts: arginine, fenylalanine en tryptofaan. (D) Kenmerken met een hoge resolutie van de kaart omvatten watermoleculen gepresenteerd in rode en magnesiumionen gepresenteerd als groene bollen. Mg2 + ion weergegeven in de figuur wordt gecoördineerd door histidine (links) en arginine residuen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: FSC-curven van cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 tonen een toenemende resolutie in de workflow. Terwijl de FSC-curve berekend met behulp van het programma Xmipp3 - highres in Scipion 3 aangeeft dat de Nyquist-limiet is bereikt, wat suggereert dat de resolutieschatting wordt beperkt door ondersampling29, wordt een adequatere analyse van de kaartresolutie weergegeven in figuur 7 en besproken in de sectie Representatieve resultaten24,25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Validatie van de uiteindelijke reconstructie in Scipion 3 met Xmipp - MonoRes. De resolutie van de kaart kan beter worden beschreven door lokale resolutieverdelingen te presenteren in plaats van een enkele resolutieschatting volgens een enkel criterium uit de FSC-curve. (A-B) De panelen A en B tonen verschillende segmenten van kaarten die zijn gegenereerd in respectievelijk cryoSPARC v3 en Scipion 3. (C) Histogrammen die een systematische toename van de lokale resolutie aantonen voor kaarten berekend in cryoSPARC v3 (roze balken) en Scipion 3 (blauwe balken). (D) Het masker (grijs) dat wordt gebruikt voor lokale resolutieberekeningen bevat alle delen van de AAV-dichtheden die in beide programma's zijn verfijnd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Programma Verfijning type Script
CryoSPARC v3 Homogene verfijning Homogene verfijning
Niet-uniforme verfijning Niet-uniforme verfijning
Heterogene verfijning Heterogene verfijning
Bewegingscorrectie per deeltje Lokale bewegingscorrectie
Relion-3 3D verfijning Refine3D
Nabewerking - B-factor Verscherping, MTF Correctie Refine3D
Deeltjes polijsten Bayesiaans polijsten
CTF verfijning - beam tilt CtfRefine
CTF-verfijning - anisotrope vergroting CtfRefine
CTF-verfijning - onscherpte per deeltje, astigmatisme per deeltje/micrograaf CtfRefine
Ewald bolkromming correctie Relion_reconstruct
Scipion 3 Verfijning met hoge resolutie Xmipp3 - highres
Phenix 1,18 Dichtheidsmodificatie en verscherping ResolveCryoEM

Tabel 1: Verfijningen geïmplementeerd in de hele workflow. Of bepaalde verfijningen van toepassing zijn op een specifiek project, hangt af van de gegevenskwaliteit en acquisitieparameters. De Ewald-bolkrommingscorrectie kan bijvoorbeeld worden toegepast voor kaarten die al een hoge resolutie hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel presenteren we een robuuste SPA-workflow voor cryo-EM-gegevensverwerking op verschillende softwareplatforms om 3D-reconstructies met hoge resolutie te bereiken (figuur 1). Deze workflow is toepasbaar op een breed scala aan biologische macromoleculen. De volgende stappen van het protocol worden beschreven in figuur 4, inclusief filmvoorbewerking, deeltjesverzameling en -classificatie en meerdere methoden voor structuurverfijningen (tabel 1) en validatie. Verwerkingsstappen in cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 zijn gepresenteerd, evenals methoden voor het overbrengen van gegevens tussen de softwarepakketten. We hebben de tussenliggende structuren die in het hele protocol zijn verkregen met toenemende resolutie getoond (figuur 4, figuur 6 en figuur 7).

Hoewel de methoden die in dit manuscript worden beschreven, kunnen worden gebruikt voor structuurbepaling van verschillende eiwitten en biologische assemblages, is het belangrijk op te merken dat AAV een ideale kandidaat is voor structuurbepaling met hoge resolutie door cryo-EM en SPA, omdat de grote omvang een hoog contrast in de microscoop produceert en icosaëdrische symmetrie deeltjes oplevert met 60-voudige subeenheidredundantie. Het verkrijgen van reconstructies met hoge resolutie wordt steeds moeilijker voor kleine (d.w.z. minder dan 100 kD), dynamische en heterogene monsters. Om dit protocol met succes uit te voeren, is het van cruciaal belang dat veel films van hoge kwaliteit worden verzameld voor verwerking. Met ruwe gegevens van slechte kwaliteit is het verkrijgen van een reconstructie met een hoge resolutie en hoge kwaliteit niet mogelijk. Als de ijsdikte bijvoorbeeld niet optimaal is voor structuurbepaling of als deeltjes zich hechten aan de ijs-waterinterface of voorkeursoriëntaties vertonen, bekijk dan opnieuw de vriesomstandigheden van het raster.

Een andere belangrijke stap in de workflow is het plukken en extraheren van deeltjes. Tijdens het deeltjeskiezen moet de doosgrootte ongeveer 1,4-2,5 keer groter zijn dan de langste as van het deeltje, omdat voldoende doosgrootte nodig is om informatie met hoge resolutie op te vangen die als gevolg van onscherpte wordt verspreid. Grotere doosformaten vereisen echter langere verwerkingstijden vanwege de grotere grootte van bestanden die worden gegenereerd tijdens deeltjesextractie. Houd bij het kiezen van een doosgrootte rekening met de deeltjesdiameter en pixelgrootte. Bij veel deeltjes wil de gebruiker misschien deeltjes tijdens de extractie weggooien voor de eerste verwerking en vervolgens deeltjes op ware grootte opnieuw extraheren voor de laatste verfijningen. Dit protocol maakt gebruik van handmatige deeltjesverkiezing om sjablonen voor automatische selectie te genereren. CryoSPARC v3 biedt echter ook volledig geautomatiseerde pickmethoden, waaronder een blob-gebaseerde picker en een Topaz-wrapper, die deep learning gebruikt om deeltjes te selecteren op basis van eerdere picks. Hoewel deze algoritmen zeer robuust zijn, zou een aanzienlijk aantal picks later moeten worden verwijderd door 2D- en 3D-classificatie.

Kritieke stappen omvatten ook 2D- en 3D-classificatie die wordt gebruikt om artefacten te verwijderen, zoals door straling beschadigde deeltjes en verschillende structurele vormen van het monster in het monster te scheiden. Het aantal 2D-klassen dat door de gebruiker wordt ingesteld, moet afhangen van het aantal deeltjes dat wordt geëxtraheerd uit micrografieën, contrast en heterogeniteit in het monster, omdat het doel is om elke individuele weergave van het deeltje in een afzonderlijke 2D-klasse te scheiden. Voeg als algemene regel een 2D-klasse toe voor elke 100 deeltjes en als het verwerken van een nieuw monster met een groot aantal deeltjes, 100 klassen een goed startpunt is. Als een lage of matige resolutie wordt verkregen, zelfs na vele rondes van 2D- en 3D-classificatie, probeer dan opnieuw deeltjes met een grotere doosgrootte te extraheren om te zien of er meer structurele informatie kan worden verkregen. Bij het rapporteren van de resolutie van de uiteindelijke reconstructie, moet men de FSC-curve analyseren die is verkregen volgens de gouden standaardmethode, samen met de lokale resolutieschattingen en zorgvuldige inspectie van de kaartdichtheden, evenals hun overeenstemming met het atoommodel.

Voor verfijningen van de virusstructuren heeft de Ewald-bolkrommingscorrectie geïmplementeerd in RELION-3 verbeteringen aangetoond bij hoge resolutie31. Als u structuren van dynamische multiproteïnecomplexen verfijnt, probeer dan 3D multi-body verfijning geïmplementeerd in RELION-3 of gerichte classificatie met beeldaftrek geïmplementeerd in RELION-3 en cryoSPARC v3. Als heterogeniteit niet computationeel kan worden opgelost, is het noodzakelijk om de omstandigheden voor monstervoorbereiding opnieuw te bekijken32. Onvoldoende zuiverheid of onvoldoende voorbereiding met eiwitafbraak tot gevolg zal de kwaliteit van de 3D-reconstructie belemmeren. Bovendien beperken bufferomstandigheden die eiwitten destabiliseren of aggregatie bevorderen, het aantal goed gedefinieerde deeltjes dat kan worden gebruikt voor structuurberekening ernstig. Om de hier gepresenteerde methoden zo effectief mogelijk te gebruiken, is het dus noodzakelijk om optimale omstandigheden voor monsterstabiliteit te identificeren. We raden negatieve-kleuring elektronenmicroscopie aan om de monsters voorafgaand aan cryo-EM te screenen.

Naarmate cryo-EM voor een toenemend aantal structuurbiologen de voorkeursmethode voor 3D-structuurbepaling is geworden, wordt de behoefte aan een integratieve en robuuste workflow voor beeldverwerking en structuurbepaling duidelijker. CryoSPARC biedt een gebruiksvriendelijke, webgebaseerde grafische gebruikersinterface (GUI) waarmee gebruikers van alle ervaringsniveaus snel gegevens kunnen verwerken en een 3D-structuur kunnen berekenen. CryoSPARC maakt met name gebruik van een stochastische gradiëntafdaling om ab initio 3D-reconstructie uit te voeren. Bovendien maakt de software gebruik van een vertakkings- en gebonden waarschijnlijkheidsoptimalisatiealgoritme voor snelle 3D-kaartverfijning7. De verwerkingspijplijn die in dit artikel wordt beschreven, gebruikt cryoSPARC v3 om een eerste 3D-kaart te verkrijgen. De 3D-reconstructie wordt vervolgens verfijnd in RELION-3, een populair pakket dat een empirische Bayesiaanse benadering gebruikt om kritieke parameters te schatten op basis van de dataset van de gebruiker, waardoor de behoefte aan deskundige kennis voor de werking van het programma wordt verminderd10. In het bijzonder gebruiken we Bayesiaanse polijsting voor bewegingscorrectie per deeltje en CTF-verfijningen om de resolutie te verbeteren. Ten slotte wordt de resulterende structuur verder verfijnd en gevalideerd in Scipion 311, een integratieve Python-shell die algoritmen van meerdere platforms ondersteunt, waaronder Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 en anderen. Hoewel er veel verschillende softwarepakketten beschikbaar zijn voor cryo-EM-gebruikers, is er momenteel geen universeel SPA-platform dat door het veld wordt geaccepteerd. Hoewel de SPA-workflow volledig kan worden uitgevoerd in elk van de drie softwarepakketten die in dit artikel worden beschreven, kunnen verschillende algoritmen verschillende resultaten opleveren. Bijgevolg moeten individuele stappen worden aangepast, afhankelijk van het monster en de kwaliteit van de gegevens. Voor de huidige dataset verhoogde 3Drefine in RELION-3 bijvoorbeeld de resolutie van de 3D-reconstructie, terwijl non-uniforme verfijning in cryoSPARC v3 leidde tot een lichte afname van de resolutie. Het is dus zeer nuttig om een verscheidenheid aan programma's te gebruiken om structuren opnieuw te berekenen om optimale kwaliteit en resolutie te bereiken en om de validatie van de reconstructies te vergemakkelijken. Hoewel Scipion 3 tal van algoritmen van cryoSPARC v3 en RELION-3 bevat, zijn de meest recente implementaties van deze programma's niet onmiddellijk beschikbaar in Scipion. Van de programma's die in dit manuscript worden gebruikt, biedt bijvoorbeeld alleen RELION-3 Ewald Sphere Curvature Correction via het script Relion_reconstruct. De pijplijn die in dit artikel wordt gepresenteerd, biedt een handleiding voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers om met succes algoritmen te gebruiken die zijn geïmplementeerd in cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om 3D-structuren met bijna atomaire resolutie te berekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken Carlos Oscar Sorzano voor hulp bij de installatie van Scipion3 en Kilian Schnelle en Arne Moeller voor hulp bij gegevensoverdracht tussen verschillende verwerkingsplatforms. Een deel van dit onderzoek werd ondersteund door NIH-subsidie U24GM129547 en uitgevoerd bij de PNCC bij OHSU en toegankelijk via EMSL (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research. Deze studie werd ondersteund door een start-up grant van Rutgers University aan Arek Kulczyk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

Biochemie Nummer 179 cryo-elektronenmicroscopie cryo-EM single-particle analyse SPA cryoSPARC RELION Scipion beeldverwerking structuurberekening AAV
Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter