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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.

Abstract

Os recentes avanços no software de instrumentação e processamento de imagens tornaram a microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) o método preferido para biólogos estruturais determinarem estruturas de alta resolução de uma grande variedade de macromoléculas. Vários pacotes de software estão disponíveis para usuários novos e experientes para processamento de imagens e cálculo de estrutura, que simplificam o mesmo fluxo de trabalho básico: filmes adquiridos pelos detectores de microscópio passam por correção para estimativa da função de transferência de movimento e contraste (CTF) induzida pelo feixe. Em seguida, as imagens de partículas são selecionadas e extraídas de quadros de filme medianos para classificação iterativa 2D e 3D, seguidas de reconstrução 3D, refinamento e validação. Como vários pacotes de software empregam algoritmos diferentes e exigem diferentes níveis de experiência para operar, os mapas 3D que eles geram muitas vezes diferem em qualidade e resolução. Assim, os usuários transferem regularmente dados entre uma variedade de programas para obter resultados ideais. Este artigo fornece um guia para que os usuários naveguem em um fluxo de trabalho através dos pacotes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma estrutura de resolução quase atômica do vírus associado ao adeno (AAV). Primeiro detalhamos um pipeline de processamento de imagem com o crioSPARC v3, pois seus algoritmos eficientes e gui fácil de usar permitem que os usuários cheguem rapidamente a um mapa 3D. Na etapa seguinte, usamos pyem e scripts internos para converter e transferir coordenadas de partículas da melhor reconstrução 3D de qualidade obtida em crioSPARC v3 para RELION-3 e Scipion 3 e recalcular mapas 3D. Finalmente, delineamos etapas para maior refinamento e validação das estruturas resultantes, integrando algoritmos do RELION-3 e Scipion 3. Neste artigo, descrevemos como utilizar efetivamente três plataformas de processamento para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados para determinação de estrutura de alta resolução.

Introduction

A microscopia crio-elétron (crio-EM) e a análise de partículas únicas (SPA) permitem a determinação da estrutura de uma grande variedade de conjuntos biomoleculares em seu estado hidratado, ajudando a iluminar os papéis dessas macromoléculas em detalhes atômicos. Melhorias na óptica de microscópio, hardware de computador e software de processamento de imagens tornaram possível determinar estruturas de biomoléculas em resolução que ultrapassassem 2 Å1,2,3. Mais de 2.300 estruturas crio-EM foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) em 2020, em comparação com 192 estruturas em 20144, indicando que o crio-EM tornou-se o método de escolha de muitos biólogos estruturais. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que combina três programas SPA diferentes para determinação da estrutura de alta resolução (Figura 1).

O objetivo da SPA é reconstruir volumes 3D de um espécime alvo a partir de imagens 2D ruidosas registradas por um detector de microscópio. Os detectores coletam imagens como filmes com quadros individuais do mesmo campo de visão. Para preservar a amostra, os quadros são coletados com uma dose eletrônica baixa e, portanto, têm uma má relação sinal-ruído (SNR). Além disso, a exposição a elétrons pode induzir o movimento dentro das grades crio-EM vitrificadas, resultando em desfoque de imagem. Para superar esses problemas, os quadros estão alinhados para corrigir o movimento induzido pelo feixe e médios para produzir um micrografo com um SNR aumentado. Esses micrografos passam então pela estimativa da Função de Transferência de Contraste (CTF) para explicar os efeitos do desfoco e das aberrações impostas pelo microscópio. A partir dos micrografos corrigidos pelo CTF, as partículas individuais são selecionadas, extraídas e classificadas em médias de classe 2D representando diferentes orientações adotadas pelo espécime em gelo vítreo. O conjunto homogêneo resultante de partículas é usado como entrada para a reconstrução 3D ab iniciado para gerar um modelo ou modelos grosseiros, que são então refinados iterativamente para produzir uma ou mais estruturas de alta resolução. Após a reconstrução, são realizados refinamentos estruturais para melhorar ainda mais a qualidade e a resolução do mapa crio-EM. Finalmente, ou um modelo atômico é diretamente derivado do mapa, ou o mapa é equipado com coordenadas atômicas obtidas em outros lugares.

Diferentes pacotes de software estão disponíveis para realizar as tarefas descritas acima, incluindo Appion5, cisTEM6, crioSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, entre outros. Embora esses programas sigam etapas semelhantes de processamento, eles empregam diferentes algoritmos, por exemplo, para colher partículas, gerar modelos iniciais e refinar reconstruções. Além disso, esses programas exigem um nível variado de conhecimento e intervenção do usuário para operar, pois alguns dependem do ajuste fino de parâmetros que podem atuar como um obstáculo para novos usuários. Essas discrepâncias geralmente resultam em mapas com qualidade e resolução inconsistentes em todas as plataformas14, levando muitos pesquisadores a usar vários pacotes de software para refinar e validar resultados. Neste artigo, destacamos o uso de crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma reconstrução 3D de alta resolução do AAV, um vetor amplamente utilizado para terapia genética15. Os pacotes de software acima mencionados são gratuitos para usuários acadêmicos; crioSPARC v3 e Scipion 3 exigem licenças.

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Protocol

1. Criação de um novo projeto crioSPARC v3 e importação de dados

NOTA: Os dados foram adquiridos na Oregon Health and Science University (OHSU) em Portland usando um microscópio eletrônico Titan Krios de 300 kV equipado com um detector de elétrons direto Falcon 3. As imagens foram coletadas em um modo de contagem com uma dose total de 28,38 e−/Å2 fracionados em 129 quadros, e uma faixa de desfocus de -0,5 μm a -2,5 μm, a um tamanho de pixel de 1.045 Å usando EPU. A amostra de AAV-DJ foi fornecida pela equipe da OHSU.

  1. Abra o crioSPARC v3 em um navegador da Web e clique no cabeçalho Projetos . Selecione + Adicionar para criar um novo projeto. Título do projeto de acordo e forneça um caminho para um diretório existente onde empregos e dados serão salvos.
  2. Crie um espaço de trabalho para o projeto abrindo o projeto, clicando em + Adicionar e selecionando o Novo Espaço de Trabalho. Título do espaço de trabalho e clique em Criar.
  3. Navegue até o novo espaço de trabalho e abra o Job Builder no painel direito. Esta guia exibe todas as funções disponíveis no crioSPARC v3. Clique em Importar Filmes e forneça o caminho dos filmes, ganhe o caminho do arquivo de referência e defina parâmetros de aquisição da seguinte forma: Tamanho do Pixel Bruto 1.045 Å, Acelerando tensão de 300 kV, Aberração Esférica 2,7 mm, Dose de Exposição Total 28.38 e-/Å^2.
  4. Clique em Fila, selecione uma faixa para executar o trabalho e um espaço de trabalho e clique em Criar.
    NOTA: Os parâmetros de aquisição são dependentes de amostra e microscópio.

2. CryoSPARC v3 - alinhamento de filme e estimativa de CTF

  1. Abra a correção de movimento de patch (Multi). Este trabalho requer os filmes importados na etapa 1.3 como entrada. Abra a carteira de trabalho de filmes de importação no espaço de trabalho e arraste a saída Imported_movies para o espaço reservado para filmes no novo trabalho. Faça fila no trabalho.
    NOTA: Para obter mais informações sobre os métodos crioSPARC descritos neste artigo, consulte o tutorial crioSPARC16.
  2. Para realizar a estimativa do CTF, abra a Estimativa de Patch CTF (Multi). Insira os micrografos gerados na etapa 2.1 e enfilira o trabalho.
  3. Para inspecionar os micrografos médios e corrigidos por CTF e selecionar um subconjunto para posterior processamento, abra as Exposições de Cura e insira as exposições obtidas na etapa 2.2. Faça fila no trabalho.
  4. Após a entrada do trabalho , clique na guia Interação na carteira de trabalho, ajuste os limites dos parâmetros e aceite ou rejeite micrografos individuais para posterior processamento. Aceite micrografias com CTFs estimados e experimentais bem combinados (Figura 2) e descarte aqueles com alta astigmatismo, ajuste ctf pobre e gelo espesso.
  5. Durante o processamento dos dados atuais, defina o limiar superior do Astigmatismo para 400 Å, a resolução de ajuste ctf para 5 Å e a espessura relativa do gelo para 2. Clique em Feito para selecionar os micrografos para processamento a jusante.

3. CryoSPARC v3 - coleta manual e de partículas baseada em modelos

  1. Abra o Escolhido Manual, insira as exposições aceitas das etapas 2.4-2.5 e faça fila no trabalho. Clique na guia Interativo , defina o Tamanho da Caixa (px) para 300 e clique em algumas centenas de partículas em vários micrografos e evite selecionar partículas sobrepostas. Aqui, foram selecionadas 340 partículas em 29 micrografos. Quando terminar, clique em "Done Picking"! Extrair partículas.
    NOTA: Este protocolo usa a coleta manual de partículas para gerar modelos para seleção automática. No entanto, outros métodos também estão disponíveis17.
  2. Para gerar modelos para a colheita automatizada de partículas, clique em Classificação 2D e insira as picaretas de partículas geradas na etapa 3.1. Alterar o número de Classes 2D para 10 e Fazer fila no trabalho.
  3. Abra as classes 2D da Select. Insira as partículas e as médias de classe obtidas na etapa 3.2 e clique na guia Interativo . Selecione classes 2D representativas com bom SNR e clique em Feito.
    NOTA: As médias das classes refletem diferentes pontos de vista de partículas. Selecione as médias de classe que refletem cada exibição. O objetivo é produzir modelos bem definidos representando diferentes pontos de vista do espécime para a colheita automatizada.
  4. Escolha de modelo aberto e insira as classes 2D selecionadas na etapa 3.3 e micrografos das etapas 2.4-2.5. Defina o diâmetro da partícula (Å) para 220 Å e faça fila no trabalho.
  5. Para inspecionar as picaretas automatizadas, abra Select Particle Picks, insira as partículas e micrografias geradas na etapa 3.4 e faça fila no trabalho.
  6. No cartão de trabalho Select Particle Picks, clique na guia Interativo e defina o tamanho da caixa (px) para 300. Clique em um micrografo individual, ajuste o filtro lowpass até que as partículas estejam claramente visíveis e defina o Limiar de Correlação Cruzada Normalizada (NCC) para 0,41 e limiar de energia entre 54000 e 227300 .
  7. Inspecione vários micrografos e, se necessário, ajuste limiares de modo que a maioria das partículas sejam selecionadas sem incluir falsos positivos. Quando terminar, clique em ""Escolha"! Extrair partículas.
    NOTA: Partículas verdadeiras normalmente têm um NCC alto e escore de energia, indicando que são semelhantes ao modelo e têm um SNR alto, respectivamente.
  8. Abra o extrato de Micrografias e insira os micrografos e partículas da etapa 3.7. Defina o tamanho da caixa extrativída (px) para 300 e faça fila no trabalho.

4. CryoSPARC v3 - Classificação 2D

  1. Clique na Classificação 2D e insira as partículas extraídas da etapa 3.8. Defina o número de classes 2D para 50 e faça fila no trabalho.
  2. Para selecionar as melhores classes 2D para processamento posterior, abra selecionar classes 2D. Insira as partículas e as médias de classe obtidas na etapa 4.1. Clique na guia Interativo e escolha classes 2D com base na resolução e no número de partículas da classe (Figura 3). Não selecione as classes que contenham artefatos. Após a seleção, clique em Feito.
    NOTA: Normalmente, várias rodadas de classificação 2D são necessárias para remover partículas, que não convergem para classes distintas e bem definidas. Execute quantas rodadas de classificação 2D são necessárias para remover tais partículas do conjunto de dados (Figura 3).

5. CryoSPARC v3 - reconstrução ab-initio e refinamento homogêneo

  1. Para gerar um volume 3D inicial, abra a Reconstrução Ab-initio e insira as partículas obtidas na etapa 4.2 ou na classificação 2D final. Ajuste a simetria ao icosaedral. Faça fila no trabalho.
    NOTA: A simetria é dependente da amostra e deve ser alterada em conformidade. Se não for desconhecido, use simetria C1.
  2. Abra refinamento homogêneo. Insira o volume da etapa 5.1 e partículas a partir de 4,2 ou a classificação 2D final. Mude a simetria e enfie o trabalho. Quando o trabalho estiver concluído, inspecione a curva Fourier Shell Correlation (FSC) e baixe o volume para examinar na UCSF Quimera18.

6. Exportar coordenadas de partículas a partir de crioSPARC v3 e importá-las para RELION-3 usando PyEM

NOTA: As coordenadas de partículas carregam informações sobre a localização de partículas individuais em cada micrografo. A transferência de coordenadas em vez de pilhas de partículas para RELION-3 permite executar etapas de refinamento que de outra forma não estariam disponíveis. Por exemplo, o polimento de partículas requer acesso aos quadros iniciais do filme. Assim, antes de exportar coordenadas de partículas de crioSPARC v3 para RELION-3, importe filmes e realize a correção de movimento e estimativa de CTF em RELION-3. Consulte o tutorial RELION-319 para obter detalhes.

  1. Navegue até o diretório do projeto RELION-3 e inicie o RELION-3.
  2. Abra a importação do navegador tipo trabalho e especifique o caminho para os filmes e parâmetros de aquisição como na etapa 1.3.
  3. Para realizar a correção de movimento, use o UCSF MotionCor220 através da GUI RELION-3, abra a Correção de Movimento e defina os parâmetros padrão como no manual UCSF MotionCor221. Insira o caminho para os filmes importados na etapa 6.2. Na guia Moção, especifique o caminho para o motioncor2 executável.
    NOTA: O MotionCor2 pode ser executado em paralelo usando várias GPUs.
  4. Realize a estimativa ctf usando CTFFIND-4.122 através da GUI RELION-3. Abra a estimativa ctf e insira os micrografos.star gerados na etapa 6.3. Na guia CTFFIND-4.1, especifique o caminho para CTFFIND-4.1 executável e defina parâmetros como no tutorial RELION-3.119.
  5. Para importar pilhas de partículas do cryoSPARC v3 para o RELION-3, primeiro devem ser exportadas do crioSPARC v3. No crioSPARC v3, abra a carteira de trabalho da classe Select 2D a partir da etapa 4.2 ou a classificação 2D final. Na guia Detalhes , clique em Export Job. O trabalho de exportação produz o arquivo particles_exported.cs.
  6. Antes de importar coordenadas de partículas do crioSPARC v3 para o RELION-3, o arquivo particles_exported.cs da etapa 6.5 deve ser convertido para formato .star. Usando o PyEM23, converta o arquivo particles_exported.cs para o formato .star executando o seguinte comando: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. No RELION-3, clique na guia Escolha manual e na guia I/O , insira os micrografos do refinamento CTF descritos na etapa 6.4. Na guia Exibir , insira os seguintes parâmetros: Diâmetro das partículas (A): 220, Filtro Lowpass (A): -1 , Escala para imagem CTF: 0,5. Corra o trabalho. Um diretório chamado ManualPick é gerado na pasta doméstica RELION-3.
    NOTA: Esta etapa é realizada para criar uma estrutura manual de pasta de colheita no RELION-3. Durante a execução da coleta manual, um único arquivo .star contendo coordenadas de partículas colhidas é criado para cada micrografo médio usado para colher na GUI RELION-3.
  8. Navegue até a pasta contendo o arquivo particles_exported.star da etapa 6.6 e execute um script escrito em casa produzindo um único arquivo manualpick.star para cada micrografo mediano usado para a colheita de partículas crio-SPARC v3, o que contribuiu para a classificação 2D final exportada na etapa 6.5. Os arquivos de coordenadas resultantes são salvos na pasta ManualPick/Movies.
  9. Retorne ao RELION-3 e reasse o trabalho de Escolha Manual . Clique em Continuar. Isso exibirá partículas previamente colhidas no crioSPARC v3 na GUI RELION-3. Inspecione alguns micrografos para verificar se a transferência de coordenadas de partículas foi realizada e se as partículas estão devidamente selecionadas.

7. RELION-3 - Extração de partículas e classificação 2D

  1. Clique em Extração de Partículas. Na guia I/O , insira os micrografos corrigidos pelo CTF a partir da etapa 6.4 e coordenadas da etapa 6.9. Clique na guia Extrato e altere o Tamanho da Caixa de Partículas (pix) para 300. Corra o trabalho.
  2. Realize a classificação 2D para limpar ainda mais o conjunto de partículas gerado no crioSPARC v3 para obter uma reconstrução de maior resolução. Clique na Classificação 2D e na guia I/O , insira o arquivo particles.star gerado na etapa 7.1. Na guia Otimização , defina o número de classes para 50 e o diâmetro da máscara (A) para 280. Corra o trabalho.
    NOTA: A máscara deve abranger toda a partícula.
  3. Para escolher as melhores classes 2D, clique no método Subset Selection , insira o arquivo _model.star a partir da etapa 7.2 e execute o trabalho. Selecione as classes descritas na etapa 4.2.
  4. Repita as etapas 7.2 e 7.3 para remover partículas não convergentes.

8. RECORÊ-3 - Refinamento 3D, criação de máscaras e pós-processamento

  1. Use o mapa gerado no crioSPARC v3 (etapa 5.2) como modelo inicial para refinamento 3D no RELION-3. Selecione o método De importação e defina os seguintes parâmetros na guia I/O : Importe filmes brutos/micrografos: Não, Arquivos de Entrada Bruta: Filmes/*.mrc.
  2. Forneça o arquivo MTF e insira os parâmetros de aquisição do filme conforme descrito na etapa 1.3. Na guia Outros , selecione o mapa cryoSPARC v3 como o arquivo de entrada, altere o Tipo de nó para referência 3D (.mrc) e execute o trabalho.
  3. Selecione 3D Auto-Refine e na guia I/O , defina Imagens de Entrada como o arquivo particles.star da etapa 7.3 ou do último trabalho de seleção. Dê a reconstrução crioSPARC v3 como mapa de referência. Clique na guia Referência e altere o filtro inicial low-pass (Å) para 50 e Simetria para icosaedral. Na guia Otimização , altere o diâmetro da máscara (Å) para 280 e execute o trabalho.
  4. Após o término da corrida, abra run_class001.mrc na UCSF Quimera.
  5. Na Quimera UCSF, clique em Ferramentas e em Dados de Volume, selecione Visualizador de volume. Isso abrirá uma nova janela para ajustar as configurações de volume. Altere o Passo para 1 e ajuste o controle deslizante até atingir o valor de nível onde o mapa não tem ruído. Registo este valor, pois ele será usado para a criação de máscaras na próxima etapa.
  6. O mapa produzido a partir do refinamento automático não reflete o verdadeiro FSC, pois o ruído do solvente circundante reduz a resolução. Antes do pós-processamento, crie uma máscara para distinguir o espécime da região do solvente.
    1. Clique em Criação de máscaras e entrada run_class001.mrc a partir da etapa 8.3.
    2. Clique na aba Máscara e ajuste os parâmetros da seguinte forma: Lowpass Filter Map (Å): 10, Pixel Size (Å): 1.045, Limiar inicial de binarização: o valor de nível obtido na etapa 8.5, Estender Mapa Binário estes muitos Pixels: 3, e Adicionar uma Borda Macia destes muitos Pixel: 3. Executar o trabalho.
  7. Examine a máscara na Quimera ucsf. Se a máscara estiver muito apertada, aumente o Mapa Binário de Extensão com muitos Pixel e/ou Adicione uma borda macia desses muitos Pixels. É importante criar uma máscara com bordas macias, pois uma máscara afiada pode levar a um ajuste excessivo.
  8. Clique em Pós-Processamento e na guia I/O, insira os meio-mapas criados na etapa 8.3 e mascara a partir de 8.6. Ajuste o Tamanho do Pixel Calibrado para 1.045 Å. Na guia Nitidez, insira o seguinte: Estimar o fator B automaticamente?: Sim, Menor Resolução para Ajuste Auto-B (A): 10, Use seu próprio fator B?: Não. Na guia Filtro, defina Pular Fsc-Weighting?

9. RELION-3 - Treinamento de polimento e polimento de partículas

  1. Antes de corrigir o movimento induzido pelo feixe de partículas por peça, primeiro use o modo de treinamento para identificar as faixas de movimento ideais para o conjunto de dados. Abra o polimento bayesiano e na guia I/O , insira os micrografos corrigidos por movimento a partir da etapa 6.3, partículas da etapa 8.3 e arquivo pós-processo .star da etapa 8.8. Clique na guia Treinamento e defina os seguintes parâmetros: Treine parâmetros ideais: Sim, Fração de Pixels Fourier para testes: 0.5, Use estas muitas Partículas: 5000. Corra o trabalho.
    NOTA: Este script produzirá opt_params_all_groups.txt arquivo na pasta polonesa RELION-3 contendo parâmetros de polimento otimizados necessários para executar a seguinte etapa.
  2. Uma vez terminado o trabalho de treinamento, clique no polimento bayesiano. Clique na guia Treinamento e defina Parâmetros Ótimos do Trem? Selecione a guia Polonesa e no Arquivo parâmetro otimizado e especifique o caminho para o arquivo opt_params_all_groups.txt da etapa 9.1. Clique em Executar.
  3. Repita o refinamento 3D (etapa 8.3) e pós-processamento (etapa 8.8) com um conjunto de partículas polidas.

10. RELION-3 - Refinamentos CTF e perpeculação

  1. Para estimar aberrações de ordem mais alta, abra o Refinamento CTF e, na guia I/O em Partículas, selecione o caminho para o arquivo .star contendo partículas polidas do recente trabalho 3D do Refine (run_data.star).
    1. Em PostprocessAr Star File, defina o caminho para a saída do trabalho pós-processamento mais recente (etapa 9.3).
    2. Selecione a guia Fit e defina os seguintes parâmetros: Estimativa (Ampliação Anisotropic): Não, Realize o Encaixe do Parâmetro CTF? Não, estimativa de feixe: Sim, também estimar Trefoil? Sim, estimar abberações de 4ª Ordem? Sim. Corra o trabalho.
  2. Repita o passo 10.1 usando como partículas de entrada (do Refine3D) geradas no trabalho anterior (particles_ctf_refine.star). Na guia Fit , altere Estimativa (Ampliação Anisotrópico) para Sim e Execute o trabalho.
  3. Repita o passo 10.2 usando como partículas de entrada (do Refine3D) produzidas no trabalho anterior (particles_ctf_refine.star). Na guia Fit , defina os seguintes parâmetros: Estimativa (Ampliação Anisotropic): Não, Realize o Encaixe do Parâmetro CTF?: Sim, Fit Defocus?: Partícula per-partícula, Fit Astigmatismo? Por micrografo, Fator B de ajuste?: Não, Ajuste de Fase-Shift: Não, Estimativa de Feixe?: Não, Estimar Aberrações de 4ª Ordem?: Não. Executá-lo .
    NOTA: Dado que a partícula tem contraste suficiente, a guia Fit Astigmatism? pode ser definida como Per-partícula. Para este conjunto de dados, o refinamento de astigmatismo per partícula não melhorou a qualidade e a resolução do mapa.
  4. Repita o refinamento 3D com as partículas da etapa 10.3 e na guia I/O, defina FSCs achatados por solventes? Quando terminar de executar, execute um trabalho pós-processamento (etapa 8.8) e examine o mapa na Quimera UCSF (passo 5.2).

11. Transferir coordenadas de partículas RELION-3 e mapa 3D para Scipion 3

  1. Para refinar e validar ainda mais o mapa RELION-3, primeiro importe o volume e as partículas do último trabalho pós-processamento (etapa 10.4) para OCipion 3. Inicie o Scipion 3 e crie um novo projeto.
  2. No painel Protocolos esquerdos , selecione a queda das importações e clique em Partículas de Importação. Alterar os seguintes parâmetros: Importação de: RELION-3, Arquivo Estelar: postprocess.star e especificar parâmetros de aquisição como na etapa 1.3. Clique em Executar.
  3. Clique na lista de importações e selecione Volumes de Importação. Sob importação de dar o caminho para o mapa RELION-3. Alterar o tamanho do pixel (taxa de amostragem) Å/px para 1.045 e Executar.

12. Scipion 3 - Refinamento de alta resolução

  1. Primeiro, realize um alinhamento global. Selecione a lista desistência do Refine no painel Protocolos e clique em Xmipp3 - highres24. Insira as partículas e volumes importados das etapas 11.2 e 11.3 como Imagens em Tamanho Real e Volumes Iniciais, respectivamente e defina o Grupo Simetria como icosaedral. Na guia Alinhamento de imagem em Atribuição Angular, escolha Global e defina a Resolução de Alvo Máxima para 3 Å e execute o trabalho.
  2. Quando o trabalho estiver concluído, clique em Analisar resultados. Na nova janela, clique no ícone UCSF Quimera para examinar o volume refinado. Além disso, clique em 'Gráficos de Resolução de exibição'(FSC) para ver como o FSC mudou após o refinamento, bem como plote histograma com alterações angulares para ver se as atribuições de ângulo de Euler foram alteradas.
    NOTA: Dependendo da resolução da estrutura relion-3 de entrada, esta etapa pode ser repetida várias vezes com valores diferentes definidos para a Resolução de Alvos Máximos na guia Atribuição Angular . Para obter mais informações, consulte o tutorial Scipion25.
  3. Repita o passo 12.1 com um alinhamento local. Copie o trabalho anterior e altere Select Previous Run para Xmipp3 - highres Global. Na guia Atribuição angular , altere o alinhamento da imagem para local. Defina a Resolução máxima de metas para 2.1 Å.
  4. Examine o mapa refinado na Quimera UCSF e analise a mudança no FSC e atribuições angulares (etapa 12.2). Repita o refinamento local até que a resolução não melhore e as atribuições angulares tenham convergido, ajustando a Resolução de Alvos Máximas conforme necessário.
  5. O mapa de saída do Scipion 3 pode ser modificado e aguçado em Phenix26.

13. Scipion 3 - Validação do mapa

  1. Examine a resolução local do mapa final gerado em Xmipp3 - highres. Abra Xmipp - MonoRes27 local e insira o volume final do trabalho anterior e máscara gerada na etapa 8.6. Definir faixa de resolução de 1 a 6 Å com intervalo de 0,1 Å e Executar o trabalho.
  2. Quando terminar de executar, clique em Analisar resultados e examine a resolução de histogramas e fatias de volume coloridas por resolução.
  3. Para ver se as partículas estão bem alinhadas, abra a Capacidade de Alinhamento multirreferencial28 e insira as partículas e o volume da etapa 12.3. Clique em Analisar resultados para exibir o plot de validação. Idealmente, todos os pontos devem ser agrupados em torno de (1,0,1,0).
  4. Abra Xmipp3 - Valide o Overfitting. Insira as partículas e volumes da etapa 12.3. Quando terminar de rodar, analise os resultados e inspecione o gráfico de overfiting. A travessia do ruído gaussiano alinhado e das curvas de partículas alinhadas indica o excesso de adaptação.

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Representative Results

Apresentamos um pipeline SPA abrangente para obter uma estrutura de alta resolução usando três plataformas de processamento diferentes: crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. As figuras 1 e figura 4 resumem o fluxo de trabalho geral de processamento e a Tabela 1 detalha os protocolos de refinamento. Estes protocolos foram usados durante refinamentos de uma estrutura de 2,3 Å de AAV, alcançando perto da resolução nyquist.

Os filmes foram primeiramente importados para crioSPARC v3 e posteriormente corrigidos por movimento e CTF para gerar micrografias médias. Ao selecionar micrografos para posterior processamento, é importante escolher aqueles com um bom ctf-fit e baixo astigmatismo (Figura 2), pois incluir micrografias de má qualidade pode dificultar estágios de processamento posteriores, resultando em uma reconstrução de menor resolução. 27.364 partículas foram então colhidas e extraídas dos micrografos selecionados. Como o diâmetro do AAV é de aproximadamente 220 Å e o tamanho do pixel é de 1.045 Å, uma caixa tamanho de 300 px foi usada. Em seguida, a classificação 2D iterativa foi usada para remover artefatos e partículas que não convergiram para classes estáveis. Exemplos de médias de classes 2D selecionadas e excluídas são apresentados na Figura 3. Também é importante notar que as médias de classe que refletem diferentes conformações da amostra devem ser refinadas separadamente para produzir múltiplas reconstruções 3D. Nesse caso, devem ser calculados volumes iniciais múltiplos do ab initio . Aqui, 26.741 partículas foram selecionadas e utilizadas para modelagem ab initio e refinamento homogêneo de uma única estrutura de 2,9 Å.

Após a transferência de coordenadas de partículas colhidas em crioSPARC v3 para RELION-3, realizamos quatro rodadas adicionais de classificação 2D até que o conjunto de dados convergisse para classes 2D estáveis. A classificação 2D acima descrita removeu 3.154 partículas adicionais do conjunto de dados. Utilizando a estrutura gerada no crioSPARC v3 como modelo inicial, o refinamento 3D no RELION-3 produziu uma estrutura com resolução quase equivalente de 2,95 Å. Os refinamentos estruturais subsequentes, que incluíam correção de movimento de partículas e refinamentos CTF, aumentaram a resolução para 2,61 Å. A lista completa de refinamentos que realizamos está apresentada na Tabela 1. O volume calculado em RELION-3 foi então refinado no Scipion 3 usando várias rodadas de refinamento de alta resolução (Xmipp3 - highres). Durante as rodadas subsequentes de refinamento, foram removidas 3.186 partículas adicionais do conjunto de dados, resultando em um conjunto final de 20.401 partículas, o que produziu uma reconstrução de 2,3 Å de AAV (Figura 5 e Figura 6). Assim, dado o tamanho do pixel de 1.045 Å, nossos refinamentos quase atingiram o limite de Nyquist. As curvas FSC que representam estruturas calculadas utilizando cada programa são mostradas na Figura 6. Essas curvas FSC indicam o aumento da resolução ao longo do fluxo de trabalho. Como a resolução pode variar de ponto para ponto no mapa, muitas vezes é mais apropriado apresentar a distribuição das estimativas de resolução local no mapa, em vez de relatar uma estimativa de resolução única de acordo com um único critério (por exemplo, critério de 0,143) da curva FSC. Assim, realizamos tal análise utilizando Xmipp - MonoRes em Scipion 3. A Figura 7 mostra uma comparação das estimativas de resolução local para mapas obtidos com crioSPARC v3 e Scipion 3. Estimativas de resolução em quatro fatias diferentes através das estruturas (Figura 7A,B) e histogramas de resolução (Figura 7C) demonstram claramente a melhoria incremental na resolução local entre os mapas ao longo do fluxo de trabalho. A curva FSC calculada usando o programa Xmipp3 - highres em Scipion 3 indica que o limite de Nyquist foi atingido (Figura 6), sugerindo que a estimativa de resolução é muito provavelmente limitada por subsampling29. No entanto, a análise monores apresentada na Figura 7C, juntamente com uma análise cuidadosa do mapa EM e do ajuste do mapa com coordenadas atômicas de AAV (Figura 5) sugerem que uma estimativa de resolução mais adequada para o mapa é de 2,3 Å. Uma estratégia semelhante conciliando as estimativas de resolução FSC e MonoRes foram apresentadas anteriormente 24,25. Como as estimativas de resolução podem ser influenciadas pela máscara usada durante as etapas de refinamento, é importante garantir que a máscara não exclua qualquer parte da densidade. A máscara utilizada neste estudo sobreposta às reconstruções 3D é apresentada na Figura 7D. O aumento gradual da resolução no fluxo de trabalho apresentado destaca a vantagem de utilizar algoritmos de vários pacotes de software SPA para alcançar uma reconstrução 3D de alta qualidade e alta resolução.

A construção do modelo in situ ou a montagem do mapa com um modelo atômico pré-existente podem servir como verificação de qualidade para a estrutura calculada. Visualizamos o mapa final na UCSF Quimera e encaixamos o mapa com um modelo atômico publicado anteriormente (PDB ID: 7kfr)30. A Figura 5 mostra regiões do mapa crio-EM equipadas com coordenadas atômicas de AAV. As densidades EM bem definidas permitem a montagem de cadeias laterais de aminoácidos individuais, moléculas de água e íons de magnésio e confirmam a concordância do mapa crio-EM com o modelo atômico.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho COMPLETO DE SPA através do crioSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 e Phenix 1.18. As etapas concluídas em crioSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 e Phenix 1.18 são denotadas com caixas roxas, laranjas, verdes e cinzas, respectivamente. O tempo necessário para a conclusão de cada etapa usando o servidor de processamento equipado com 8 GPUs, 40 CPUs e 750 GB de RAM é especificado em cada caixa individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Foram utilizados micrografos para processamento a jusante em crioSPARC v3. (A) Micrografias com anéis Thon estimados e experimentais bem combinados foram utilizados para posterior processamento, enquanto aqueles com alta astigmatismo e ajuste ruim (B) foram descartados. Micrografos com ajuste ctf acima de 5 Å, astigmatismo acima de 400 Å, e espessura relativa de gelo abaixo de 2 foram removidos de mais processamento, ou seja, 70/395 micrografos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Selecionando classes 2D. São selecionadas médias de classe 2D contendo classes bem definidas (A), e aquelas com partículas de baixa resolução, ruído e parcial são rejeitadas (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Fluxo de trabalho e resultados representativos para processamento de AAV em crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. As etapas concluídas em crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 são denotadas com setas roxas, laranjas e verdes, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Estrutura de alta resolução do AAV mostra densidades EM bem definidas representando diferentes elementos de estrutura secundária e cadeias laterais de aminoácidos individuais. (A) Um mapa final de AAV. (B) Uma parte do mapa representando folhas beta equipadas com coordenadas atômicas de AAV (PDB ID: 7kfr)30. (C) Densidades de mapas representando aminoácidos individuais. Da esquerda para a direita: arginina, fenilalanina e triptofano. (D) Características de alta resolução do mapa incluem moléculas de água apresentadas em íons vermelhos e de magnésio apresentados como esferas verdes. O íon mg2+ exibido na figura é coordenado por resíduos de histidina (esquerda) e arginina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: As curvas FSC do cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 mostram uma resolução crescente em todo o fluxo de trabalho. Embora a curva FSC calculada utilizando o programa Xmipp3 - highres em Scipion 3 indique que o limite de Nyquist foi atingido, sugerindo que a estimativa de resolução é limitada por subamostramento29, uma análise mais adequada da resolução do mapa é apresentada na Figura 7 e discutida na seção resultados representativos24,25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Validando a reconstrução final em Scipion 3 usando Xmipp - MonoRes. A resolução do mapa é melhor descrita apresentando distribuições de resolução local em vez de uma estimativa de resolução única de acordo com um único critério da curva FSC. (A-B) Os painéis A e B mostram diferentes fatias dos mapas gerados em crioSPARC v3 e Scipion 3, respectivamente. (C) Histogramas demonstrando um aumento sistemático na resolução local para mapas calculados em crioSPARC v3 (barras cor-de-rosa) e Scipion 3 (barras azuis). (D) A máscara (cinza) utilizada para cálculos de resolução local contém todas as partes das densidades de AAV refinadas em ambos os programas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Programa Tipo de refinamento Roteiro
crioSPARC v3 Refinamento Homogêneo Refinamento Homogêneo
Refinamento não uniforme Refinamento não uniforme
Refinamento Heterogêneo Refinamento Heterogêneo
Correção de movimento de partículas-perpétuo Correção de movimento local
RELION-3 Refinamento 3D Refine3D
Pós-processamento - Sharpening de fator B, Correção de MTF Refine3D
Polimento de partículas Polimento bayesiano
Refinamento CTF - inclinação do feixe CtfRefine
Refinamento CTF - ampliação anisotropica CtfRefine
Refinamento CTF - desfoco de partículas perpartículas, astigmatismo de partícula/micrografo CtfRefine
Correção de curvatura da esfera de Ewald Relion_reconstruct
Scipion 3 Refinamento de alta resolução Xmipp3 - highres
Phenix 1.18 Modificação e afiação de densidade ResolveCryoEM

Tabela 1: Refinamentos implementados ao longo do fluxo de trabalho. Se certos refinamentos são aplicáveis a um projeto específico depende da qualidade dos dados e parâmetros de aquisição. Por exemplo, a correção de curvatura da esfera de Ewald pode ser aplicada para mapas que já possuem alta resolução.

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Discussion

Neste artigo, apresentamos um fluxo de trabalho ROBUSTO spa para processamento de dados crio-EM em várias plataformas de software para alcançar reconstruções 3D de alta resolução (Figura 1). Este fluxo de trabalho é aplicável a uma grande variedade de macromoléculas biológicas. As etapas subsequentes do protocolo estão descritas na Figura 4, incluindo pré-processamento de filmes, coleta e classificação de partículas e múltiplos métodos para refinamentos de estrutura (Tabela 1) e validação. Foram apresentadas etapas de processamento em crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, bem como métodos de transferência de dados entre os pacotes de software. Mostramos as estruturas intermediárias obtidas ao longo do protocolo com resolução crescente (Figura 4, Figura 6 e Figura 7).

Embora os métodos descritos neste manuscrito possam ser usados para a determinação da estrutura de diferentes proteínas e conjuntos biológicos, é importante notar que a AAV é um candidato ideal para a determinação da estrutura de alta resolução por crio-EM e SPA, uma vez que seu grande tamanho produz alto contraste no microscópio e a simetria icosaedral produz partículas com redundância de subunidade de 60 vezes. A obtenção de reconstruções de alta resolução torna-se cada vez mais difícil para amostras pequenas (ou seja, menos de 100 kD), dinâmicas e heterogêneas. Para executar com sucesso este protocolo, é fundamental que muitos filmes de alta qualidade sejam coletados para processamento. Com dados brutos de má qualidade, não é possível obter uma reconstrução de alta resolução e alta qualidade. Por exemplo, se a espessura do gelo não for ideal para a determinação da estrutura ou se as partículas aderirem à interface de água gelada ou apresentarem orientações preferenciais, revisite as condições de congelamento da grade.

Outro passo importante no fluxo de trabalho é a colheita e extração de partículas. Durante a coleta de partículas, o tamanho da caixa deve ser aproximadamente 1,4-2,5 vezes maior do que o eixo mais longo da partícula, uma vez que o tamanho suficiente da caixa é necessário para capturar informações de alta resolução espalhadas devido ao desfoco. Tamanhos de caixa maiores, no entanto, requerem tempos de processamento mais longos devido ao aumento do tamanho dos arquivos gerados durante a extração de partículas. Ao escolher o tamanho de uma caixa, considere o diâmetro das partículas e o tamanho do pixel. Com muitas partículas, o usuário pode querer bin partículas durante a extração para processamento inicial e, em seguida, re-extrair partículas de tamanho total para refinamentos finais. Este protocolo usa a coleta manual de partículas para gerar modelos para seleção automática. No entanto, o crioSPARC v3 também oferece métodos de colheita totalmente automatizados, incluindo um seletor baseado em bolhas e um invólucro Topaz, que utiliza aprendizado profundo para selecionar partículas com base em picaretas anteriores. Embora esses algoritmos sejam muito robustos, um número significativo de escolhas precisaria ser removido posteriormente pela classificação 2D e 3D.

As etapas críticas também incluem classificação 2D e 3D usada para remover artefatos, como partículas danificadas por radiação e separar diferentes formas estruturais da amostra presente na amostra, respectivamente. O número de classes 2D definidas pelo usuário deve depender do número de partículas extraídas de micrografias, contraste e heterogeneidade no espécime, pois o objetivo é separar cada visão individual da partícula em uma classe 2D separada. Como regra geral, adicione uma classe 2D para cada 100 partículas, e se processar uma nova amostra com um grande número de partículas, 100 classes é um bom ponto de partida. Se uma resolução baixa ou moderada for obtida mesmo após muitas rodadas de classificação 2D e 3D, tente re-extrair partículas com um tamanho maior da caixa para ver se mais informações estruturais podem ser obtidas. Ao relatar a resolução da reconstrução final, deve-se analisar a curva FSC obtida de acordo com o método padrão-ouro, juntamente com as estimativas de resolução local e a inspeção cuidadosa das densidades do mapa, bem como seu acordo com o modelo atômico.

Para refinamentos das estruturas do vírus, a correção de curvatura da esfera de Ewald implementada no RELION-3 demonstrou melhorias em alta resolução31. Se as estruturas de refino de complexos multiproteínas dinâmicos, experimente o refinamento multi-corpo 3D implementado em relion-3 ou classificação focada com subtração de imagem implementada em RELION-3 e crioSPARC v3. Se a heterogeneidade não pode ser resolvida computacionalmente, é necessário revisitar as condições de preparação da amostra32. Pureza insuficiente ou preparação inadequada resultando em degradação proteica dificultará a qualidade da reconstrução 3D. Além disso, condições tampão que desestabilizam proteínas ou promovem a agregação limitam severamente o número de partículas bem definidas que podem ser usadas para o cálculo da estrutura. Assim, para utilizar de forma mais eficaz os métodos aqui apresentados, é imprescindível identificar condições ideais para a estabilidade amostral. Recomendamos microscopia eletrônica com manchas negativas para rastrear as amostras antes do crio-EM.

Como o crio-EM tornou-se o método preferido para a determinação da estrutura 3D para um número crescente de biólogos estruturais, a necessidade de um fluxo de trabalho integrativo e robusto para o processamento de imagens e determinação da estrutura torna-se mais evidente. O CryoSPARC oferece uma interface de usuário gráfico (GUI) baseada na Web de fácil uso que permite aos usuários de todos os níveis de experiência processar rapidamente dados e calcular uma estrutura 3D. Notavelmente, o CryoSPARC utiliza uma descida gradiente estocástica para realizar a reconstrução 3D ab initio. Além disso, o software emprega um algoritmo de otimização de probabilidades ramificadas para refinamento rápido de mapa 3D7. O pipeline de processamento descrito neste artigo usa o crioSPARC v3 para produzir um mapa 3D inicial. A reconstrução 3D é então refinada no RELION-3, um pacote popular que usa uma abordagem empírica bayesiana para estimar parâmetros críticos com base no conjunto de dados do usuário, reduzindo assim a necessidade de conhecimento especializado para a operação do programa10. Especificamente, utilizamos o polimento bayesiano para correção de movimento por partícula e refinamentos CTF para melhorar a resolução. Finalmente, a estrutura resultante é ainda mais refinada e validada no Scipion 311, uma concha Python integrativa que suporta algoritmos de múltiplas plataformas, incluindo Xmipp13, EMAN28, SPIDER12, entre outras. Embora muitos pacotes de software diferentes estejam disponíveis para usuários crio-EM, atualmente não há nenhuma plataforma SPA universal aceita pelo campo. Embora o fluxo de trabalho spa possa ser totalmente executado em qualquer um dos três pacotes de software descritos neste artigo, diferentes algoritmos podem produzir resultados variados. Consequentemente, as etapas individuais devem ser personalizadas dependendo da amostra e da qualidade dos dados. Por exemplo, para o conjunto de dados atual, o 3Drefine no RELION-3 aumentou a resolução da reconstrução 3D, enquanto o refinamento não uniforme no crioSPARC v3 levou a uma ligeira redução da resolução. Assim, é muito benéfico utilizar uma variedade de programas para recalcular estruturas para alcançar a qualidade e resolução ideal e facilitar a validação das reconstruções. Embora, o Scipion 3 contenha inúmeros algoritmos do cryoSPARC v3 e RELION-3, as implementações mais recentes desses programas não estão disponíveis imediatamente no Scipion. Por exemplo, dos programas utilizados neste manuscrito, apenas o RELION-3 oferece a Correção de Curvatura da Esfera de Ewald através do script Relion_reconstruct. O pipeline apresentado neste artigo fornece um guia para usuários novos e experientes usarem com sucesso algoritmos implementados em crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para calcular estruturas 3D em resolução quase atômica.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Carlos Oscar Sorzano pela ajuda na instalação do Scipion3 e kilian Schnelle e Arne Moeller por ajuda na transferência de dados entre diferentes plataformas de processamento. Parte desta pesquisa foi apoiada pela bolsa NIH U24GM129547 e realizada na PNCC da OHSU e acessada através da EMSL (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental. Este estudo foi apoiado por uma bolsa inicial da Universidade Rutgers para Arek Kulczyk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

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References

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