Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

Abstract

Hem enstrümantasyon hem de görüntü işleme yazılımındaki son gelişmeler, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobunu (kriyo-EM), yapısal biyologların çok çeşitli makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için tercih ettikleri yöntem haline getirmiştir. Görüntü işleme ve yapı hesaplaması için yeni ve uzman kullanıcılar tarafından aynı temel iş akışını kolaylaştıran birden fazla yazılım paketi mevcuttur: mikroskop dedektörleri tarafından edinilen filmler, ışın kaynaklı hareket ve kontrast aktarım fonksiyonu (CTF) tahmini için düzeltmeye tabi tutulur. Daha sonra, parçacık görüntüleri yinelemeli 2B ve 3B sınıflandırma için ortalama film karelerinden seçilir ve ayıklanır, ardından 3B yeniden yapılandırma, iyileştirme ve doğrulama yapılır. Çeşitli yazılım paketleri farklı algoritmalar kullandığından ve çalışmak için farklı uzmanlık seviyeleri gerektirdiğinden, ürettikleri 3D haritalar genellikle kalite ve çözünürlük bakımından farklılık gösterir. Böylece, kullanıcılar en iyi sonuçlar için çeşitli programlar arasında düzenli olarak veri aktarırlar. Bu makale, kullanıcıların popüler yazılım paketlerinde bir iş akışında gezinmeleri için bir kılavuz sağlar: adeno ilişkili virüsün (AAV) atomik çözünürlüğe yakın bir yapısını elde etmek için cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. İlk önce cryoSPARC v3 ile bir görüntü işleme boru hattını detaylandırıyoruz, çünkü verimli algoritmaları ve kullanımı kolay GUI'si kullanıcıların bir 3D haritaya hızlı bir şekilde ulaşmalarını sağlıyor. Bir sonraki adımda, parçacık koordinatlarını cryoSPARC v3'te elde edilen en iyi kalitede 3D rekonstrüksiyondan RELION-3 ve Scipion 3'e dönüştürmek ve aktarmak ve 3D haritaları yeniden hesaplamak için PyEM ve şirket içi komut dosyalarını kullanıyoruz. Son olarak, RELION-3 ve Scipion 3'ten algoritmaları entegre ederek ortaya çıkan yapıların daha fazla iyileştirilmesi ve doğrulanması için adımları özetliyoruz. Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak üzere üç işleme platformunun etkili bir şekilde nasıl kullanılacağını açıklayacağız.

Introduction

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) ve tek parçacık analizi (SPA), hidratlanmış hallerinde çok çeşitli biyomoleküler montajların yapı tayinini sağlayarak bu makromoleküllerin rollerini atomik detaylarda aydınlatmaya yardımcı olur. Mikroskop optiği, bilgisayar donanımı ve görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, biyomoleküllerin yapılarını 2 Å1,2,3'ün ötesine ulaşan çözünürlükte belirlemeyi mümkün kılmıştır. 2020 yılında Protein Veri Bankası'na (PDB) 2.300'den fazla kriyo-EM yapısı yatırılırken, 20144 yılında 192 yapıya kıyasla, kriyo-EM'nin birçok yapısal biyolog için tercih edilen yöntem haline geldiğini göstermektedir. Burada, yüksek çözünürlüklü yapı tayini için üç farklı SPA programını birleştiren bir iş akışını açıklıyoruz (Şekil 1).

SPA'nın amacı, bir mikroskop dedektörü tarafından kaydedilen gürültülü 2D görüntülerden bir hedef numunenin 3D hacimlerini yeniden yapılandırmaktır. Dedektörler, görüntüleri aynı görüş alanına sahip ayrı karelere sahip filmler olarak toplar. Numuneyi korumak için, çerçeveler düşük elektron dozuyla toplanır ve bu nedenle zayıf bir sinyal-gürültü oranına (SNR) sahiptir. Ek olarak, elektron pozlaması vitrifiye kriyo-EM ızgaraları içinde hareketi indükleyebilir ve görüntü bulanıklığına neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çerçeveler ışın kaynaklı hareketi düzeltmek için hizalanır ve artan SNR'ye sahip bir mikrograf üretmek için ortalamaları alınır. Bu mikrograflar daha sonra mikroskop tarafından uygulanan bulanıklaştırma ve sapmaların etkilerini hesaba katmak için Kontrast Transfer Fonksiyonu (CTF) tahminine tabi tutulur. CTF ile düzeltilmiş mikrograflardan, bireysel parçacıklar seçilir, ekstrakte edilir ve vitreus buzdaki numune tarafından benimsenen farklı yönelimleri temsil eden 2D sınıf ortalamalarına ayrılır. Ortaya çıkan homojen parçacık kümesi, kaba bir model veya modeller oluşturmak için ab initio 3D rekonstrüksiyonu için girdi olarak kullanılır ve bunlar daha sonra bir veya daha fazla yüksek çözünürlüklü yapı üretmek için yinelemeli olarak rafine edilir. Rekonstrüksiyondan sonra, kriyo-EM haritasının kalitesini ve çözünürlüğünü daha da iyileştirmek için yapısal iyileştirmeler yapılır. Son olarak, ya bir atomik model doğrudan haritadan türetilir ya da harita başka bir yerde elde edilen atomik koordinatlarla donatılmıştır.

Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 ve diğerleri dahil olmak üzere yukarıda özetlenen görevleri yerine getirmek için farklı yazılım paketleri mevcuttur. Bu programlar benzer işleme adımlarını izlerken, örneğin parçacıkları toplamak, ilk modeller oluşturmak ve rekonstrüksiyonları rafine etmek için farklı algoritmalar kullanırlar. Ek olarak, bu programların çalışması için farklı düzeyde kullanıcı bilgisi ve müdahalesi gerekir, çünkü bazıları yeni kullanıcılar için bir engel teşkil edebilecek parametrelerin ince ayarına bağlıdır. Bu tutarsızlıklar genellikle platformlar arasında tutarsız kalite ve çözünürlüğe sahip haritalara neden olur14 ve birçok araştırmacının sonuçları iyileştirmek ve doğrulamak için birden fazla yazılım paketi kullanmasına neden olur. Bu makalede, gen terapisi için yaygın olarak kullanılan bir vektör olan AAV'nin yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için kriyoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün kullanımını vurguladık15. Yukarıda belirtilen yazılım paketleri akademik kullanıcılar için ücretsizdir; cryoSPARC v3 ve Scipion 3 lisans gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yeni bir cryoSPARC v3 projesi oluşturma ve verileri içe aktarma

NOT: Veriler, Portland'daki Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nde (OHSU), bir Falcon 3 doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 300 kV Titan Krios elektron mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. Görüntüler, 129 kare boyunca kesirlenmiş toplam 28,38 e−/Å2 dozu ve EPU kullanılarak 1,045 şpiksel boyutunda -0,5 μm ila -2,5 μm arasında bir bulanıklaştırma aralığı ile sayım modunda toplanmıştır. AAV-DJ örneği OHSU personeli tarafından sağlanmıştır.

  1. cryoSPARC v3'ü bir web tarayıcısında açın ve Projeler başlığına tıklayın. Yeni bir proje oluşturmak için + Ekle'yi seçin. Projeyi buna göre adlandırın ve işlerin ve verilerin kaydedileceği varolan bir dizine giden bir yol sağlayın.
  2. Projeyi açıp + Ekle'ye tıklayarak ve Yeni Çalışma Alanı'nı seçerek proje için bir çalışma alanı oluşturun. Çalışma alanına bir başlık verin ve Oluştur'a tıklayın.
  3. Yeni çalışma alanına gidin ve sağ paneldeki İş Oluşturucu'yu açın. Bu sekme, cryoSPARC v3'te bulunan tüm işlevleri görüntüler. Filmleri İçe Aktar'a tıklayın ve film yolunu sağlayın, referans dosya yolunu kazanın ve alma parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Ham Piksel Boyutu 1.045 Å, Hızlanma Voltajı 300 kV, Küresel Sapma 2.7 mm, Toplam Maruz Kalma Dozu 28.38 e-/Å^2.
  4. Kuyruk'a tıklayın, işi ve çalışma alanını çalıştırmak için bir şerit seçin ve Oluştur'a tıklayın.
    NOT: Edinme parametreleri numuneye ve mikroskopa bağlıdır.

2. CryoSPARC v3 - film hizalaması ve CTF tahmini

  1. Yama Hareket Düzeltme'yi (Çoklu) açın. Bu iş, adım 1.3'te içe aktarılan filmlerin giriş olarak kullanılmasını gerektirir. Çalışma alanında film içe aktarma iş kartını açın ve Imported_movies çıktısını yeni işteki filmler yer tutucusuna sürükleyin. İşi kuyruğa alın.
    NOT: Bu makalede özetlenen cryoSPARC yöntemleri hakkında daha fazla bilgi için, cryoSPARC tutorial16'ya bakın.
  2. CTF tahmini gerçekleştirmek için, Yama CTF Tahmini'ni (Çoklu) açın. Adım 2.1'de oluşturulan mikrografları girin ve işi kuyruğa alın .
  3. Ortalama ve CTF ile düzeltilmiş mikrografları incelemek ve daha sonraki işlemler için bir alt küme seçmek üzere Pozlamaları Küratörlüğünü Yap'ı açın ve adım 2.2'de elde edilen pozlamaları girin. İşi kuyruğa alın.
  4. İş Bekleme moduna girdikten sonra, iş kartındaki Etkileşim sekmesine tıklayın, parametre eşiklerini ayarlayın ve daha fazla işlem için tek tek mikrografları kabul edin veya reddedin. İyi eşleşmiş tahmini ve deneysel CTF'lere sahip mikrografları kabul edin (Şekil 2) ve yüksek astigmatizma, zayıf CTF uyumu ve kalın buzu olanları atın.
  5. Mevcut verileri işlerken, Astigmatizmanın üst eşiğini 400 Å, CTF uyum çözünürlüğünü 5 şve göreceli buz kalınlığını 2 olarak ayarlayın. Aşağı akış işleme için mikrografları seçmek üzere Bitti'ye tıklayın.

3. CryoSPARC v3 - manuel ve şablon tabanlı parçacık toplama

  1. Manuel Seçici'yi açın, 2.4-2.5 adımlarından kabul edilen pozlamaları girin ve işi kuyruğa alın. Etkileşimli sekmesine tıklayın, Kutu Boyutu'nu (piksel) 300 olarak ayarlayın ve birden fazla mikrografta birkaç yüz parçacığa tıklayın ve çakışan parçacıkları seçmekten kaçının. Burada, 29 mikrografta 340 parçacık seçildi. İşiniz bittiğinde, Toplama Bitti'ye tıklayın! Parçacıkları ayıklayın.
    NOT: Bu protokol, otomatik seçim için şablonlar oluşturmak üzere manuel parçacık toplama kullanır. Ancak, başka yöntemler de mevcuttur17.
  2. Otomatik partikül toplama şablonları oluşturmak için 2B Sınıflandırma'ya tıklayın ve adım 3.1'de oluşturulan parçacık seçimlerini girin. 2B Sınıf sayısını 10 olarak değiştirin ve işi kuyruğa alın .
  3. 2B sınıfları seç'i açın. Adım 3.2'de elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin ve İnteraktif sekmesine tıklayın. İyi SNR'ye sahip temsili 2D sınıfları seçin ve Bitti'ye tıklayın.
    NOT: Sınıf ortalamaları farklı parçacık görünümlerini yansıtır. Her görünümü yansıtan sınıf ortalamalarını seçin. Amaç, otomatik toplama için numunenin farklı görünümlerini temsil eden iyi tanımlanmış şablonlar üretmektir.
  4. Şablon Seçici'yi açın ve adım 3.3'te seçilen 2B sınıfları ve adım 2.4-2.5'teki mikrografları girin. Parçacık Çapı'nı (Å) 220 şolarak ayarlayın ve işi kuyruğa alın.
  5. Otomatik çekimleri incelemek için Partikül Çekme Seç'i açın, adım 3.4'te oluşturulan parçacıkları ve mikrografları girin ve işi sıraya alın.
  6. Parçacık Seçimlerini Seç iş kartında, Etkileşimli sekmesine tıklayın ve Kutu boyutunu (px) 300 olarak ayarlayın. Tek bir mikrografa tıklayın, parçacıklar açıkça görünene kadar lowpass filtresini ayarlayın ve Normalleştirilmiş Çapraz Korelasyon (NCC) Eşiğini 0,41'e ve Güç Eşiğini 54000 ile 227300 arasında ayarlayın.
  7. Birkaç mikrografı inceleyin ve gerekirse eşikleri, çoğu parçacığın yanlış pozitifler dahil edilmeden seçileceği şekilde ayarlayın. İşiniz bittiğinde, Toplama Bitti'ye tıklayın! Parçacıkları ayıklayın.
    NOT: Gerçek parçacıklar tipik olarak şablona benzer olduklarını ve sırasıyla yüksek bir SNR'ye sahip olduklarını gösteren yüksek bir NCC ve güç puanına sahiptir.
  8. Mikrograflardan Ekstrakt'ı açın ve adım 3.7'deki mikrografları ve parçacıkları girin. Ayıklanan Kutu Boyutu'nu (px) 300 olarak ayarlayın ve İşi kuyruğa alın.

4. CryoSPARC v3 - 2D sınıflandırma

  1. 2B Sınıflandırma'ya tıklayın ve 3.8. adımdan çıkarılan parçacıkları girin. 2B sınıf sayısını 50 olarak ayarlayın ve işi kuyruğa alın.
  2. Daha fazla işleme için en iyi 2B sınıfları seçmek üzere 2B sınıfları seç'i açın. Adım 4.1'de elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin. İnteraktif sekmesine tıklayın ve sınıftaki parçacıkların çözünürlüğüne ve sayısına göre 2B sınıfları seçin (Şekil 3). Yapılar içeren sınıfları seçmeyin. Seçtikten sonra Bitti'ye tıklayın.
    NOT: Genellikle, farklı, iyi tanımlanmış sınıflara yakınsamayan parçacıkları çıkarmak için birden fazla 2B sınıflandırma turu gerekir. Bu tür parçacıkları veri kümesinden çıkarmak için gerektiği kadar 2B sınıflandırma turu çalıştırın (Şekil 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio rekonstrüksiyonu ve homojen arıtma

  1. İlk 3B hacim oluşturmak için, Ab-initio Rekonstrüksiyonu'nu açın ve adım 4.2'de veya son 2B sınıflandırmasından elde edilen parçacıkları girin. Simetriyi ikosahedral olarak ayarlayın. İşi kuyruğa alın.
    NOT: Simetri örneğe bağımlıdır ve buna göre değiştirilmelidir. Bilinmiyorsa, C1 simetrisini kullanın.
  2. Açık Homojen İyileştirme. Adım 5.1'den gelen hacmi ve 4.2'deki parçacıkları veya son 2B sınıflandırmayı girin. Simetriyi değiştirin ve işi kuyruğa alın . İş bittiğinde, Fourier Shell Korelasyon (FSC) eğrisini inceleyin ve UCSF Chimera18'de incelemek üzere birimi indirin.

6. Parçacık koordinatlarını kriyoSPARC v3'ten dışa aktarma ve PyEM kullanarak RELION-3'e aktarma

NOT: Parçacık koordinatları, her mikrograftaki tek tek parçacıkların konumu hakkında bilgi taşır. Parçacık yığınları yerine koordinatların RELION-3'e aktarılması, aksi takdirde kullanılamayacak olan iyileştirme adımlarının çalıştırılmasına izin verir. Örneğin, parçacık parlatma işlemi ilk film karelerine erişim gerektirir. Bu nedenle, parçacık koordinatlarını kriyoSPARC v3'ten RELION-3'e ihraç etmeden önce, filmleri içe aktarın ve RELION-3'te hareket düzeltme ve CTF tahmini yapın. Ayrıntılar için RELION-3 öğreticisine19 bakın.

  1. RELION-3 proje dizinine gidin ve RELION-3'ü başlatın.
  2. İş türü tarayıcısından İçeri Aktar'ı açın ve adım 1.3'te olduğu gibi filmlerin ve alma parametrelerinin yolunu belirtin.
  3. Hareket düzeltmesi yapmak için, RELION-3 GUI aracılığıyla UCSF MotionCor220'yi kullanın, Hareket Düzeltme'yi açın ve UCSF MotionCor2 kılavuzundaki21 gibi varsayılan parametreleri ayarlayın. Adım 6.2'de içe aktarılan filmlerin yolunu girin. Hareket sekmesinde, motioncor2 yürütülebilir dosyasının yolunu belirtin.
    NOT: MotionCor2, birden fazla GPU kullanılarak paralel olarak çalıştırılabilir.
  4. CTFFIND-4.122 kullanarak RELION-3 GUI aracılığıyla CTF tahmini gerçekleştirin. CTF Tahmini'ni açın ve adım 6.3'te oluşturulan micrographs.star'ı girin. CTFFIND-4.1 sekmesinde, CTFFIND-4.1 yürütülebilir dosyasının yolunu belirtin ve parametreleri RELION-3.1 öğreticisinde19 olduğu gibi ayarlayın.
  5. Partikül yığınlarını cryoSPARC v3'ten RELION-3'e aktarmak için, önce cryoSPARC v3'ten dışa aktarılmaları gerekir. CryoSPARC v3'te, adım 4.2'den veya son 2B sınıflandırmadan 2B sınıf seç işinin iş kartını açın. Ayrıntılar sekmesinde, İşi Dışa Aktar'a tıklayın. Dışa aktarma işi , particles_exported.cs dosyasının çıktısını verir.
  6. Parçacık koordinatlarını cryoSPARC v3'ten RELION-3'e aktarmadan önce, adım 6.5'teki particles_exported.cs dosyası .star biçimine dönüştürülmelidir. PyEM23 kullanarak, aşağıdaki komutu yürüterek particles_exported.cs dosyasını .star biçimine dönüştürün: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. RELION-3'te, Manuel Malzeme Çekme sekmesine tıklayın ve G/Ç sekmesinde, adım 6.4'te açıklanan CTF iyileştirmesinden mikrografları girin. Görüntü sekmesinde şu parametreleri girin: Partikül çapı (A): 220, Lowpass Filtresi (A): -1, CTF görüntüsü için ölçek: 0,5. İşi çalıştırın . RELION-3 giriş klasöründe ManualPick adlı bir dizin oluşturulur.
    NOT: Bu adım, RELION-3'te el ile toplama klasörü yapısı oluşturmak için gerçekleştirilir. El ile toplama çalıştırılırken, RELION-3 GUI'sinde toplama için kullanılan her ortalama mikrograf için toplanan parçacıkların koordinatlarını içeren tek bir .star dosyası oluşturulur.
  8. Adım 6.6'dan particles_exported.star dosyasını içeren klasöre gidin ve adım 6.5'te dışa aktarılan son 2B sınıflandırmaya katkıda bulunan kriyo-SPARC v3 parçacıklarının toplanması için kullanılan her ortalama mikrograf için tek bir manualpick.star dosyası üreten ev yapımı bir komut dosyası çalıştırın. Elde edilen koordinat dosyaları ManualPick/Movies klasörüne kaydedilir.
  9. RELION-3'e dönün ve El ile Malzeme Çekme işini yeniden açın. Devam'a tıklayın. Bu, daha önce RELION-3 GUI'de cryoSPARC v3'te toplanan parçacıkları gösterecektir. Parçacık koordinatlarının transferinin gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğini ve parçacıkların uygun şekilde seçilip seçilmediğini doğrulamak için birkaç mikrografı inceleyin.

7. RELION-3 - Partikül ekstraksiyonu ve 2D sınıflandırma

  1. Partikül Ekstraksiyonu'na tıklayın. G/Ç sekmesinde, adım 6.4'teki CTF düzeltilmiş mikrografları ve adım 6.9'daki koordinatları girin. Extract sekmesine tıklayın ve Parçacık Kutusu Boyutu'nu (pix) 300 olarak değiştirin. İşi çalıştırın.
  2. Daha yüksek çözünürlüklü bir rekonstrüksiyon elde etmek için cryoSPARC v3'te üretilen partikül setini daha da temizlemek için 2D sınıflandırma gerçekleştirin. 2B Sınıflandırma'ya tıklayın ve G/Ç sekmesine tıklayın, adım 7.1'de oluşturulan particles.star dosyasını girin. Optimizasyon sekmesinde, Sınıf Sayısı'nı 50 ve Maske Çapı'nı (A) 280 olarak ayarlayın. İşi çalıştırın .
    NOT: Maske tüm parçacığı kapsamalıdır.
  3. En iyi 2B sınıfları seçmek için Alt Küme Seçimi yöntemine tıklayın, adım 7.2'den _model.star dosyasını girin ve İşi çalıştırın . Adım 4.2'de açıklandığı gibi sınıfları seçin.
  4. Yakınsak olmayan parçacıkları kaldırmak için 7.2 ve 7.3 numaralı adımları yineleyin.

8. RELION-3 - 3D iyileştirme, maske oluşturma ve son işlem

  1. cryoSPARC v3'te (adım 5.2) oluşturulan haritayı RELION-3'te 3B iyileştirme için ilk model olarak kullanın. İçe Aktarma yöntemini seçin ve G/Ç sekmesinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Ham Filmleri/Mikrografları İçe Aktar: Hayır, Ham Giriş Dosyaları: Filmler/*.mrc.
  2. MTF dosyasını sağlayın ve adım 1.3'te açıklandığı gibi film alma parametrelerini girin. Diğerleri sekmesinde, giriş dosyası olarak cryoSPARC v3 eşlemesini seçin, Düğüm Türü'nü 3B başvuru (.mrc) olarak değiştirin ve İşi çalıştırın .
  3. 3B Otomatik Hassaslaştır'ı seçin ve G/Ç sekmesinde, Adım 7.3'ten veya son seçim işinden particles.star dosyası olarak Giriş Görüntüleri'ni ayarlayın. CryoSPARC v3 rekonstrüksiyonunu Referans Haritası olarak verin. Referans sekmesine tıklayın ve İlk Düşük Geçişli filtreyi (Å) 50 olarak ve Simetri'yi ikosahedral olarak değiştirin. Optimizasyon sekmesinde, Maske Çapı'nı (Å) 280 olarak değiştirin ve işi çalıştırın.
  4. Koşu bittikten sonra UCSF Chimera'da run_class001.mrc'yi açın.
  5. UCSF Chimera'da Araçlar'a tıklayın ve Birim Verileri altında Birim Görüntüleyici'yi seçin. Bu, ses ayarlarını yapmak için yeni bir pencere açacaktır. Adım'ı 1 olarak değiştirin ve haritada gürültü olmadığı seviye değerine ulaşana kadar kaydırıcıyı ayarlayın. Bir sonraki adımda maske oluşturmak için kullanılacağı için bu değeri kaydedin.
  6. Otomatik arıtmadan üretilen harita gerçek FSC'yi yansıtmaz, çünkü çevreleyen çözücüden gelen gürültü çözünürlüğü düşürür. İşlem sonrası işlemden önce, numuneyi çözücü bölgesinden ayırt etmek için bir maske oluşturun.
    1. Maske Oluşturma'ya tıklayın ve adım 8.3'ten run_class001.mrc girin.
    2. Maske sekmesine tıklayın ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: Lowpass Filtre Haritası (Å): 10, Piksel Boyutu (Å): 1.045, İlk Binarizasyon Eşiği: adım 8.5'te elde edilen düzey değeri, İkili Eşlemeyi şu kadar Pikselle Genişlet: 3 ve Bu kadar Pikselin Yumuşak Kenarını Ekle: 3. İşi çalıştırın.
  7. UCSF Chimera'daki maskeyi inceleyin. Maske çok sıkıysa, İkili Eşlemeyi bu kadar Piksele Genişlet seçeneğini artırın ve/veya Bu kadar Pikselin Yumuşak Kenarını Ekleyin. Keskin bir maske aşırı takılmaya neden olabileceğinden, yumuşak kenarlı bir maske oluşturmak önemlidir.
  8. İşlem Sonrası ve G/Ç sekmesine tıklayın, adım 8.3'te oluşturulan yarım haritaları girin ve 8.6'dan maskeleyin. Kalibre Edilmiş Piksel Boyutu'nu 1,045 şolarak ayarlayın. Keskinleştir sekmesinde aşağıdakileri girin: B-Faktörünü Otomatik Olarak Tahmin Et?: Evet, Otomatik B Sığdırma (A) için En Düşük Çözünürlük: 10, Kendi B-Faktörünüzü Kullanın?: Hayır. Filtre sekmesinde, FSC Ağırlıklandırmayı Atla? öğesini Hayır. İşi çalıştır olarak ayarlayın.

9. RELION-3 - Parlatma eğitimi ve partikül parlatma

  1. Parçacık demeti kaynaklı hareketi düzeltmeden önce, önce veri kümesi için en uygun hareket izlerini tanımlamak üzere eğitim modunu kullanın. Bayesian Parlatma'yı açın ve G/Ç sekmesinde, adım 6.3'teki hareket düzeltmeli mikrografları, adım 8.3'teki parçacıkları ve adım 8.8'den işlem sonrası .star dosyasını girin. Eğitim sekmesine tıklayın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: En Uygun Parametreleri Eğit : Evet, Test için Fourier Piksellerinin Kesri: 0,5, Şu kadar Parçacığı kullanın: 5000. İşi çalıştırın .
    NOT: Bu komut dosyası, RELION-3 Polish klasöründe, aşağıdaki adımı yürütmek için gereken optimize edilmiş parlatma parametrelerini içeren opt_params_all_groups.txt dosyası oluşturur.
  2. Eğitim işi bittiğinde, Bayes Parlatma'ya tıklayın. Eğitim sekmesine tıklayın ve En Uygun Parametreleri Eğit? öğesini Hayır olarak ayarlayın. Lehçe sekmesini seçin ve En İyileştirilmiş Parametre Dosyası'nda adım 9.1'den itibaren opt_params_all_groups.txt dosyasının yolunu belirtin. Çalıştır'a tıklayın.
  3. 3B iyileştirmeyi (adım 8.3) ve son işlemeyi (adım 8.8) bir dizi cilalı parçacıkla tekrarlayın.

10. RELION-3 - CTF ve parçacık başına iyileştirmeler

  1. Daha yüksek dereceli sapmaları tahmin etmek için CTF Ayrıntılandırması'nı açın ve Parçacıklar altındaki G/Ç sekmesinde, son Hassaslaştırma 3B işinden (run_data.star) cilalanmış parçacıklar içeren .star dosyasının yolunu seçin.
    1. Postprocess Yıldız Dosyası altında, en son işlem sonrası işin çıktısının yolunu ayarlayın (adım 9.3).
    2. Sığdır sekmesini seçin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Tahmin (Anizotropik Büyütme): Hayır, CTF Parametre Sığdırma Gerçekleştir? Hayır, Beamtilt'i tahmin edin: Evet, ayrıca Trefoil'i de tahmin edin? Evet, 4. Dereceden Abberasyonları Tahmin Edin? Evet. İşi çalıştırın.
  2. Önceki işte (particles_ctf_refine.star) oluşturulan giriş parçacıkları (Refine3D'den) olarak kullanarak adım 10.1'i yineleyin. Sığdır sekmesinde, Tahmin'i (Anizotropik Büyütme) Evet olarak değiştirin ve İşi çalıştırın .
  3. Önceki işte (particles_ctf_refine.star) üretilen giriş parçacıkları (Refine3D'den) olarak kullanarak adım 10.2'yi yineleyin. Sığdır sekmesinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Tahmin (Anizotropik Büyütme): Hayır, CTF Parametre Uydurma Gerçekleştir?: Evet, Bulanıklaştırmayı Sığdır?: Parçacık başına, Astigmatizmaya Uy? Mikrograf başına, Fit B-faktörü?: Hayır, Fit Phase-Shift: Hayır, Estimate Beamtilt?: Hayır, Estimate 4th Order Anormalrations?: Hayır. Çalıştırın.
    NOT: Parçacığın yeterli kontrasta sahip olduğu göz önüne alındığında, Astigmatizmaya Uy? sekmesi Parçacık Başına olarak ayarlanabilir. Bu veri kümesi için, Parçacık Başına astigmatizma arıtması, haritanın kalitesini ve çözünürlüğünü iyileştirmedi.
  4. Adım 10.3'teki parçacıklarla 3B iyileştirmeyi tekrarlayın ve G/ Ç sekmesinde Solvent Düzleştirilmiş FSC'ler Kullan? öğesini evet olarak ayarlayın. Çalıştırmayı bitirdiğinizde, bir işlem sonrası işi yürütün (adım 8.8) ve haritayı UCSF Chimera'da inceleyin (adım 5.2).

11. RELION-3 parçacık koordinatlarının ve 3D haritanın Scipion 3'e aktarılması

  1. RELION-3 haritasını daha da hassaslaştırmak ve doğrulamak için, önce son işlem sonrası işteki (adım 10.4) hacmi ve parçacıkları Scipion 3'e aktarın. Scipion 3'ü başlatın ve yeni bir proje oluşturun.
  2. Sol Protokoller panelinde, İçe Aktarmalar açılır menüsünü seçin ve Parçacıkları İçe Aktar'a tıklayın. Aşağıdaki parametreleri değiştirin: İçe Aktar: RELION-3, Yıldız Dosyası: postprocess.starve adım 1.3'teki gibi alma parametrelerini belirtin. Yürüt'e tıklayın.
  3. İçe Aktarmalar açılır menüsüne tıklayın ve Birimleri İçe Aktar'ı seçin. İçe Aktar altında, RELION-3 haritasının yolunu verin. Piksel boyutunu (örnekleme hızı) Å/px değerini 1,045 olarak değiştirin ve uygulayın.

12. Scipion 3 - Yüksek çözünürlüklü iyileştirme

  1. İlk olarak, genel bir hizalama gerçekleştirin. Protokoller panelinde İyileştir açılır menüsünü seçin ve Xmipp3 - highres24'e tıklayın. İçe aktarılan parçacıkları ve hacimleri sırasıyla 11.2 ve 11.3 adımlarından Tam Boyutlu Görüntüler ve Başlangıç Hacimleri olarak girin ve Simetri Grubunu ikosahedral olarak ayarlayın. Açısal Atama altındaki Görüntü Hizalama sekmesinde Genel'i seçin ve Maksimum Hedef Çözünürlüğü'nü 3 şolarak ayarlayın ve İşi çalıştırın.
  2. İş bittiğinde, Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Yeni pencerede, rafine edilmiş hacmi incelemek için UCSF Chimera simgesine tıklayın. Ek olarak, iyileştirmeden sonra FSC'nin nasıl değiştiğini görmek için Görüntü Çözünürlüğü Grafikleri'ne (FSC) ve Euler açı atamalarının değişip değişmediğini görmek için Açısal Değişikliklerle Grafik Histogramı'na tıklayın.
    NOT: Giriş RELION-3 yapısının çözünürlüğüne bağlı olarak, bu adım Açısal Atama sekmesi altındaki Maksimum Hedef Çözünürlüğü için ayarlanan farklı değerlerle birkaç kez yinelenebilir. Daha fazla bilgi için Scipion öğreticisine25 bakın.
  3. Adım 12.1'i yerel bir hizalamayla yineleyin. Önceki işi kopyalayın ve Önceki Çalıştırmayı Seç'i Xmipp3 - highres Global olarak değiştirin. Açısal Atama sekmesinde, Görüntü Hizalaması'nı Yerel olarak değiştirin. Maksimum Hedef Çözünürlüğünü 2,1 şolarak ayarlayın.
  4. UCSF Chimera'daki rafine haritayı inceleyin ve FSC ve açısal atamalardaki değişimi analiz edin (adım 12.2). Çözünürlük düzelmeyene ve açısal atamalar birleşene kadar yerel iyileştirmeyi yineleyin ve Maksimum Hedef Çözünürlüğünü gerektiği gibi ayarlayın.
  5. Scipion 3'ün çıkış haritası ayrıca Phenix26'da yoğunluk modifiye edilebilir ve keskinleştirilebilir.

13. Scipion 3 - Harita doğrulama

  1. Xmipp3 - highres'te oluşturulan son haritanın yerel çözünürlüğünü inceleyin. Xmipp - yerel MonoRes27'yi açın ve adım 8.6'da oluşturulan önceki işin ve maskenin son birimini girin. Çözünürlük Aralığı'nı 0,1 şaralıklarla 1 ila 6 şarasında ayarlayın ve İşi yürütün.
  2. Çalışmayı bitirdiğinizde, Sonuçları Analiz Et'e tıklayın ve çözünürlükle renklendirilmiş çözünürlük histogramını ve hacim dilimlerini inceleyin.
  3. Parçacıkların iyi hizalanmış olup olmadığını görmek için Multireference Alignability28'i açın ve adım 12.3'ten itibaren parçacıkları ve hacmi girin. Doğrulama grafiğini görüntülemek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. İdeal olarak, tüm noktalar (1.0,1.0) etrafında kümelenmelidir.
  4. Xmipp3'ü açın - Aşırı Sığmayı Doğrulayın. Adım 12.3'teki parçacıkları ve hacimleri girin. Çalışmayı bitirdiğinde, sonuçları analiz edin ve aşırı uygun grafiği inceleyin. Hizalanmış Gauss gürültüsünün ve hizalanmış parçacık eğrilerinin çaprazlanması, aşırı uyumu gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Üç farklı işleme platformu kullanarak yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek için kapsamlı bir SPA boru hattı sunduk: cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. Şekil 1 ve Şekil 4, genel işleme iş akışını özetler ve Tablo 1, iyileştirme protokollerini ayrıntılarıyla açıklar. Bu protokoller, AAV'nin 2.3 şyapısının iyileştirilmesi sırasında kullanıldı ve Nyquist çözünürlüğüne yakın bir çözünürlük elde edildi.

Filmler ilk önce kriyoSPARC v3'e aktarıldı ve daha sonra ortalama mikrograflar oluşturmak için hareket ve CTF düzeltildi. Daha ileri işlemler için mikrografları seçerken, iyi bir CTF uyumu ve düşük astigmatizması olanları seçmek önemlidir (Şekil 2), çünkü düşük kaliteli mikrografların dahil edilmesi daha sonraki işleme aşamalarını engelleyebilir ve daha düşük çözünürlüklü bir rekonstrüksiyona neden olabilir. 27.364 parçacık daha sonra toplandı ve seçilen mikrograflardan çıkarıldı. AAV'nin çapı yaklaşık 220 şve piksel boyutu 1,045 şolduğundan, 300 piksellik bir kutu boyutu kullanılmıştır. Daha sonra, kararlı sınıflara yaklaşmayan yapıları ve parçacıkları kaldırmak için yinelemeli 2B sınıflandırma kullanıldı. Seçilen ve hariç tutulan 2B sınıf ortalamalarına örnekler Şekil 3'te sunulmuştur. Ayrıca, numunenin farklı konformasyonlarını yansıtan sınıf ortalamalarının, birden fazla 3D rekonstrüksiyon elde etmek için ayrı ayrı rafine edilmesi gerektiğine dikkat etmek de önemlidir. Böyle bir durumda, birden fazla ab initio başlangıç hacmi hesaplanmalıdır. Burada, 26.741 parçacık seçildi ve ab initio modellemesi ve tek bir 2.9 şyapısının homojen arıtılması için kullanıldı.

KriyoSPARC v3'te toplanan parçacıkların koordinatlarını RELION-3'e aktardıktan sonra, veri seti kararlı 2D sınıflarına yaklaşana kadar dört ek 2D sınıflandırma turu gerçekleştirdik. Yukarıda açıklanan 2D sınıflandırması, veri setinden ek 3.154 parçacık çıkardı. İlk model olarak cryoSPARC v3'te üretilen yapıyı kullanarak, RELION-3'teki 3D iyileştirme, neredeyse 2.95 şçözünürlüğe eşdeğer bir yapı üretti. Parçacık başına hareket düzeltmesi ve CTF iyileştirmelerini içeren sonraki yapısal iyileştirmeler, çözünürlüğü 2.61 Å'ye yükseltti. Gerçekleştirdiğimiz iyileştirmelerin tam listesi Tablo 1'de sunulmuştur. RELION-3'te hesaplanan hacim daha sonra Scipion 3'te birden fazla yüksek çözünürlüklü arıtma turu (Xmipp3 - highres) kullanılarak daha da rafine edildi. Sonraki arıtma turları sırasında, veri setinden ek 3.186 parçacık çıkarıldı ve bu da AAV'nin 2.3 şrekonstrüksiyonunu üreten 20.401 parçacıktan oluşan son bir küme ile sonuçlandı (Şekil 5 ve Şekil 6). Böylece, 1.045 Å'lik piksel boyutu göz önüne alındığında, iyileştirmelerimiz neredeyse Nyquist sınırına ulaştı. Her program kullanılarak hesaplanan yapıları temsil eden FSC eğrileri Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu FSC eğrileri, iş akışı boyunca çözünürlük artışını gösterir. Çözünürlük haritada noktadan noktaya değişebileceğinden, FSC eğrisinden tek bir ölçüte (örneğin, 0,143 ölçütü) göre tek bir çözünürlük tahmini raporlamak yerine, yerel çözünürlük tahminlerinin dağılımını haritada sunmak genellikle daha uygundur. Böylece, Scipion 3'te Xmipp - MonoRes kullanarak böyle bir analiz gerçekleştirdik. Şekil 7, cryoSPARC v3 ve Scipion 3 ile elde edilen haritalar için yerel çözünürlük tahminlerinin karşılaştırmasını göstermektedir. Yapılar (Şekil 7A,B) ve çözünürlük histogramları (Şekil 7C) aracılığıyla dört farklı dilimde yapılan çözünürlük tahminleri, iş akışı boyunca haritalar arasındaki yerel çözünürlükteki artımlı iyileşmeyi açıkça göstermektedir. Scipion 3'teki Xmipp3 - highres programı kullanılarak hesaplanan FSC eğrisi, Nyquist sınırına ulaşıldığını gösterir (Şekil 6), çözünürlük tahmininin büyük olasılıkla yetersiz örnekleme29 ile sınırlı olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, Şekil 7C'de sunulan MonoRes analizi, EM haritasının dikkatli bir analizi ve AAV'nin atomik koordinatlarıyla eşleşen harita (Şekil 5) ile birlikte, harita için daha yeterli bir çözünürlük tahmininin 2.3 şolduğunu göstermektedir. FSC ve MonoRes çözünürlük tahminlerini uzlaştıran benzer bir strateji daha önce sunulmuştur24,25. Çözünürlük tahminleri, iyileştirme adımları sırasında kullanılan maskeden etkilenebileceğinden, maskenin yoğunluğun herhangi bir bölümünü dışlamadığından emin olmak önemlidir. Bu çalışmada kullanılan maske 3D rekonstrüksiyonlarla örtüşerek Şekil 7D'de sunulmuştur. Sunulan iş akışındaki çözünürlükteki kademeli artış, yüksek kaliteli ve yüksek çözünürlüklü bir 3D rekonstrüksiyon elde etmek için birden fazla SPA yazılım paketinden algoritmaların kullanılmasının avantajını vurgulamaktadır.

Yerinde model oluşturma veya haritayı önceden var olan bir atomik modelle eşleştirmek, hesaplanan yapı için kalite kontrolü görevi görebilir. UCSF Chimera'daki son haritayı görselleştirdik ve haritayı daha önce yayınlanmış bir atomik modelle (PDB ID: 7kfr)30 donattık. Şekil 5 , kriyo-EM haritasının AAV'nin atomik koordinatlarıyla donatılmış bölgelerini göstermektedir. İyi tanımlanmış EM yoğunlukları, bireysel amino asitlerin, su moleküllerinin ve magnezyum iyonlarının yan zincirlerinin takılmasına izin verir ve kriyo-EM haritasının atomik modelle anlaşmasını doğrular.

Figure 1
Resim 1: kriyoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 ve Phoenix 1.18 genelinde eksiksiz SPA iş akışı. CryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 ve Phoenix 1.18'de tamamlanan adımlar sırasıyla mor, turuncu, yeşil ve gri kutularla gösterilir. 8 GPU, 40 CPU ve 750 GB RAM ile donatılmış işlem sunucusunu kullanarak her adımın tamamlanması için gereken süre, her bir kutuda belirtilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: KriyoSPARC v3'te aşağı akış işleme için mikrografların seçimi . (A) Daha ileri işlemler için iyi eşleşmiş tahmini ve deneysel Thon halkalarına sahip mikrograflar kullanılırken, yüksek astigmatizması ve zayıf uyumu olanlar (B) atıldı. CTF-uyumu 5 Å'nin üzerinde, astigmatizması 400 Å'nin üzerinde ve bağıl buz kalınlığı 2'nin altında olan mikrograflar, daha sonraki işlemlerden, yani 70/395 mikrograflardan çıkarıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: 2B sınıfları seçme. İyi tanımlanmış sınıfları içeren 2B sınıf ortalamaları seçilir (A) ve düşük çözünürlüklü, gürültülü ve kısmi parçacıklara sahip olanlar reddedilir (B). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: CryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'te AAV işleme için iş akışı ve temsili sonuçlar. CryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'te tamamlanan adımlar sırasıyla mor, turuncu ve yeşil oklarla gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: AAV'nin yüksek çözünürlüklü yapısı, farklı ikincil yapı elemanlarını ve bireysel amino asit yan zincirlerini temsil eden iyi tanımlanmış EM yoğunluklarını göstermektedir. (A) AAV'nin son haritası. (B) AAV'nin atomik koordinatlarıyla donatılmış beta sayfalarını temsil eden haritanın bir kısmı (PDB ID: 7kfr)30. (C) Tek tek amino asitleri temsil eden harita yoğunlukları. Soldan sağa: arginin, fenilalanin ve triptofan. (D) Haritanın yüksek çözünürlüklü özellikleri arasında kırmızı renkte sunulan su molekülleri ve yeşil küreler olarak sunulan magnezyum iyonları bulunmaktadır. Şekilde gösterilen Mg2 + iyonu, histidin (solda) ve arginin kalıntıları tarafından koordine edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün FSC eğrileri, iş akışı genelinde artan çözünürlük göstermektedir. Scipion 3'teki Xmipp3 - highres programı kullanılarak hesaplanan FSC eğrisi, çözünürlük tahmininin yetersiz örnekleme29 ile sınırlı olduğunu öne sürerek Nyquist sınırına ulaşıldığını gösterirken, harita çözünürlüğünün daha yeterli bir analizi Şekil 7'de sunulmuş ve Temsili Sonuçlar bölümünde24,25 tartışılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Xmipp - MonoRes kullanarak Scipion 3'teki son rekonstrüksiyonun doğrulanması. Haritanın çözünürlüğü, FSC eğrisinden tek bir kritere göre tek bir çözünürlük tahmini yerine yerel çözünürlük dağılımları sunarak daha iyi tanımlanır. (A-B) A ve B panelleri, sırasıyla cryoSPARC v3 ve Scipion 3'te oluşturulan haritalardan farklı dilimler gösterir. (C) KriyoSPARC v3 (pembe çubuklar) ve Scipion 3 (mavi çubuklar) ile hesaplanan haritalar için lokal çözünürlükte sistematik bir artış gösteren histogramlar. (D) Yerel çözünürlük hesaplamaları için kullanılan maske (gri), her iki programda da rafine edilmiş AAV yoğunluklarının tüm parçalarını içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Program İyileştirme türü Betik
cryoSPARC v3 Homojen İyileştirme Homojen İyileştirme
Tekdüze Olmayan İyileştirme Tekdüze Olmayan İyileştirme
Heterojen İyileştirme Heterojen İyileştirme
Partikül başına hareket düzeltme Yerel Hareket Düzeltme
İLİŞKİLİK-3 3B iyileştirme Hassaslaştır3D
Son İşlem - B-faktör Bileyici, MTF Düzeltme Hassaslaştır3D
Partikül Parlatma Bayes Parlatma
CTF iyileştirme - ışın eğme CtfRefine
CTF iyileştirme - anizotropik büyütme CtfRefine
CTF iyileştirme - parçacık başına defokus, parçacık başına/mikrograf astigmatizması CtfRefine
Ewald küre eğriliği düzeltmesi Relion_reconstruct
Scipion 3 Yüksek çözünürlüklü iyileştirme Xmipp3 - yüksek çözünürlük
Phoenix 1.18 Yoğunluk Modifikasyonu ve Keskinleştirme ÇözümleCryoEM

Tablo 1: İş akışı boyunca uygulanan iyileştirmeler. Belirli iyileştirmelerin belirli bir projeye uygulanabilir olup olmadığı, veri kalitesine ve edinme parametrelerine bağlıdır. Örneğin, Ewald küre eğriliği düzeltmesi zaten yüksek çözünürlüğe sahip haritalar için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için çeşitli yazılım platformlarında kriyo-EM veri işleme için sağlam bir SPA iş akışı sunuyoruz (Şekil 1). Bu iş akışı çok çeşitli biyolojik makromoleküllere uygulanabilir. Protokolün sonraki adımları, film ön işleme, parçacık toplama ve sınıflandırma ve yapı iyileştirmeleri (Tablo 1) ve doğrulama için çoklu yöntemler dahil olmak üzere Şekil 4'te özetlenmiştir. CryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'teki işleme adımlarının yanı sıra yazılım paketleri arasında veri aktarma yöntemleri sunulmuştur. Protokol boyunca elde edilen ara yapıları artan çözünürlükle gösterdik (Şekil 4, Şekil 6 ve Şekil 7).

Bu makalede özetlenen yöntemler farklı proteinlerin ve biyolojik düzeneklerin yapı tayini için kullanılabilirken, AAV'nin kriyo-EM ve SPA ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için ideal bir aday olduğunu belirtmek önemlidir, çünkü büyük boyutu mikroskopta yüksek kontrast üretir ve ikosahedral simetri 60 kat alt birim fazlalığına sahip parçacıklar verir. Yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonların elde edilmesi, küçük (yani 100 kD'den az), dinamik ve heterojen numuneler için giderek zorlaşmaktadır. Bu protokolü başarılı bir şekilde yürütmek için, birçok yüksek kaliteli filmin işlenmek üzere toplanması kritik öneme sahiptir. Düşük kaliteli ham verilerle, yüksek çözünürlüklü ve yüksek kaliteli bir yeniden yapılandırma elde etmek mümkün değildir. Örneğin, buz kalınlığı yapı tayini için en uygun değilse veya parçacıklar buz-su arayüzüne yapışırsa veya tercih edilen yönelimleri sergilerse, ızgara donma koşullarını tekrar gözden geçirin.

İş akışındaki bir diğer önemli adım da partikül toplama ve ekstraksiyondur. Partikül toplama sırasında, kutu boyutu, parçacığın en uzun ekseninden yaklaşık 1,4-2,5 kat daha büyük olmalıdır, çünkü bulanıklaştırma nedeniyle yayılan yüksek çözünürlüklü bilgileri yakalamak için yeterli kutu boyutu gereklidir. Bununla birlikte, daha büyük kutu boyutları, parçacık ekstraksiyonu sırasında üretilen dosyaların boyutunun artması nedeniyle daha uzun işlem süreleri gerektirir. Bir kutu boyutu seçerken, parçacık çapını ve piksel boyutunu göz önünde bulundurun. Birçok parçacıkla, kullanıcı ilk işleme için ekstraksiyon sırasında parçacıkları bölmek ve daha sonra son arıtmalar için tam boyutlu parçacıkları yeniden çıkarmak isteyebilir. Bu protokol, otomatik seçim için şablonlar oluşturmak üzere manuel parçacık toplamayı kullanır. Bununla birlikte, cryoSPARC v3 ayrıca blob tabanlı bir toplayıcı ve önceki toplamalara göre parçacıkları seçmek için derin öğrenmeyi kullanan bir Topaz sarmalayıcı da dahil olmak üzere tam otomatik toplama yöntemleri sunar. Bu algoritmalar çok sağlam olsa da, önemli sayıda seçimin daha sonra 2D ve 3D sınıflandırma ile kaldırılması gerekecektir.

Kritik adımlar ayrıca, radyasyon hasarlı parçacıklar gibi eserleri çıkarmak ve numunede bulunan numunenin farklı yapısal formlarını ayırmak için kullanılan 2D ve 3D sınıflandırmayı da içerir. Kullanıcı tarafından belirlenen 2B sınıfların sayısı, mikrograflardan çıkarılan parçacıkların sayısına, numunedeki kontrasta ve heterojenliğe bağlı olmalıdır, çünkü amaç, parçacığın her bir görünümünü ayrı bir 2B sınıfına ayırmaktır. Genel bir kural olarak, her 100 parçacık için bir 2B sınıf ekleyin ve çok sayıda parçacık içeren yeni bir numune işleniyorsa, 100 sınıf iyi bir başlangıç noktasıdır. Birçok 2B ve 3B sınıflandırma turundan sonra bile düşük veya orta düzeyde bir çözünürlük elde edilirse, daha fazla yapısal bilginin elde edilip edilemeyeceğini görmek için parçacıkları daha büyük bir kutu boyutuyla yeniden çıkarmayı deneyin. Nihai rekonstrüksiyonun çözünürlüğünü bildirirken, altın standart yöntemine göre elde edilen FSC eğrisini, yerel çözünürlük tahminleri ve harita yoğunluklarının dikkatli bir şekilde incelenmesinin yanı sıra atomik modelle olan anlaşmalarını analiz etmelidir.

Virüs yapılarının iyileştirilmesi için, RELION-3'te uygulanan Ewald küre eğriliği düzeltmesi, yüksek çözünürlükte iyileşmeler göstermiştir31. Dinamik multiprotein komplekslerinin yapılarını rafine ediyorsanız, RELION-3'te uygulanan 3D çok gövdeli arıtmayı veya RELION-3 ve cryoSPARC v3'te uygulanan görüntü çıkarma ile odaklanmış sınıflandırmayı deneyin. Heterojenlik hesaplamalı olarak çözülemiyorsa, numune hazırlama koşullarını tekrar gözden geçirmek gerekir32. Protein bozulmasına neden olan yetersiz saflık veya yetersiz hazırlık, 3D rekonstrüksiyonun kalitesini engelleyecektir. Ek olarak, proteinleri dengesizleştiren veya agregasyonu teşvik eden tampon koşulları, yapı hesaplaması için kullanılabilecek iyi tanımlanmış parçacıkların sayısını ciddi şekilde sınırlar. Bu nedenle, burada sunulan yöntemleri en etkili şekilde kullanmak için, numune stabilitesi için en uygun koşulların belirlenmesi zorunludur. Kriyo-EM'den önce numuneleri taramak için negatif boyamalı elektron mikroskobu öneriyoruz.

Kriyo-EM, artan sayıda yapısal biyolog için 3D yapı belirleme için tercih edilen yöntem haline geldikçe, görüntü işleme ve yapı belirleme için bütünleştirici ve sağlam bir iş akışına duyulan ihtiyaç daha belirgin hale gelmektedir. CryoSPARC, tüm deneyim düzeylerindeki kullanıcıların verileri hızlı bir şekilde işlemesine ve bir 3B yapı hesaplamasına olanak tanıyan kullanımı kolay, web tabanlı bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sunar. Özellikle, CryoSPARC ab initio 3D rekonstrüksiyonu gerçekleştirmek için stokastik bir gradyan inişi kullanır. Ayrıca, yazılım hızlı 3B harita iyileştirme için bir dal ve bağlı olasılık optimizasyon algoritması kullanır7. Bu makalede açıklanan işleme ardışık düzeni, ilk 3B haritayı oluşturmak için cryoSPARC v3 kullanır. 3D rekonstrüksiyon daha sonra, kullanıcının veri setine dayanarak kritik parametreleri tahmin etmek için ampirik bir Bayes yaklaşımı kullanan popüler bir paket olan RELION-3'te rafine edilir ve böylece programın çalışması için uzman bilgisine olan ihtiyacı azaltır10. Özellikle, parçacık başına hareket düzeltmesi için Bayes parlatma ve çözünürlüğü iyileştirmek için CTF iyileştirmeleri kullanıyoruz. Son olarak, ortaya çıkan yapı, Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 ve diğerleri de dahil olmak üzere birden fazla platformdan algoritmaları destekleyen bütünleştirici bir Python kabuğu olan Scipion 311'de daha da rafine edilmiş ve doğrulanmıştır. Cryo-EM kullanıcıları için birçok farklı yazılım paketi mevcut olsa da, şu anda alan tarafından kabul edilen evrensel bir SPA platformu bulunmamaktadır. SPA iş akışı, bu makalede açıklanan üç yazılım paketinden herhangi birinde tam olarak yürütülebilse de, farklı algoritmalar farklı sonuçlar verebilir. Sonuç olarak, verilerin örneğine ve kalitesine bağlı olarak bireysel adımlar özelleştirilmelidir. Örneğin, mevcut veri kümesi için, RELION-3'teki 3Drefine, 3D rekonstrüksiyonunun çözünürlüğünü arttırırken, cryoSPARC v3'teki Nonuniform arıtma, hafif bir çözünürlük düşüşüne neden oldu. Bu nedenle, optimum kalite ve çözünürlük elde etmek ve rekonstrüksiyonların doğrulanmasını kolaylaştırmak için yapıları yeniden hesaplamak için çeşitli programların kullanılması büyük ölçüde faydalıdır. Scipion 3, cryoSPARC v3 ve RELION-3'ten çok sayıda algoritma içermesine rağmen, bu programların en son uygulamaları Scipion'da hemen mevcut değildir. Örneğin, bu makalede kullanılan programlardan sadece RELION-3, Relion_reconstruct senaryosu aracılığıyla Ewald Küre Eğriliği Düzeltmesi sunmaktadır. Bu makalede sunulan işlem hattı, hem yeni hem de deneyimli kullanıcıların, atoma yakın çözünürlükte 3B yapıları hesaplamak için cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'te uygulanan algoritmaları başarıyla kullanmaları için bir kılavuz sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Carlos Oscar Sorzano'ya Scipion3 kurulumundaki yardımları için ve Kilian Schnelle ve Arne Moeller'e farklı işleme platformları arasında veri aktarımı konusunda yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu araştırmanın bir kısmı NIH hibesi U24GM129547 tarafından desteklendi ve OHSU'daki PNCC'de gerçekleştirildi ve Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi tarafından desteklenen bir DOE Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan EMSL (grid.436923.9) aracılığıyla erişildi. Bu çalışma, Rutgers Üniversitesi'nden Arek Kulczyk'e verilen bir start-up hibesi ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

Biyokimya Sayı 179 kriyo-elektron mikroskobu kriyo-EM tek parçacık analizi SPA cryoSPARC RELION Scipion görüntü işleme yapı hesaplama AAV
CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter