Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

Denne artikkelen beskriver hvordan du effektivt bruker tre cryo-EM-prosesseringsplattformer, det vil si cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3, for å lage en enkelt og robust arbeidsflyt som gjelder for en rekke enkeltpartikkeldatasett for høyoppløselig strukturbestemmelse.

Abstract

Nylige fremskritt innen både instrumenterings- og bildebehandlingsprogramvare har gjort enpartikkel cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) til den foretrukne metoden for strukturbiologer for å bestemme høyoppløselige strukturer av et bredt utvalg av makromolekyler. Flere programvarepakker er tilgjengelige for nye og ekspertbrukere for bildebehandling og strukturberegning, noe som effektiviserer den samme grunnleggende arbeidsflyten: filmer anskaffet av mikroskopdetektorene gjennomgår korreksjon for stråleindusert bevegelses- og kontrastoverføringsfunksjon (CTF) estimering. Deretter velges og trekkes partikkelbilder ut fra gjennomsnittlige filmrammer for iterativ 2D- og 3D-klassifisering, etterfulgt av 3D-rekonstruksjon, presisering og validering. Fordi ulike programvarepakker bruker forskjellige algoritmer og krever forskjellige kompetansenivåer for å fungere, varierer 3D-kartene de genererer ofte i kvalitet og oppløsning. Dermed overfører brukere regelmessig data mellom en rekke programmer for optimale resultater. Dette dokumentet inneholder en veiledning for brukere om å navigere i en arbeidsflyt på tvers av de populære programvarepakkene: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for å få en nesten atomisk oppløsningsstruktur for det adeno-tilknyttede viruset (AAV). Vi detaljerer først en bildebehandlingspipeline med cryoSPARC v3, da dens effektive algoritmer og brukervennlige GUI lar brukerne raskt komme til et 3D-kart. I neste trinn bruker vi PyEM og interne skript for å konvertere og overføre partikkelkoordinater fra 3D-rekonstruksjon av beste kvalitet oppnådd i kryoSPARC v3 til RELION-3 og Scipion 3 og omberegne 3D-kart. Til slutt skisserer vi trinn for videre forbedring og validering av de resulterende strukturene ved å integrere algoritmer fra RELION-3 og Scipion 3. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du effektivt bruker tre behandlingsplattformer for å opprette en enkelt og robust arbeidsflyt som gjelder for en rekke datasett for høyoppløselig strukturbestemmelse.

Introduction

Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) og enkeltpartikkelanalyse (SPA) muliggjør strukturbestemmelse av et bredt utvalg av biomolekylære forsamlinger i deres hydrerte tilstand, og bidrar til å belyse rollene til disse makromolekylene i atomdetaljer. Forbedringer i mikroskopoptikk, maskinvare og bildebehandlingsprogramvare har gjort det mulig å bestemme strukturer av biomolekyler ved oppløsning som strekker seg utover 2 Å1,2,3. Mer enn 2300 kryo-EM-strukturer ble deponert i Protein Data Bank (PDB) i 2020, sammenlignet med 192 strukturer i 20144, noe som indikerer at kryo-EM har blitt den valgte metoden for mange strukturelle biologer. Her beskriver vi en arbeidsflyt som kombinerer tre forskjellige SPA-programmer for høyoppløselig strukturbestemmelse (figur 1).

Målet med SPA er å rekonstruere 3D-volumer av en målprøve fra støyende 2D-bilder tatt opp av en mikroskopdetektor. Detektorer samler bilder som filmer med individuelle rammer av samme synsfelt. For å bevare prøven samles rammer med en lav elektrondose og har dermed et dårlig signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg kan elektroneksponering indusere bevegelse i de vitrifiserte kryo-EM-rutenettene, noe som resulterer i uskarphet i bildet. For å løse disse problemene er rammene justert for å korrigere for stråleindusert bevegelse og i gjennomsnitt for å gi en mikrograf med økt SNR. Disse mikrografene gjennomgår deretter CTF-estimering (Contrast Transfer Function) for å redegjøre for effekten av defokus og avvik pålagt av mikroskopet. Fra CTF-korrigerte mikrografer velges, ekstraheres og sorteres individuelle partikler i 2D-klassegjennomsnitt som representerer forskjellige orienteringer vedtatt av prøven i glassaktig is. Det resulterende homogene settet av partikler brukes som inngang for ab initio 3D-rekonstruksjon for å generere en grov modell eller modeller, som deretter er iterativt raffinert for å produsere en eller flere høyoppløselige strukturer. Etter rekonstruksjon utføres strukturelle raffinementer for å forbedre kvaliteten og oppløsningen til cryo-EM-kartet ytterligere. Til slutt er enten en atommodell direkte avledet fra kartet, eller kartet er utstyrt med atomkoordinater oppnådd andre steder.

Ulike programvarepakker er tilgjengelige for å utføre oppgavene som er beskrevet ovenfor, inkludert Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 og andre. Mens disse programmene følger lignende behandlingstrinn, bruker de forskjellige algoritmer, for eksempel for å plukke partikler, generere innledende modeller og finjustere rekonstruksjoner. I tillegg krever disse programmene et varierende nivå av brukerkunnskap og intervensjon for å fungere, da noen er avhengige av finjustering av parametere som kan fungere som et hinder for nye brukere. Disse avvikene resulterer ofte i kart med inkonsekvent kvalitet og oppløsning på tvers av plattformer14, noe som får mange forskere til å bruke flere programvarepakker for å avgrense og validere resultater. I denne artikkelen fremhever vi bruken av kryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for å oppnå en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon av AAV, en mye brukt vektor for genterapi15. De nevnte programvarepakkene er gratis for akademiske brukere; cryoSPARC v3 og Scipion 3 krever lisenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opprette et nytt kryoSPARC v3-prosjekt og importere data

MERK: Data ble anskaffet ved Oregon Health and Science University (OHSU) i Portland ved hjelp av et 300 kV Titan Krios elektronmikroskop utstyrt med en Falcon 3 direkte elektrondetektor. Bilder ble samlet inn i tellemodus med en total dose på 28,38 e−/Å2 brøkdelet over 129 bilder, og et defokusområde fra -0,5 μm til -2,5 μm, med en pikselstørrelse på 1,045 Å ved hjelp av EPU. Prøven av AAV-DJ ble levert av personalet på OHSU.

  1. Åpne cryoSPARC v3 i en nettleser, og klikk på Prosjekter-overskriften . Velg + Legg til for å opprette et nytt prosjekt. Gi prosjektet en tittel tilsvarende, og angi en bane til en eksisterende mappe der jobber og data skal lagres.
  2. Opprett et arbeidsområde for prosjektet ved å åpne prosjektet, klikke + Legge til og velge Nytt arbeidsområde. Gi arbeidsområdet et tittel, og klikk Opprett.
  3. Gå til det nye arbeidsområdet, og åpne jobbverktøyet i panelet til høyre. Denne kategorien viser alle funksjoner som er tilgjengelige i cryoSPARC v3. Klikk på Importer filmer og oppgi filmbanen, få referansefilbane og angi anskaffelsesparametere som følger: Raw Pixel Size 1.045 Å, Akselererende spenning 300 kV, Sfærisk avvik 2,7 mm, Total eksponeringsdose 28.38 e-/Å^2.
  4. Klikk kø, velg et kjørefelt for å kjøre jobben og et arbeidsområde, og klikk på Opprett.
    MERK: Anskaffelsesparametrene er prøve- og mikroskopavhengige.

2. CryoSPARC v3 - filmjustering og CTF-estimering

  1. Åpne Patch Motion Correction (Multi). Denne jobben krever filmene som ble importert i trinn 1.3, som inndata. Åpne jobbkortet for import av filmer i arbeidsområdet, og dra Imported_movies utdata til filmplassholderen i den nye jobben. Legg jobben i kø.
    MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om cryoSPARC-metodene som er beskrevet i denne artikkelen, kan du se kryoSPARC-opplæringen16.
  2. Hvis du vil utføre CTF-estimering, åpner du Patch CTF Estimation (Multi). Skriv inn mikrografene som ble generert i trinn 2.1, og Legg jobben i kø .
  3. Hvis du vil inspisere de gjennomsnittlige og CTF-korrigerte mikrografene og velge et delsett for videre behandling, åpner du Kurater eksponeringer og skriver inn eksponeringene som ble oppnådd i trinn 2.2. Legg jobben i kø.
  4. Når jobben har gått inn i ventemodus , klikker du på fanebladet Samhandling på jobbkortet, justerer parameterterskler og godtar eller avviser individuelle mikrografer for videre behandling. Godta mikrografer med godt matchede estimerte og eksperimentelle CTFer (figur 2) og kast de med høy astigmatisme, dårlig CTF-passform og tykk is.
  5. Under behandling av dagens data, sett den øvre terskelen for astigmatisme til 400 Å, CTF-passformoppløsning til 5 Å og relativ istykkelse til 2. Klikk på Ferdig for å velge mikrografene for nedstrømsbehandling.

3. CryoSPARC v3 - manuell og malbasert partikkelplukking

  1. Åpne Manuell velger, skriv inn de godkjente eksponeringene fra trinn 2.4-2.5, og legg jobben i kø . Klikk på Interaktiv-fanen , sett Box Size (px) til 300, og klikk på noen hundre partikler over flere mikrografer og unngå å velge overlappende partikler. Her ble 340 partikler over 29 mikrografer valgt ut. Når du er ferdig, klikker du på Ferdig plukking! Trekk ut partikler.
    MERK: Denne protokollen bruker manuell partikkelplukking til å generere maler for automatisk valg. Andre metoder er imidlertid også tilgjengelige17.
  2. For å generere maler for automatisert partikkelplukking, klikk på 2D-klassifisering og skriv inn partikkelvalgene generert i trinn 3.1. Endre antall 2D-klasser til 10 og Legg jobben i kø .
  3. Åpne Velg 2D-klasser. Skriv inn partiklene og klassegjennomsnittene oppnådd i trinn 3.2 og klikk på Interaktiv-fanen . Velg representative 2D-klasser med god SNR og klikk på Ferdig.
    MERK: Klassegjennomsnittet gjenspeiler forskjellige partikkelvisninger. Velg klassegjennomsnitt som gjenspeiler hver visning. Målet er å produsere veldefinerte maler som representerer ulike visninger av prøven for automatisert plukking.
  4. Åpne Malvelger , og skriv inn 2D-klassene som er valgt i trinn 3.3, og mikrografer fra trinn 2.4-2.5. Sett partikkeldiameteren (Å) til 220 Å og legg jobben i kø .
  5. Hvis du vil kontrollere de automatiserte valgene, åpner du Velg partikkelvalg, legger inn partiklene og mikrografene som genereres i trinn 3.4, og legger jobben i kø .
  6. På jobbkortet Velg partikkelvalg klikker du kategorien Interaktiv og setter boksstørrelsen (px) til 300. Klikk på en individuell mikrograf, juster lowpass-filteret til partiklene er tydelig synlige, og sett terskelverdien normalisert krysskorrelasjon (NCC) til 0,41 og strømterskel mellom 54000 og 227300 .
  7. Inspiser flere mikrografer og juster om nødvendig terskler slik at de fleste partikler velges uten å inkludere falske positiver. Når du er ferdig, klikker du på Ferdig plukking! Trekk ut partikler.
    MERK: Ekte partikler har vanligvis en høy NCC- og effektscore, noe som indikerer at de ligner på malen og har en høy SNR, henholdsvis.
  8. Åpne ekstrakt fra mikrografer og skriv inn mikrografer og partikler fra trinn 3.7. Sett størrelsen på uttrukket boks (px) til 300, og legg jobben i kø.

4. CryoSPARC v3 - 2D-klassifisering

  1. Klikk på 2D-klassifisering og skriv inn de ekstraherte partiklene fra trinn 3.8. Sett antall 2D-klasser til 50 og Legg jobben i kø .
  2. Hvis du vil velge de beste 2D-klassene for videre behandling, åpner du Velg 2D-klasser. Angi partiklene og klassegjennomsnittene oppnådd i trinn 4.1. Klikk på Interaktiv-fanen og velg 2D-klasser basert på oppløsningen og antall partikler i klassen (figur 3). Ikke merk klasser som inneholder artefakter. Etter å ha valgt, klikk på Ferdig.
    MERK: Vanligvis kreves flere runder med 2D-klassifisering for å fjerne partikler, som ikke konvergerer i distinkte, veldefinerte klasser. Kjør så mange runder med 2D-klassifisering som nødvendig for å fjerne slike partikler fra datasettet (figur 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio rekonstruksjon og homogen raffinement

  1. For å generere et innledende 3D-volum, åpne Ab-initio Rekonstruksjon og skriv inn partiklene oppnådd i trinn 4.2 eller fra den endelige 2D-klassifiseringen. Juster symmetrien til icosahedral. Legg jobben i kø.
    MERK: Symmetri er prøveavhengig og bør endres tilsvarende. Hvis ukjent, bruk C1-symmetri.
  2. Åpne homogen presisering. Skriv inn volumet fra trinn 5.1 og partikler fra 4.2 eller den endelige 2D-klassifiseringen. Endre symmetrien og legg jobben i kø . Når jobben er fullført, kontrollerer du Fourier Shell Correlation (FSC)-kurven og laster ned volumet for å undersøke i UCSF Chimera18.

6. Eksportere partikkelkoordinater fra cryoSPARC v3 og importere dem til RELION-3 ved hjelp av PyEM

MERK: Partikkelkoordinater har informasjon om plasseringen av individuelle partikler i hver mikrograf. Overføring av koordinater i stedet for partikkelstakker til RELION-3 gjør det mulig å kjøre raffineringstrinn som ellers ikke ville være tilgjengelige. Partikkelpolering krever for eksempel tilgang til innledende filmrammer. Før du eksporterer partikkelkoordinater fra kryoSPARC v3 til RELION-3, importerer du filmer og utfører bevegelseskorrigering og CTF-estimering i RELION-3. Se RELION-3 tutorial19 for mer informasjon.

  1. Naviger til RELION-3 prosjektkatalogen og start RELION-3.
  2. Åpne Importer fra jobbtypeleseren, og angi banen til filmene og anskaffelsesparameterne som i trinn 1.3.
  3. Hvis du vil utføre bevegelseskorrigering, bruker du UCSF MotionCor220 via RELION-3 GUI, åpner Motion Correction og angir standardparametrene som i UCSF MotionCor2 manual21. Skriv inn banen til filmene som ble importert i trinn 6.2. I kategorien Bevegelse angir du banen til den kjørbare filen Motioncor2.
    MERK: MotionCor2 kan kjøres parallelt med flere GPU-er.
  4. Utfør CTF-estimering ved hjelp av CTFFIND-4.122 gjennom RELION-3 GUI. Åpne CTF Estimering og skriv inn micrographs.star generert i trinn 6.3. I kategorien CTFFIND-4.1 angir du banen til den kjørbare CTFFIND-4.1-filen og angir parametere som i RELION-3.1-opplæringen19.
  5. For å importere partikkelstakker fra kryoSPARC v3 til RELION-3, må de først eksporteres fra kryoSPARC v3. I cryoSPARC v3 åpner du jobbkortet for select 2D-klassejobben fra trinn 4.2 eller den endelige 2D-klassifiseringen. Klikk Eksporter jobb på Detaljer-fanen. Eksportjobben sender particles_exported.cs fil.
  6. Før du importerer partikkelkoordinater fra kryoSPARC v3 til RELION-3, må particles_exported.cs-filen fra trinn 6.5 konverteres til .star-format. Bruk PyEM23 til å konvertere particles_exported.cs-filen til STJERNE-format ved å utføre følgende kommando: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. I RELION-3 klikker du kategorien Manuell plukking , og i kategorien I/U skriver du inn mikrografene fra CTF-raffinering som er beskrevet i trinn 6.4. I kategorien Skjerm skriver du inn følgende parametere: Partikkeldiameter (A): 220, Lowpass Filter (A): -1 , Skala for CTF-bilde: 0,5. Kjør jobben. En katalog kalt ManualPick genereres i RELION-3-startmappen.
    MERK: Dette trinnet utføres for å opprette en manuell plukkmappestruktur i RELION-3. Når du kjører manuell plukking, opprettes en enkelt .star-fil som inneholder koordinater av plukkede partikler for hver gjennomsnittlige mikrograf som brukes til å plukke i RELION-3 GUI.
  8. Naviger til mappen som inneholder particles_exported.star-filen fra trinn 6.6, og kjør et hjemmeskrevet skript som produserer en enkelt manualpick.star-fil for hver gjennomsnittlige mikrograf som brukes til å plukke kryo-SPARC v3-partikler, noe som bidro til den endelige 2D-klassifiseringen eksportert i trinn 6.5. De resulterende koordinatfilene lagres i mappen ManualPick/Movies.
  9. Gå tilbake til RELION-3, og åpne den manuelle plukkjobben på nytt. Klikk på Fortsett. Dette vil vise partikler som tidligere er plukket i cryoSPARC v3 i RELION-3 GUI. Inspiser noen mikrografer for å bekrefte om overføringen av partikkelkoordinater er oppnådd og om partikler er riktig valgt.

7. RELION-3 - Partikkelekstraksjon og 2D-klassifisering

  1. Klikk på Partikkeluttrekking. I kategorien I/U skriver du inn CTF-korrigerte mikrografer fra trinn 6.4 og koordinater fra trinn 6.9. Klikk på Ekstrakt-fanen og endre partikkelboksstørrelsen (pix) til 300. Kjør jobben.
  2. Utfør 2D-klassifisering for å rengjøre partikkelsettet som genereres i cryoSPARC v3 ytterligere for å oppnå en rekonstruksjon med høyere oppløsning. Klikk på 2D-klassifisering , og skriv inn particles.star-filen som ble generert i trinn 7.1, i kategorien I/U . I kategorien Optimalisering setter du Antall klasser til 50 og Maskediameter (A) til 280. Kjør jobben.
    MERK: Masken skal omfatte hele partikkelen.
  3. Hvis du vil velge de beste 2D-klassene, klikker du delsettvalgmetoden , skriver inn filen _model.star fra trinn 7.2 og kjører jobben. Velg klasser som beskrevet i trinn 4.2.
  4. Gjenta trinn 7.2 og 7.3 for å fjerne ikke-konvergerende partikler.

8. RELION-3 - 3D-raffinement, maskeoppretting og etterbehandling

  1. Bruk kartet som genereres i cryoSPARC v3 (trinn 5.2) som en innledende modell for 3D-raffinement i RELION-3. Velg Importer-metoden , og angi følgende parametere i kategorien I/U : Importer raw-filmer/-mikrografer: Nei, Raw-inndatafiler: Filmer/*.mrc.
  2. Angi MTF-filen og skriv inn filmanskaffelsesparametrene som beskrevet i trinn 1.3. I kategorien Andre velger du cryoSPARC v3-kartet som inndatafil, endrer Nodetype til 3D-referanse (MRC) og Kjører jobben.
  3. Velg 3D Auto-Refine , og i kategorien I/U angir du Inndatabilder som particles.star-filen fra trinn 7.3 eller den siste valgjobben. Gi cryoSPARC v3-rekonstruksjonen som referansekart. Klikk på Referanse-fanen og endre Initial Low-Pass-filteret (Å) til 50 og Symmetry til icosahedral. I kategorien Optimalisering endrer du maskediameteren (Å) til 280 og kjører jobben.
  4. Etter at løpet er ferdig, åpner du run_class001.mrc i UCSF Chimera.
  5. I UCSF Chimera klikker du på Verktøy og under Volumdata velger du Volume Viewer. Dette åpner et nytt vindu for å justere voluminnstillingene. Endre trinnet til 1, og juster glidebryteren til den når nivåverdien der kartet ikke har støy. Registrer denne verdien, slik den vil bli brukt til maskeoppretting i neste trinn.
  6. Kartet som produseres fra automatisk raffinement gjenspeiler ikke den sanne FSC, da støy fra det omkringliggende løsningsmidlet senker oppløsningen. Før etterbehandling, lag en maske for å skille prøven fra løsningsmiddelområdet.
    1. Klikk på Mask Creation og input run_class001.mrc fra trinn 8.3.
    2. Klikk på Maske-fanen og juster parametere som følger: Lowpass Filter Map (Å): 10, Pixel Size (Å): 1.045, Initial Binarization Threshold: level value obtained step 8.5, Extend Binary Map this many Pixels: 3, and Add a Soft-Edge of this many Pixels: 3. Kjør jobben.
  7. Undersøk masken i UCSF Chimera. Hvis masken er for stram, øker du Utvid binærkart så mange piksler og/eller Legg til en myk kant av så mange bildepunkter. Det er viktig å lage en maske med myke kanter, da en skarp maske kan føre til overmontering.
  8. Klikk på Etterbehandling og skriv inn halvkartene som ble opprettet i trinn 8.3 og maske fra 8.6 på I/U-fanen. Sett kalibrert pikselstørrelse til 1,045 Å. I kategorien Gjør skarpere skriver du inn følgende: Beregn B-faktor automatisk?: Ja, Laveste oppløsning for automatisk B-tilpasning (A): 10, Bruk din egen B-faktor?: Nei. I kategorien Filter setter du Hopp over Fsc-vekting? til Nei.

9. RELION-3 - Polering trening og partikkel polering

  1. Før du korrigerer for bevegelse indusert per partikkelstråle, må du først bruke treningsmodusen til å identifisere optimale bevegelsesspor for datasettet. Åpne Bayesiansk polering , og skriv inn de bevegelseskorrigerte mikrografene fra trinn 6.3 i kategorien I/U , fra trinn 8.3 og postprosessert STJERNE-fil fra trinn 8.8. Klikk kategorien Trening og angi følgende parametere: Tren optimale parametere: Ja, Brøkdel av Fourier Pixels for Testing: 0.5, Bruk så mange partikler: 5000. Kjør jobben.
    MERK: Dette skriptet vil produsere opt_params_all_groups.txt fil i den polske RELION-3-mappen som inneholder optimaliserte poleringsparametere som kreves for å utføre følgende trinn.
  2. Når treningsjobben er ferdig, klikker du på Bayesian Polishing. Klikk på Trening-fanen og sett Train Optimal Parameters? Velg kategorien Polsk , og angi banen til den opt_params_all_groups.txt filen fra trinn 9.1 i optimalisert parameterfil . Klikk på Kjør.
  3. Gjenta 3D-raffinement (trinn 8.3) og etterbehandling (trinn 8.8) med et sett med polerte partikler.

10. RELION-3 - CTF og per partikkel raffinementer

  1. Hvis du vil beregne avvik i høyere rekkefølge, åpner du CTF Refinement og velger banen til STAR-filen som inneholder polerte partikler fra den nylige Finjuster 3D-jobben (run_data.star) i kategorien I/ U under Partikler.
    1. Under Stjernefil etter behandling angir du banen til utdataene fra den siste etterbehandlingsjobben (trinn 9.3).
    2. Velg kategorien Tilpass og angi følgende parametere: Estimat (Anisotropisk forstørrelse): Nei, Utfør CTF-parametertilpasning? Nei, beregn Beamtilt: Ja, også estimere Trefoil? Ja, anslå fjerde ordens abberasjoner? Ja. Kjør jobben.
  2. Gjenta trinn 10.1 ved hjelp av som inngangspartikler (fra Refine3D) generert i forrige jobb (particles_ctf_refine.star). I kategorien Tilpass endrer du Estimat (Anisotropic Forstørrelse) til Ja og Kjør jobben.
  3. Gjenta trinn 10.2 ved hjelp av som inngangspartikler (fra Refine3D) produsert i forrige jobb (particles_ctf_refine.star). I kategorien Tilpass angir du følgende parametere: Estimat (anisotrop forstørrelse): Nei, Utfør CTF-parametertilpasning?: Ja, Tilpass defokus?: Perpartikkel, Tilpass astigmatisme? Per mikrograf, Fit B-faktor?: Nei, Tilpass faseskift: Nei, Beregn Beamtilt?: Nei, Beregn fjerde ordre avvik?: Nei. Kjør den.
    MERK: Gitt at partikkelen har tilstrekkelig kontrast, kan Fit Astigmatism? For dette datasettet forbedret per-partikkel astigmatisme raffinement ikke kvaliteten og oppløsningen på kartet.
  4. Gjenta 3D-raffinement med partiklene fra trinn 10.3, og sett Bruk løsemiddel-flate FSC-er i kategorien I/U? Når du er ferdig med å kjøre, utfører du en etterbehandlingsjobb (trinn 8.8) og undersøker kartet i UCSF Chimera (trinn 5.2).

11. Overføring av RELION-3 partikkelkoordinater og 3D-kart til Scipion 3

  1. Hvis du vil finjustere og validere RELION-3-kartet ytterligere, må du først importere volumet og partiklene fra den siste etterbehandlingsjobben (trinn 10.4) til Scipion 3. Start Scipion 3 og opprett et nytt prosjekt.
  2. Velg rullegardinlisten Importer på venstre protokollpanel, og klikk på Importer partikler. Endre følgende parametere: Importer fra: RELION-3, Star File: postprocess.star, og angi anskaffelsesparametere som i trinn 1.3. Klikk på Utfør.
  3. Klikk på Importer-rullegardinmenyen og velg Importer volumer. Under Importer fra gir du banen til RELION-3-kartet. Endre pikselstørrelse (samplingsfrekvens) Å/px til 1,045 og utfør.

12. Scipion 3 - Høy - oppløsning raffinement

  1. Først utfører du en global justering. Velg Rullegardinmenyen Finjuster i Protokoller-panelet og klikk på Xmipp3 - highres24. Angi de importerte partiklene og volumene fra henholdsvis trinn 11.2 og 11.3 som bilder i full størrelse og startvolumer, og sett Symmetry Group til icosahedral. Velg Global under Vinkeltilordning på Bildejustering-fanen, og sett Maksimal måloppløsning til 3 Å, og kjør jobben.
  2. Når jobben er ferdig, klikker du på Analyser resultater. I det nye vinduet klikker du på UCSF Chimera-ikonet for å undersøke det raffinerte volumet. I tillegg klikker du på Display Resolution Plots (FSC) for å se hvordan FSC har endret seg etter raffinementet, samt Plott histogram med vinkelendringer for å se om Euler-vinkeltilordningene har endret seg.
    MERK: Avhengig av oppløsningen til RELION-3-strukturen for inndata, kan dette trinnet gjentas flere ganger med forskjellige verdier angitt for Maksimal måloppløsning under kategorien Vinkeltilordning . Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se Scipion tutorial25.
  3. Gjenta trinn 12.1 med lokal justering. Kopier den forrige jobben, og endre Velg forrige kjøring til Xmipp3 - highres Global. Endre Bildejustering til Lokal i kategorien Vinkeltilordning. Sett maksimal måloppløsning til 2.1 Å.
  4. Undersøk det raffinerte kartet i UCSF Chimera og analyser endringen i FSC og vinkeloppgaver (trinn 12.2). Gjenta lokal presisering til oppløsningen ikke forbedres og vinkeltilordningene er konvergert, og juster maksimal måloppløsning etter behov.
  5. Utgangskartet fra Scipion 3 kan i tillegg tetthetsmodifiseres og skjerpes i Phenix26.

13. Scipion 3 - Kartvalidering

  1. Undersøk den lokale oppløsningen til det endelige kartet generert i Xmipp3 - highres. Åpne Xmipp - lokale MonoRes27 og skriv inn det endelige volumet fra forrige jobb og maske generert i trinn 8.6. Sett Oppløsningsområde fra 1 til 6 Å med et 0,1 Å-intervall og Utfør jobben.
  2. Når du er ferdig med å kjøre, klikker du på Analyser resultater og undersøker oppløsningen histogram og volumstykker farget av oppløsning.
  3. Hvis du vil se om partiklene er godt justert, åpner du Multireference Alignability28 og legger inn partiklene og volumet fra trinn 12.3. Klikk Analyser resultater for å vise valideringstegningen. Ideelt sett bør alle punkter grupperes rundt (1.0,1.0).
  4. Åpne Xmipp3 - Valider overmontering. Angi partiklene og volumene fra trinn 12.3. Når du er ferdig med å kjøre, analyserer du resultatene og inspiserer overmonteringsplottet. Kryssing av justert gaussisk støy og justerte partikler kurver indikerer overfitting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har presentert en omfattende SPA-rørledning for å oppnå en høyoppløselig struktur ved hjelp av tre forskjellige prosesseringsplattformer: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3. Figur 1 og figur 4 oppsummerer den generelle behandlingsarbeidsflyten, og tabell 1 beskriver presiseringsprotokoller. Disse protokollene ble brukt under forbedringer av en 2,3 Å-struktur av AAV, og oppnådde nær Nyquist-oppløsning.

Filmer ble først importert til cryoSPARC v3 og deretter bevegelses- og CTF-korrigert for å generere gjennomsnittlige mikrografer. Når du velger mikrografer for videre behandling, er det viktig å velge de med god CTF-passform og lav astigmatisme (figur 2), da det å inkludere mikrografer av dårlig kvalitet kan hindre senere behandlingsstadier, noe som resulterer i en rekonstruksjon av lavere oppløsning. 27 364 partikler ble deretter plukket ut og ekstrahert fra de valgte mikrografene. Fordi diameteren på AAV er ca. 220 Å og pikselstørrelsen er 1,045 Å, ble det brukt en boksstørrelse på 300 piksler. Deretter ble iterativ 2D-klassifisering brukt til å fjerne artefakter og partikler som ikke konvergerer til stabile klasser. Eksempler på utvalgte og ekskluderte gjennomsnitt for 2D-klasser er presentert i figur 3. Det er også viktig å merke seg at klassegjennomsnitt som reflekterer forskjellige konformasjoner av prøven, bør raffineres separat for å gi flere 3D-rekonstruksjoner. I et slikt tilfelle bør flere ab initio startvolumer beregnes. Her ble 26.741 partikler valgt ut og brukt til ab initio modellering og homogen raffinement av en enkelt 2,9 Å struktur.

Etter å ha overført koordinater av partikler plukket i kryoSPARC v3 til RELION-3, gjennomførte vi fire ekstra runder med 2D-klassifisering til datasettet konvergerte til stabile 2D-klasser. Den ovenfor beskrevne 2D-klassifiseringen fjernet ytterligere 3154 partikler fra datasettet. Ved hjelp av strukturen generert i cryoSPARC v3 som en innledende modell, produserte 3D-raffinement i RELION-3 en struktur med en nesten tilsvarende oppløsning på 2,95 Å. Påfølgende strukturelle forbedringer, som inkluderte krysspartikkelbevegelseskorreksjon og CTF-raffinementer, økte oppløsningen til 2,61 Å. En komplett liste over forbedringer vi utførte presenteres i tabell 1. Volumet beregnet i RELION-3 ble deretter ytterligere raffinert i Scipion 3 ved hjelp av flere runder med høyoppløselig raffinement (Xmipp3 - highres). Under påfølgende runder med raffinement ble ytterligere 3186 partikler fjernet fra datasettet, noe som resulterte i et endelig sett med 20 401 partikler, som produserte en 2,3 Å-rekonstruksjon av AAV (figur 5 og figur 6). Gitt pikselstørrelsen på 1.045 Å har våre raffinementer nesten nådd Nyquist-grensen. FSC-kurver som representerer strukturer beregnet ved hjelp av hvert program, vises i figur 6. Disse FSC-kurvene angir oppløsningsøkningen gjennom hele arbeidsflyten. Fordi oppløsningen kan variere fra punkt til punkt i kartet, er det ofte mer hensiktsmessig å presentere fordelingen av lokale løsningsestimater i kartet i stedet for å rapportere et enkelt oppløsningsestimat i henhold til et enkelt kriterium (f.eks. 0,143 kriterium) fra FSC-kurven. Dermed utførte vi en slik analyse ved hjelp av Xmipp - MonoRes i Scipion 3. Figur 7 viser en sammenligning av lokale oppløsningsestimater for kart oppnådd med kryoSPARC v3 og Scipion 3. Oppløsningsestimater ved fire forskjellige stykker gjennom strukturene (figur 7A,B) og oppløsnings histogrammer (figur 7C) viser tydelig den trinnvise forbedringen i lokal oppløsning mellom kartene gjennom hele arbeidsflyten. FSC-kurven beregnet ved hjelp av programmet Xmipp3 - highres i Scipion 3 indikerer at Nyquist-grensen er nådd (figur 6), noe som tyder på at oppløsningsestimatet sannsynligvis er begrenset av undersampling29. MonoRes analyse presentert i figur 7C, sammen med en nøye analyse av EM-kartet og kartbeslag med atomkoordinater av AAV (figur 5) tyder imidlertid på at et mer tilstrekkelig oppløsningsestimat for kartet er 2,3 Å. En lignende strategi for å forene FSC- og MonoRes-oppløsningsestimatene er presentert tidligere24,25. Siden oppløsningsestimater kan påvirkes av masken som brukes under presiseringstrinn, er det viktig å sikre at masken ikke utelukker noen del av tettheten. Masken som brukes i denne studien overlappet med 3D-rekonstruksjonene er presentert i figur 7D. Den gradvise økningen i oppløsningen i den presenterte arbeidsflyten fremhever fordelen ved å bruke algoritmer fra flere SPA-programvarepakker for å oppnå en 3D-rekonstruksjon av høy kvalitet og høy oppløsning.

In-situ modellbygging eller montering av kartet med en eksisterende atommodell kan tjene som kvalitetssjekk for den beregnede strukturen. Vi har visualisert det endelige kartet i UCSF Chimera og montert kartet med en tidligere publisert atommodell (PDB ID: 7kfr)30. Figur 5 viser regioner på cryo-EM-kartet utstyrt med atomkoordinater av AAV. Veldefinerte EM-tettheter tillater montering av sidekjeder av individuelle aminosyrer, vannmolekyler og magnesiumioner og bekrefter avtalen om kryo-EM-kartet med atommodellen.

Figure 1
Figur 1: Fullfør SPA-arbeidsflyten på tvers av cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 og Phenix 1.18. Trinn fullført i kryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 og Phenix 1.18 er betegnet med henholdsvis lilla, oransje, grønne og grå bokser. Tiden som kreves for fullføring av hvert trinn ved hjelp av behandlingsserveren utstyrt med 8 GPU-er, 40 CPUer og 750 GB RAM er angitt i hver enkelt boks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Valg av mikrografer for nedstrøms prosessering i kryoSPARC v3. (A) Mikrografer med godt matchede estimerte og eksperimentelle Thon-ringer ble brukt til videre behandling, mens de med høy astigmatisme og dårlig passform (B) ble kassert. Mikrografer med CTF-passform over 5 Å, astigmatisme over 400 Å og relativ istykkelse under 2 ble fjernet fra videre prosessering, det vil si 70/395 mikrografer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Velge 2D-klasser. 2D-klassegjennomsnitt som inneholder veldefinerte klasser velges (A), og de med lav oppløsning, støy og delvise partikler avvises (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Arbeidsflyt og representative resultater for AAV-behandling på tvers av kryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3. Trinn som er fullført i kryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3, er betegnet med henholdsvis lilla, oransje og grønne piler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Høyoppløselig struktur av AAV viser veldefinerte EM-tettheter som representerer forskjellige sekundære strukturelementer og individuelle aminosyre sidekjeder. (A) Et endelig kart over AAV. (B) En del av kartet som representerer betaplater utstyrt med atomkoordinater av AAV (PDB ID: 7kfr)30. (C) Karttettheter som representerer individuelle aminosyrer. Fra venstre til høyre: arginin, fenylalanin og tryptofan. (D) Høyoppløselige egenskaper på kartet inkluderer vannmolekyler presentert i røde og magnesiumioner presentert som grønne sfærer. Mg2+ ion som vises i figuren koordineres av histidin (venstre) og argininrester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: FSC-kurver fra cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 viser økende oppløsning på tvers av arbeidsflyten. Mens FSC-kurven beregnet ved hjelp av programmet Xmipp3 - highres i Scipion 3 indikerer at Nyquist-grensen er nådd, noe som tyder på at oppløsningsestimatet er begrenset av undersampling29, presenteres en mer tilstrekkelig analyse av kartoppløsningen i figur 7 og diskuteres i representantresultatene § 24,25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Validere den endelige rekonstruksjonen i Scipion 3 ved hjelp av Xmipp - MonoRes. Kartoppløsningen beskrives bedre ved å presentere lokale oppløsningsdistribusjoner i stedet for ett enkelt oppløsningsestimat i henhold til ett enkelt kriterium fra FSC-kurven. (A-B) Panelene A og B viser forskjellige stykker fra kart generert i henholdsvis cryoSPARC v3 og Scipion 3. (C) Histogrammer som viser en systematisk økning i lokal oppløsning for kart beregnet i kryoSPARC v3 (rosa stenger) og Scipion 3 (blå stenger). (D) Masken (grå) som brukes til lokale oppløsningsberegninger, inneholder alle deler av AAV-tetthetene som er raffinert i begge programmene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Program Presiseringstype Skript
kryoSPARC v3 Homogen presisering Homogen presisering
Ikke-ensartet presisering Ikke-enhetlig presisering
Heterogen presisering Heterogen presisering
Korrigering av bevegelse per partikkel Korrigering av lokal bevegelse
RELION-3 3D-presisering Finjuster3D
Etterbehandling - B-faktor skarphet, MTF-korreksjon Finjuster3D
Partikkelpolering Bayesiansk polering
CTF raffinement - bjelke vippe CtfRefine
CTF-raffinement - anisotrop forstørrelse CtfRefine
CTF-raffinement - per partikkeldefokus, per partikkel/mikrograf astigmatisme CtfRefine
Ewald sfære krumningskorreksjon Relion_reconstruct
Scipion 3 Høy oppløsningsforbedring Xmipp3 - høyder
Fenix 1,18 Endring og skarphet for tetthet LøsCryoEM

Tabell 1: Forbedringer implementert i hele arbeidsflyten. Hvorvidt visse forbedringer gjelder for et bestemt prosjekt, avhenger av datakvalitet og anskaffelsesparametere. For eksempel kan Ewald-sfæren krumningskorreksjon brukes på kart som allerede har høy oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen presenterer vi en robust SPA-arbeidsflyt for kryo-EM-databehandling på tvers av ulike programvareplattformer for å oppnå høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner (figur 1). Denne arbeidsflyten gjelder for en rekke biologiske makromolekyler. De påfølgende trinnene i protokollen er beskrevet i figur 4, inkludert forhåndsbehandling av filmer, partikkelplukking og klassifisering, og flere metoder for strukturforbedringer (tabell 1) og validering. Behandlingstrinn i cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 er presentert, samt metoder for overføring av data mellom programvarepakkene. Vi har vist de mellomliggende strukturene som er oppnådd gjennom hele protokollen med økende oppløsning (figur 4, figur 6 og figur 7).

Mens metodene som er skissert i dette manuskriptet kan brukes til strukturbestemmelse av forskjellige proteiner og biologiske forsamlinger, er det viktig å merke seg at AAV er en ideell kandidat for høyoppløselig strukturbestemmelse ved kryo-EM og SPA, da den store størrelsen gir høy kontrast i mikroskopet og icosahedralsymmetri gir partikler med 60 ganger subenhetsredundans. Det blir stadig vanskeligere å få rekonstruksjoner med høy oppløsning for små (dvs. mindre enn 100 kD), dynamiske og heterogene prøver. For å kunne utføre denne protokollen, er det viktig at mange filmer av høy kvalitet samles inn for behandling. Med rådata av dårlig kvalitet er det ikke mulig å få en høyoppløselig og høy kvalitet rekonstruksjon. For eksempel, hvis istykkelsen ikke er optimal for strukturbestemmelse, eller hvis partikler holder seg til isvannsgrensesnittet eller viser foretrukne orienteringer, kan du gå tilbake til iskalde forhold i rutenettet.

Et annet viktig trinn i arbeidsflyten er partikkelplukking og ekstraksjon. Under partikkelplukking bør boksstørrelsen være omtrent 1,4-2,5 ganger større enn partikkelens lengste akse, da det kreves tilstrekkelig boksstørrelse for å fange opp informasjon med høy oppløsning spredt ut på grunn av defokus. Større boksstørrelser krever imidlertid lengre behandlingstid på grunn av den økte størrelsen på filer som genereres under partikkelutvinning. Når du velger en boksstørrelse, bør du vurdere partikkeldiameter og pikselstørrelse. Med mange partikler kan det være lurt å kaste partikler under ekstraksjon for første behandling og deretter trekke ut partikler i full størrelse for endelige raffinementer. Denne protokollen bruker manuell partikkelplukking til å generere maler for automatisk valg. Imidlertid tilbyr cryoSPARC v3 også helautomatiske plukkmetoder, inkludert en blob-basert plukker og en Topaz-innpakning, som bruker dyp læring for å velge partikler basert på tidligere valg. Selv om disse algoritmene er svært robuste, må et betydelig antall valg senere fjernes av 2D- og 3D-klassifisering.

Kritiske trinn inkluderer også 2D- og 3D-klassifisering som brukes til å fjerne artefakter, for eksempel strålingsskadede partikler og skille forskjellige strukturelle former for prøven som finnes i prøven. Antall 2D-klasser satt av brukeren bør avhenge av antall partikler ekstrahert fra mikrografer, kontrast og heterogenitet i prøven, da målet er å skille hver enkelt visning av partikkelen i en egen 2D-klasse. Som en generell regel, legg til en 2D-klasse for hver 100 partikler, og hvis du behandler en ny prøve med et stort antall partikler, er 100 klasser et godt utgangspunkt. Hvis en lav eller moderat oppløsning oppnås selv etter mange runder med 2D- og 3D-klassifisering, kan du prøve å trekke ut partikler med større boksstørrelse for å se om mer strukturell informasjon kan oppnås. Mens man rapporterer oppløsningen av den endelige rekonstruksjonen, bør man analysere FSC-kurven oppnådd i henhold til gullstandardmetoden, sammen med lokale oppløsningsestimater og nøye inspeksjon av karttetthetene, samt deres avtale med atommodellen.

For forbedringer av virusstrukturene har Ewald-sfærens krumningskorreksjon implementert i RELION-3 vist forbedringer ved høy oppløsning31. Hvis raffinering strukturer av dynamiske multiprotein komplekser, prøv 3D multi-body raffinement implementert i RELION-3 eller fokusert klassifisering med bilde subtraksjon implementert i RELION-3 og cryoSPARC v3. Hvis heterogenitet ikke kan løses beregningsmessig, er det nødvendig å gå tilbake til prøveforberedelsesbetingelsene32. Utilstrekkelig renhet eller utilstrekkelig forberedelse som resulterer i proteinforringelse vil hindre kvaliteten på 3D-rekonstruksjonen. I tillegg begrenser bufferforhold som destabiliserer proteiner eller fremmer aggregering, alvorlig antall veldefinerte partikler som kan brukes til strukturberegning. For å utnytte metodene som presenteres her, er det derfor viktig å identifisere optimale forhold for prøvestabilitet. Vi anbefaler negativt farging elektronmikroskopi for å screene prøvene før kryo-EM.

Etter hvert som cryo-EM har blitt den foretrukne metoden for 3D-strukturbestemmelse for et økende antall strukturbiologer, blir behovet for en integrerende og robust arbeidsflyt for bildebehandling og strukturbestemmelse tydeligere. CryoSPARC tilbyr et brukervennlig, nettbasert grafisk brukergrensesnitt (GUI) som lar brukere på alle erfaringsnivåer raskt behandle data og beregne en 3D-struktur. Spesielt bruker CryoSPARC en stokastisk gradient nedstigning for å utføre ab initio 3D-rekonstruksjon. Videre bruker programvaren en gren og bundet sannsynlighetsoptimaliseringsalgoritme for rask 3D-kartforbedring7. Behandlingsrørledningen som er beskrevet i denne artikkelen, bruker cryoSPARC v3 til å gi et innledende 3D-kart. 3D-rekonstruksjonen blir deretter raffinert i RELION-3, en populær pakke som bruker en empirisk bayesiansk tilnærming for å estimere kritiske parametere basert på brukerens datasett, og dermed redusere behovet for ekspertkunnskap for programdrift10. Spesielt bruker vi bayesiansk polering for korrigering av per partikkelbevegelse og CTF-forbedringer for å forbedre oppløsningen. Til slutt er den resulterende strukturen ytterligere raffinert og validert i Scipion 311, et integrert Python-skall som støtter algoritmer fra flere plattformer, inkludert Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 og andre. Selv om mange forskjellige programvarepakker er tilgjengelige for cryo-EM-brukere, er det for øyeblikket ingen universell SPA-plattform akseptert av feltet. Selv om SPA-arbeidsflyten kan utføres fullstendig i en av de tre programvarepakkene som er beskrevet i denne artikkelen, kan forskjellige algoritmer gi varierende resultater. Følgelig må individuelle trinn tilpasses avhengig av utvalget og kvaliteten på dataene. For det nåværende datasettet økte for eksempel 3Drefine i RELION-3 oppløsningen av 3D-rekonstruksjonen, mens nonuniform raffinement i cryoSPARC v3 førte til en liten oppløsningsreduksjon. Dermed er det svært gunstig å bruke en rekke programmer for å omberegne strukturer for å oppnå optimal kvalitet og oppløsning og for å lette valideringen av rekonstruksjonene. Selv om Scipion 3 inneholder mange algoritmer fra cryoSPARC v3 og RELION-3, er de nyeste implementeringene av disse programmene ikke umiddelbart tilgjengelige i Scipion. For eksempel, av programmene som brukes i dette manuskriptet, tilbyr bare RELION-3 Ewald Sphere Curvature Correction gjennom skriptet Relion_reconstruct. Rørledningen som presenteres i denne artikkelen gir en veiledning for både nye og erfarne brukere å bruke algoritmer implementert i kryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for å beregne 3D-strukturer ved nesten atomisk oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Carlos Oscar Sorzano for hjelp med Scipion3-installasjonen og Kilian Schnelle og Arne Moeller for hjelp med dataoverføring mellom ulike prosessplattformer. En del av denne forskningen ble støttet av NIH grant U24GM129547 og utført ved PNCC ved OHSU og åpnet gjennom EMSL (grid.436923.9), et DOE Office of Science User Facility sponset av Office of Biological and Environmental Research. Denne studien ble støttet av et oppstartsstipend fra Rutgers University til Arek Kulczyk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

Biokjemi Utgave 179 kryo-elektronmikroskopi kryo-EM enkeltpartikkelanalyse SPA kryoSPARC RELION Scipion bildebehandling strukturberegning AAV
En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter