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Biochemistry

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Abstract

Jüngste Fortschritte sowohl in der Instrumentierung als auch in der Bildverarbeitungssoftware haben die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur bevorzugten Methode für Strukturbiologen gemacht, um hochauflösende Strukturen einer Vielzahl von Makromolekülen zu bestimmen. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnung stehen neue und erfahrene Benutzer mehrere Software-Suiten zur Verfügung, die den gleichen grundlegenden Workflow rationalisieren: Filme, die von den Mikroskopdetektoren aufgenommen wurden, werden für die Schätzung der strahleninduzierten Bewegung und der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) korrigiert. Als nächstes werden Partikelbilder ausgewählt und aus gemittelten Filmbildern für die iterative 2D- und 3D-Klassifizierung extrahiert, gefolgt von 3D-Rekonstruktion, Verfeinerung und Validierung. Da verschiedene Softwarepakete unterschiedliche Algorithmen verwenden und unterschiedliche Fachkenntnisse erfordern, unterscheiden sich die von ihnen generierten 3D-Karten häufig in Qualität und Auflösung. So übertragen Benutzer regelmäßig Daten zwischen einer Vielzahl von Programmen für optimale Ergebnisse. Dieses Dokument bietet eine Anleitung für Benutzer zum Navigieren in einem Workflow durch die gängigen Softwarepakete: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, um eine nahezu atomare Auflösungsstruktur des Adeno-assoziierten Virus (AAV) zu erhalten. Wir haben zunächst eine Bildverarbeitungspipeline mit cryoSPARC v3 detailliert beschrieben, da die effizienten Algorithmen und die benutzerfreundliche GUI es den Benutzern ermöglichen, schnell zu einer 3D-Karte zu gelangen. Im nächsten Schritt verwenden wir PyEM und interne Skripte, um Partikelkoordinaten von der besten 3D-Rekonstruktion in cryoSPARC v3 zu RELION-3 und Scipion 3 zu konvertieren und zu übertragen und 3D-Karten neu zu berechnen. Schließlich skizzieren wir Schritte zur weiteren Verfeinerung und Validierung der resultierenden Strukturen durch die Integration von Algorithmen aus RELION-3 und Scipion 3. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie drei Verarbeitungsplattformen effektiv nutzen können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Datensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Introduction

Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglichen die Strukturbestimmung einer Vielzahl von biomolekularen Baugruppen in ihrem hydratisierten Zustand und helfen, die Rolle dieser Makromoleküle im atomaren Detail zu beleuchten. Verbesserungen in der Mikroskopoptik, Computerhardware und Bildverarbeitungssoftware haben es ermöglicht, Strukturen von Biomolekülen mit einer Auflösung von mehr als 2 Å 1,2,3 zu bestimmen. Mehr als 2.300 Kryo-EM-Strukturen wurden 2020 in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegt, verglichen mit 192 Strukturen im Jahr 20144, was darauf hindeutet, dass Kryo-EM für viele Strukturbiologen zur Methode der Wahl geworden ist. Hier beschreiben wir einen Workflow, der drei verschiedene SPA-Programme zur hochauflösenden Strukturfindung kombiniert (Abbildung 1).

Das Ziel von SPA ist es, 3D-Volumina einer Zielprobe aus verrauschten 2D-Bildern zu rekonstruieren, die von einem Mikroskopdetektor aufgenommen wurden. Detektoren sammeln Bilder als Filme mit einzelnen Bildern des gleichen Sichtfeldes. Um die Probe zu erhalten, werden Frames mit einer niedrigen Elektronendosis gesammelt und haben somit ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus kann die Elektronenbelichtung eine Bewegung innerhalb der verglasten Kryo-EM-Gitter induzieren, was zu Bildunschärfe führt. Um diese Probleme zu überwinden, werden die Rahmen so ausgerichtet, dass sie die strahleninduzierte Bewegung korrigieren, und gemittelt, um eine Mikroaufnahme mit einem erhöhten SNR zu erhalten. Diese Mikroaufnahmen werden dann einer CTF-Schätzung (Contrast Transfer Function) unterzogen, um die Auswirkungen von Defokus und Aberrationen, die vom Mikroskop auferlegt werden, zu berücksichtigen. Aus den CTF-korrigierten Mikroaufnahmen werden einzelne Partikel ausgewählt, extrahiert und in 2D-Klassendurchschnitte sortiert, die unterschiedliche Orientierungen der Probe in Glaseis darstellen. Der resultierende homogene Satz von Partikeln wird als Input für die ab initio 3D-Rekonstruktion verwendet, um ein grobes Modell oder Modelle zu erzeugen, die dann iterativ verfeinert werden, um eine oder mehrere hochauflösende Strukturen zu erzeugen. Nach der Rekonstruktion werden strukturelle Verfeinerungen durchgeführt, um die Qualität und Auflösung der Kryo-EM-Karte weiter zu verbessern. Schließlich wird entweder ein Atommodell direkt von der Karte abgeleitet, oder die Karte ist mit atomaren Koordinaten ausgestattet, die an anderer Stelle erhalten wurden.

Verschiedene Softwarepakete sind verfügbar, um die oben beschriebenen Aufgaben zu erfüllen, einschließlich Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 und andere. Während diese Programme ähnlichen Verarbeitungsschritten folgen, verwenden sie verschiedene Algorithmen, um beispielsweise Partikel auszuwählen, anfängliche Modelle zu generieren und Rekonstruktionen zu verfeinern. Darüber hinaus erfordern diese Programme ein unterschiedliches Maß an Benutzerwissen und Eingriffen, da einige von der Feinabstimmung von Parametern abhängen, die als Hürde für neue Benutzer dienen können. Diese Diskrepanzen führen oft zu Karten mit inkonsistenter Qualität und Auflösung auf allen Plattformen14, was viele Forscher dazu veranlasst, mehrere Softwarepakete zu verwenden, um die Ergebnisse zu verfeinern und zu validieren. In diesem Artikel heben wir die Verwendung von cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 hervor, um eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von AAV, einem weit verbreiteten Vektor für die Gentherapie15, zu erhalten. Die oben genannten Softwarepakete sind für akademische Benutzer kostenlos; cryoSPARC v3 und Scipion 3 benötigen Lizenzen.

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Protocol

1. Erstellen eines neuen cryoSPARC v3-Projekts und Importieren von Daten

HINWEIS: Die Daten wurden an der Oregon Health and Science University (OHSU) in Portland mit einem 300-kV-Titan Krios-Elektronenmikroskop erfasst, das mit einem Falcon 3-Direktelektronendetektor ausgestattet ist. Die Bilder wurden in einem Zählmodus mit einer Gesamtdosis von 28,38 e−/Å2 über 129 Frames und einem Defokussierungsbereich von -0,5 μm bis -2,5 μm bei einer Pixelgröße von 1,045 Å unter Verwendung von EPU gesammelt. Das Sample von AAV-DJ wurde von den Mitarbeitern der OHSU zur Verfügung gestellt.

  1. Öffnen Sie cryoSPARC v3 in einem Webbrowser und klicken Sie auf die Kopfzeile Projekte . Wählen Sie + Hinzufügen , um ein neues Projekt zu erstellen. Betiteln Sie das Projekt entsprechend und geben Sie einen Pfad zu einem vorhandenen Verzeichnis an, in dem Aufträge und Daten gespeichert werden.
  2. Erstellen Sie einen Arbeitsbereich für das Projekt, indem Sie das Projekt öffnen, auf + Hinzufügen klicken und Neuer Arbeitsbereich auswählen. Betiteln Sie den Arbeitsbereich und klicken Sie auf Erstellen.
  3. Navigieren Sie zum neuen Arbeitsbereich und öffnen Sie den Job Builder im rechten Bereich. Auf dieser Registerkarte werden alle Funktionen angezeigt, die in cryoSPARC v3 verfügbar sind. Klicken Sie auf Filme importieren und geben Sie den Filmpfad, den Pfad der Verstärkungsreferenzdatei und die Erfassungsparameter wie folgt ein: Rohpixelgröße 1,045 Å, Beschleunigungsspannung 300 kV, Sphärische Aberration 2,7 mm, Gesamtexpositionsdosis 28,38 e-/Å^2.
  4. Klicken Sie auf Warteschlange, wählen Sie eine Lane aus, um den Job und einen Arbeitsbereich auszuführen, und klicken Sie auf Erstellen.
    HINWEIS: Die Erfassungsparameter sind proben- und mikroskopabhängig.

2. CryoSPARC v3 - Filmausrichtung und CTF-Schätzung

  1. Öffnen Sie die Patch-Bewegungskorrektur (Multi). Dieser Auftrag erfordert die in Schritt 1.3 importierten Filme als Eingabe. Öffnen Sie die Auftragskarte zum Importieren von Filmen im Arbeitsbereich und ziehen Sie die Imported_movies Ausgabe auf den Platzhalter Filme des neuen Auftrags. Stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
    HINWEIS: Weitere Informationen zu den in diesem Artikel beschriebenen cryoSPARC-Methoden finden Sie im cryoSPARC-Lernprogramm16.
  2. Um eine CTF-Schätzung durchzuführen, öffnen Sie Patch CTF Estimation (Multi). Geben Sie die in Schritt 2.1 generierten Mikroaufnahmen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
  3. Um die gemittelten und CTF-korrigierten Mikrographen zu untersuchen und eine Teilmenge für die weitere Verarbeitung auszuwählen, öffnen Sie Curate Exposures und geben Sie die in Schritt 2.2 erhaltenen Expositionen ein. Stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
  4. Nachdem der Auftrag in den Wartemodus gewechselt ist, klicken Sie auf der Jobkarte auf die Registerkarte Interaktion , passen Sie die Parameterschwellenwerte an und akzeptieren oder lehnen Sie einzelne Mikroaufnahmen zur weiteren Verarbeitung ab. Akzeptieren Sie Mikroaufnahmen mit gut abgestimmten geschätzten und experimentellen CTFs (Abbildung 2) und verwerfen Sie solche mit hohem Astigmatismus, schlechter CTF-Passform und dickem Eis.
  5. Setzen Sie bei der Verarbeitung der aktuellen Daten die obere Schwelle von Astigmatismus auf 400 Å, die CTF-Anpassungsauflösung auf 5 Å und die relative Eisdicke auf 2. Klicken Sie auf Fertig , um die Mikroaufnahmen für die nachgelagerte Verarbeitung auszuwählen.

3. CryoSPARC v3 - manuelle und vorlagenbasierte Partikelkommissionierung

  1. Öffnen Sie die manuelle Auswahl, geben Sie die akzeptierten Belichtungen aus den Schritten 2.4 bis 2.5 ein, und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Klicken Sie auf die Registerkarte Interaktiv, stellen Sie die Boxgröße (px) auf 300 ein und klicken Sie auf einige hundert Partikel über mehrere Mikroaufnahmen hinweg, um die Auswahl überlappender Partikel zu vermeiden. Hier wurden 340 Partikel in 29 Mikroaufnahmen ausgewählt. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Fertige Auswahl! Partikel extrahieren.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die manuelle Partikelkommissionierung, um Vorlagen für die automatische Auswahl zu generieren. Es stehen jedoch auch andere Methoden zur Verfügung17.
  2. Um Vorlagen für die automatisierte Partikelkommissionierung zu generieren, klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die in Schritt 3.1 generierten Partikelpicks ein. Ändern Sie die Anzahl der 2D-Klassen in 10, und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange .
  3. Öffnen Sie 2D-Klassen auswählen. Geben Sie die in Schritt 3.2 erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein und klicken Sie auf die Registerkarte Interaktiv. Wählen Sie repräsentative 2D-Klassen mit gutem SNR aus und klicken Sie auf Fertig.
    HINWEIS: Die Klassendurchschnitte spiegeln unterschiedliche Partikelansichten wider. Wählen Sie Klassendurchschnitte aus, die jede Ansicht widerspiegeln. Ziel ist es, klar definierte Vorlagen zu erstellen, die verschiedene Ansichten der Probe für die automatisierte Kommissionierung darstellen.
  4. Öffnen Sie die Vorlagenauswahl und geben Sie die in Schritt 3.3 ausgewählten 2D-Klassen sowie die Mikroaufnahmen aus den Schritten 2.4-2.5 ein. Legen Sie den Partikeldurchmesser (å) auf 220 å fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange .
  5. Um die automatisierten Kommissioniervorgänge zu überprüfen, öffnen Sie "Partikelauswahlen auswählen", geben Sie die in Schritt 3.4 generierten Partikel und Mikroaufnahmen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
  6. Klicken Sie auf der Jobkarte Partikelauswahl auswählen auf die Registerkarte Interaktiv und legen Sie die Boxgröße (px) auf 300 fest. Klicken Sie auf eine einzelne Mikroaufnahme, stellen Sie den Tiefpassfilter ein, bis die Partikel deutlich sichtbar sind, und stellen Sie den NCC-Schwellenwert (Normalized Cross Corlation) auf 0,41 und den Leistungsschwellenwert zwischen 54000 und 227300 ein.
  7. Untersuchen Sie mehrere Mikroaufnahmen und passen Sie bei Bedarf die Schwellenwerte so an, dass die meisten Partikel ausgewählt werden, ohne falsche Positive einzubeziehen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Fertige Auswahl! Partikel extrahieren.
    HINWEIS: Echte Partikel haben typischerweise einen hohen NCC- und Leistungswert, was darauf hindeutet, dass sie der Schablone ähnlich sind bzw. einen hohen SNR aufweisen.
  8. Öffnen Sie den Auszug aus den Mikroaufnahmen und geben Sie die Mikroaufnahmen und Partikel aus Schritt 3.7 ein. Legen Sie die Größe des extrahierten Felds (px) auf 300 fest, und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.

4. CryoSPARC v3 - 2D-Klassifizierung

  1. Klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die extrahierten Partikel aus Schritt 3.8 ein. Legen Sie die Anzahl der 2D-Klassen auf 50 fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
  2. Um die besten 2D-Klassen für die weitere Verarbeitung auszuwählen, öffnen Sie 2D-Klassen auswählen. Geben Sie die in Schritt 4.1 erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Interaktiv und wählen Sie 2D-Klassen basierend auf der Auflösung und der Anzahl der Partikel in der Klasse aus (Abbildung 3). Wählen Sie keine Klassen aus, die Artefakte enthalten. Klicken Sie nach der Auswahl auf Fertig.
    HINWEIS: Normalerweise sind mehrere Runden der 2D-Klassifizierung erforderlich, um Partikel zu entfernen, die nicht in verschiedene, genau definierte Klassen konvergieren. Führen Sie so viele Runden der 2D-Klassifizierung wie nötig durch, um solche Partikel aus dem Datensatz zu entfernen (Abbildung 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio Rekonstruktion und homogene Verfeinerung

  1. Um ein anfängliches 3D-Volumen zu erzeugen, öffnen Sie Ab-initio Reconstruction und geben Sie die Partikel ein, die Sie in Schritt 4.2 oder aus der endgültigen 2D-Klassifizierung erhalten haben. Passen Sie die Symmetrie an die Ikosaeder an. Stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
    HINWEIS: Die Symmetrie ist sampleabhängig und sollte entsprechend geändert werden. Wenn unbekannt, verwenden Sie die C1-Symmetrie.
  2. Offene homogene Raffination. Geben Sie das Volumen aus Schritt 5.1 und Partikel aus 4.2 oder die endgültige 2D-Klassifizierung ein. Ändern Sie die Symmetrie und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Wenn der Auftrag abgeschlossen ist, untersuchen Sie die Fourier-Shell-Korrelationskurve (FSC) und laden Sie das Volume herunter, um es in UCSF Chimera18 zu untersuchen.

6. Exportieren von Partikelkoordinaten aus cryoSPARC v3 und Importieren in RELION-3 mit PyEM

HINWEIS: Partikelkoordinaten enthalten Informationen über die Position einzelner Partikel in jeder Mikroaufnahme. Die Übertragung von Koordinaten anstelle von Partikelstapeln an RELION-3 ermöglicht das Ausführen von Verfeinerungsschritten, die sonst nicht verfügbar wären. Zum Beispiel erfordert das Polieren von Partikeln Zugriff auf anfängliche Filmframes. Importieren Sie daher vor dem Exportieren von Partikelkoordinaten aus cryoSPARC v3 nach RELION-3 Filme und führen Sie eine Bewegungskorrektur und CTF-Schätzung in RELION-3 durch. Weitere Informationen finden Sie im RELION-3-Tutorial19.

  1. Navigieren Sie zum RELION-3-Projektverzeichnis und starten Sie RELION-3.
  2. Öffnen Sie Importieren aus dem Auftragstypbrowser, und geben Sie den Pfad zu den Filmen und Erfassungsparametern wie in Schritt 1.3 beschrieben an.
  3. Um eine Bewegungskorrektur durchzuführen, verwenden Sie UCSF MotionCor220 über die RELION-3 GUI, öffnen Sie die Bewegungskorrektur und legen Sie die Standardparameter wie im UCSF MotionCor2 Handbuch21 fest. Geben Sie den Pfad zu den in Schritt 6.2 importierten Filmen ein. Geben Sie auf der Registerkarte Bewegung den Pfad zur ausführbaren Datei motioncor2 an.
    HINWEIS: MotionCor2 kann parallel über mehrere GPUs ausgeführt werden.
  4. Führen Sie die CTF-Schätzung mit CTFFIND-4.122 über die grafische Benutzeroberfläche RELION-3 durch. Öffnen Sie CTF Estimation und geben Sie die in Schritt 6.3 generierten micrographs.star ein. Geben Sie auf der Registerkarte CTFFIND-4.1 den Pfad zur ausführbaren Datei CTFFIND-4.1 an, und legen Sie die Parameter wie im RELION-3.1-Lernprogramm19 fest.
  5. Um Partikelstapel aus cryoSPARC v3 nach RELION-3 zu importieren, müssen diese zunächst aus cryoSPARC v3 exportiert werden. Öffnen Sie in cryoSPARC v3 die Jobkarte des Auftrags "2D-Klasse auswählen " aus Schritt 4.2 oder der endgültigen 2D-Klassifizierung. Klicken Sie auf der Registerkarte Details auf Auftrag exportieren. Job exportieren gibt die particles_exported.cs Datei aus.
  6. Vor dem Importieren von Partikelkoordinaten aus cryoSPARC v3 in RELION-3 muss die particles_exported.cs Datei aus Schritt 6.5 in das .star-Format konvertiert werden. Konvertieren Sie die Datei particles_exported.cs mit PyEM23 in das .star-Format, indem Sie den folgenden Befehl ausführen: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. Klicken Sie in RELION-3 auf die Registerkarte Manuelle Kommissionierung und geben Sie auf der Registerkarte E/A die in Schritt 6.4 beschriebenen Mikroaufnahmen aus der CTF-Verfeinerung ein. Geben Sie auf der Registerkarte Anzeige die folgenden Parameter ein: Partikeldurchmesser (A): 220, Tiefpassfilter (A): -1 , Maßstab für CTF-Bild: 0,5. Führen Sie den Auftrag aus. Ein Verzeichnis namens ManualPick wird im RELION-3 Home-Ordner generiert.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um eine manuelle Kommissionierordnerstruktur in RELION-3 zu erstellen. Während der manuellen Kommissionierung wird eine einzelne .star-Datei mit Koordinaten der ausgewählten Partikel für jede gemittelte Mikroaufnahme erstellt, die für die Kommissionierung in der RELION-3-GUI verwendet wird.
  8. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die Datei particles_exported.star aus Schritt 6.6 enthält, und führen Sie ein selbst geschriebenes Skript aus, das eine einzelne manualpick.star-Datei für jede gemittelte Mikroaufnahme erstellt, die für die Kommissionierung von Kryo-SPARC v3-Partikeln verwendet wird, die zur endgültigen 2D-Klassifizierung beigetragen hat, die in Schritt 6.5 exportiert wurde. Die resultierenden Koordinatendateien werden im Ordner ManualPick/Movies gespeichert.
  9. Kehren Sie zu RELION-3 zurück und öffnen Sie den manuellen Kommissionierjob erneut. Klicken Sie auf Weiter. Dadurch werden Partikel, die zuvor in cryoSPARC v3 ausgewählt wurden, in der RELION-3-GUI angezeigt. Untersuchen Sie einige Mikroaufnahmen, um zu überprüfen, ob die Übertragung der Partikelkoordinaten durchgeführt wurde und ob die Partikel richtig ausgewählt wurden.

7. RELION-3 - Partikelextraktion und 2D-Klassifizierung

  1. Klicken Sie auf Partikelextraktion. Geben Sie auf der Registerkarte I/O die CTF-korrigierten Mikroaufnahmen aus Schritt 6.4 und Koordinaten aus Schritt 6.9 ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Extrahieren und ändern Sie die Partikelboxgröße (pix) auf 300. Führen Sie den Auftrag aus.
  2. Führen Sie eine 2D-Klassifizierung durch, um den in cryoSPARC v3 erzeugten Partikelsatz weiter zu reinigen, um eine Rekonstruktion mit höherer Auflösung zu erreichen. Klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie auf der Registerkarte E/A die in Schritt 7.1 generierte Datei particles.star ein. Legen Sie auf der Registerkarte Optimierung die Anzahl der Klassen auf 50 und den Maskendurchmesser (A) auf 280 fest. Führen Sie den Auftrag aus.
    HINWEIS: Die Maske sollte das gesamte Partikel umfassen.
  3. Um die besten 2D-Klassen auszuwählen, klicken Sie auf die Subset-Auswahlmethode , geben Sie die Datei _model.star aus Schritt 7.2 ein und führen Sie den Auftrag aus . Wählen Sie Klassen wie in Schritt 4.2 beschrieben aus.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3, um nicht konvergierende Partikel zu entfernen.

8. RELION-3 - 3D-Verfeinerung, Maskenerstellung und Nachbearbeitung

  1. Verwenden Sie die in cryoSPARC v3 (Schritt 5.2) generierte Karte als erstes Modell für die 3D-Verfeinerung in RELION-3. Wählen Sie die Importmethode aus, und legen Sie auf der Registerkarte E/A die folgenden Parameter fest: Import Raw Movies/Micrographs: Nein, Raw Input Files: Movies/*.mrc.
  2. Geben Sie die MTF-Datei ein und geben Sie die Filmaufnahmeparameter wie in Schritt 1.3 beschrieben ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Andere die cryoSPARC v3-Zuordnung als Eingabedatei aus, ändern Sie den Knotentyp in 3D-Referenz (.mrc), und führen Sie den Auftrag aus.
  3. Wählen Sie 3D Auto-Refine und legen Sie auf der Registerkarte I/O Input Images als particles.star-Datei aus Schritt 7.3 oder dem letzten Auswahlauftrag fest. Geben Sie die KryoSPARC v3-Rekonstruktion als Referenzkarte an. Klicken Sie auf die Registerkarte Referenz und ändern Sie den anfänglichen Tiefpassfilter (Å) in 50 und Symmetrie in Ikosaeder. Ändern Sie auf der Registerkarte Optimierung den Maskendurchmesser (Å) in 280, und führen Sie den Auftrag aus.
  4. Nachdem der Lauf beendet ist, öffnen Sie run_class001.mrc in UCSF Chimera.
  5. Klicken Sie in UCSF Chimera auf Extras und wählen Sie unter Volume Data die Option Volume Viewer aus. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet, in dem Sie die Lautstärkeeinstellungen anpassen können. Ändern Sie den Schritt in 1, und passen Sie den Schieberegler an, bis der Pegelwert erreicht ist, bei dem die Karte kein Rauschen aufweist. Notieren Sie diesen Wert, da er im nächsten Schritt für die Maskenerstellung verwendet wird.
  6. Die aus der automatischen Verfeinerung erstellte Karte spiegelt nicht den wahren FSC wider, da das Rauschen des umgebenden Lösungsmittels die Auflösung senkt. Erstellen Sie vor der Nachbearbeitung eine Maske, um die Probe vom Lösungsmittelbereich zu unterscheiden.
    1. Klicken Sie auf Maskenerstellung und geben Sie run_class001.mrc aus Schritt 8.3 ein.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Maske und passen Sie die Parameter wie folgt an: Tiefpassfilterkarte (Å): 10, Pixelgröße (Å): 1.045, Anfänglicher Binarisierungsschwellenwert : der Pegelwert, der in Schritt 8.5, Binäre Zuordnung so vieler Pixel erweitern: 3, und Hinzufügen einer weichen Kante dieser vielen Pixel: 3. Führen Sie den Auftrag aus.
  7. Untersuchen Sie die Maske in UCSF Chimera. Wenn die Maske zu eng ist, erhöhen Sie Binary Map so viele Pixel erweitern und/oder fügen Sie eine Soft-Edge von so vielen Pixeln hinzu. Es ist wichtig, eine Maske mit weichen Kanten zu erstellen, da eine scharfe Maske zu einer Überanpassung führen kann.
  8. Klicken Sie auf Nachbearbeitung und geben Sie auf der Registerkarte I/O die in Schritt 8.3 erstellten Halbkarten und die Maske aus 8.6 ein. Stellen Sie die kalibrierte Pixelgröße auf 1,045 Å ein. Geben Sie auf der Registerkarte Schärfen Folgendes ein: B-Faktor automatisch schätzen?: Ja, niedrigste Auflösung für Auto-B-Anpassung (A): 10, verwenden Sie Ihren eigenen B-Faktor?: Nein. Setzen Sie auf der Registerkarte Filter die Option Fsc-Gewichtung überspringen? auf Nein. Führen Sie den Auftrag aus.

9. RELION-3 - Poliertraining und Partikelpolieren

  1. Bevor Sie die durch den Teilchenstrahl induzierte Bewegung korrigieren, verwenden Sie zunächst den Trainingsmodus, um optimale Bewegungsspuren für den Datensatz zu identifizieren. Öffnen Sie Bayesian Polishing , und geben Sie auf der Registerkarte E/A die bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen aus Schritt 6.3, Partikel aus Schritt 8.3 und die .star-Datei nach dem Prozess aus Schritt 8.8 ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Training und legen Sie die folgenden Parameter fest: Trainiere optimale Parameter : Ja, Bruchteil der Fourier-Pixel zum Testen: 0,5, Verwenden Sie so viele Partikel: 5000. Führen Sie den Auftrag aus.
    HINWEIS: Dieses Skript erzeugt opt_params_all_groups.txt Datei im Ordner RELION-3 Polish mit optimierten Polierparametern, die für die Ausführung des folgenden Schritts erforderlich sind.
  2. Sobald der Trainingsjob beendet ist, klicken Sie auf Bayesian Polishing. Klicken Sie auf die Registerkarte Training und setzen Sie Train Optimal Parameters? auf Nein. Wählen Sie die Registerkarte Polnisch und geben Sie unter Optimierte Parameterdatei den Pfad zur opt_params_all_groups.txt Datei aus Schritt 9.1 an. Klicken Sie auf Ausführen.
  3. Wiederholen Sie die 3D-Verfeinerung (Schritt 8.3) und die Nachbearbeitung (Schritt 8.8) mit einer Reihe polierter Partikel.

10. RELION-3 - CTF- und Partikelverfeinerungen

  1. Um Aberrationen höherer Ordnung zu schätzen, öffnen Sie CTF Refinement , und wählen Sie auf der Registerkarte E/A unter Partikel den Pfad zur .star-Datei aus, die polierte Partikel aus dem letzten Refine 3D-Auftrag (run_data.star) enthält.
    1. Legen Sie unter Postprocess Star File den Pfad zur Ausgabe des letzten Nachbearbeitungsauftrags fest (Schritt 9.3).
    2. Wählen Sie die Registerkarte Anpassen (Fit ) und legen Sie die folgenden Parameter fest: Schätzung (anisotrope Vergrößerung): Nein, CTF-Parameteranpassung durchführen? Nein, Schätze Beamtilt: Ja, auch Trefoil schätzen? Ja, schätzen Sie die Abberationen 4. Ordnung? Ja. Führen Sie den Auftrag aus.
  2. Wiederholen Sie Schritt 10.1 mit Partikeln (von Refine3D), die im vorherigen Auftrag (particles_ctf_refine.star) generiert wurden, als Eingabe. Ändern Sie auf der Registerkarte Anpassung die Option Schätzung (anisotrope Vergrößerung) in Ja, und führen Sie den Auftrag aus.
  3. Wiederholen Sie Schritt 10.2 mit Partikeln (von Refine3D), die im vorherigen Auftrag (particles_ctf_refine.star) erzeugt wurden. Legen Sie auf der Registerkarte Anpassen die folgenden Parameter fest: Schätzung (anisotrope Vergrößerung): Nein, CTF-Parameteranpassung durchführen?: Ja, Fokussierung anpassen?: Pro-Partikel, Astigmatismus anpassen? Pro-Mikrogramm, B-Faktor anpassen?: Nein, Phasenverschiebung anpassen: Nein, Strahlneigung schätzen?: Nein, Aberrationen 4. Ordnung schätzen?: Nein. Führen Sie es aus .
    HINWEIS: Da das Partikel einen ausreichenden Kontrast aufweist, kann die Registerkarte Fit Astigmatism? kann auf Pro-Partikel gesetzt werden. Für diesen Datensatz hat die Verfeinerung des Astigmatismus pro Partikel die Qualität und Auflösung der Karte nicht verbessert.
  4. Wiederholen Sie die 3D-Verfeinerung mit den Partikeln aus Schritt 10.3 und setzen Sie auf der Registerkarte E/A die Option Use Solvent-Flattened FSCs? auf yes. Wenn Sie mit der Ausführung fertig sind, führen Sie einen Nachbearbeitungsauftrag aus (Schritt 8.8) und untersuchen Sie die Karte in UCSF Chimera (Schritt 5.2).

11. Übertragung von RELION-3-Partikelkoordinaten und 3D-Karte nach Scipion 3

  1. Um die RELION-3-Karte weiter zu verfeinern und zu validieren, importieren Sie zunächst das Volumen und die Partikel aus dem letzten Nachbearbeitungsauftrag (Schritt 10.4) in Scipion 3. Starten Sie Scipion 3 und erstellen Sie ein neues Projekt.
  2. Wählen Sie im linken Protokollbereich das Dropdown-Menü Importe aus und klicken Sie auf Partikel importieren. Ändern Sie die folgenden Parameter: Import From: RELION-3, Star File: postprocess.star, und geben Sie die Erfassungsparameter wie in Schritt 1.3 an. Klicken Sie auf Ausführen.
  3. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü Importe und wählen Sie Import Volumes aus. Geben Sie unter Importieren von den Pfad zur RELION-3-Karte ein. Ändern Sie die Pixelgröße (Abtastrate) å/px auf 1,045 und führen Sie sie aus.

12. Scipion 3 - Hochauflösende Verfeinerung

  1. Führen Sie zunächst eine globale Ausrichtung durch. Wählen Sie im Bedienfeld "Protokolle" das Dropdown-Menü "Verfeinern" und klicken Sie auf Xmipp3 - highres24. Geben Sie die importierten Partikel und Volumina aus den Schritten 11.2 und 11.3 als Bilder in voller Größe bzw. Anfangsvolumen ein und legen Sie die Symmetriegruppe auf ikosaedrisch fest. Wählen Sie auf der Registerkarte Bildausrichtung unter Winkelzuweisung die Option Global aus, legen Sie die maximale Zielauflösung auf 3 Å fest, und führen Sie den Auftrag aus.
  2. Wenn der Auftrag abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse analysieren. Klicken Sie im neuen Fenster auf das UCSF Chimera Symbol, um das verfeinerte Volumen zu untersuchen. Klicken Sie außerdem auf Display Resolution Plots ( FSC), um zu sehen, wie sich der FSC nach der Verfeinerung geändert hat, sowie auf Plot Histogram with Angular Changes , um zu sehen, ob sich die Euler-Winkelzuweisungen geändert haben.
    HINWEIS: Abhängig von der Auflösung der Eingangsstruktur RELION-3 kann dieser Schritt mehrmals wiederholt werden, wobei verschiedene Werte für die Max Target Resolution auf der Registerkarte Angular Assignment eingestellt sind. Weitere Informationen finden Sie im Scipion-Tutorial25.
  3. Wiederholen Sie Schritt 12.1 mit einer lokalen Ausrichtung. Kopieren Sie den vorherigen Auftrag, und ändern Sie Select Previous Run in Xmipp3 - highres Global. Ändern Sie auf der Registerkarte Winkelzuweisung die Bildausrichtung in Lokal. Legen Sie die maximale Zielauflösung auf 2,1 å fest.
  4. Untersuchen Sie die verfeinerte Karte in UCSF Chimera und analysieren Sie die Änderung der FSC- und Winkelzuordnungen (Schritt 12.2). Wiederholen Sie die lokale Einschränkung, bis sich die Auflösung nicht verbessert hat und die Winkelzuordnungen konvergiert sind, und passen Sie die maximale Zielauflösung nach Bedarf an.
  5. Die Ausgabekarte aus Scipion 3 kann in Phenix26 zusätzlich dichtemodifiziert und geschärft werden.

13. Scipion 3 - Kartenvalidierung

  1. Untersuchen Sie die lokale Auflösung der endgültigen Karte, die in Xmipp3 - highres generiert wurde. Öffnen Sie Xmipp - lokales MonoRes27 und geben Sie das letzte Volume aus dem vorherigen Job und der Maske ein, die in Schritt 8.6 generiert wurden. Legen Sie den Auflösungsbereich von 1 bis 6 Å mit einem Intervall von 0,1 Å fest und führen Sie den Auftrag aus.
  2. Wenn Sie mit der Ausführung fertig sind, klicken Sie auf Ergebnisse analysieren und untersuchen Sie das Auflösungshistogramm und die Volume-Segmente, die nach Auflösung gefärbt sind.
  3. Um zu sehen, ob die Partikel gut ausgerichtet sind, öffnen Sie Multireference Alignability28 und geben Sie die Partikel und das Volumen aus Schritt 12.3 ein. Klicken Sie auf Ergebnisse analysieren, um das Validierungsdiagramm anzuzeigen. Idealerweise sollten alle Punkte gruppiert werden (1.0,1.0).
  4. Öffnen Sie Xmipp3 - Überprüfen Sie die Überanpassung. Geben Sie die Partikel und Volumina aus Schritt 12.3 ein. Wenn Sie mit der Ausführung fertig sind, analysieren Sie die Ergebnisse und überprüfen Sie das Overfit-Diagramm. Die Kreuzung des ausgerichteten Gaußschen Rauschens und der ausgerichteten Partikelkurven weist auf eine Überanpassung hin.

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Representative Results

Wir haben eine umfassende SPA-Pipeline vorgestellt, um eine hochauflösende Struktur mit drei verschiedenen Verarbeitungsplattformen zu erhalten: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3. Abbildung 1 und Abbildung 4 fassen den allgemeinen Verarbeitungsworkflow zusammen, und in Tabelle 1 sind die Einschränkungsprotokolle aufgeführt. Diese Protokolle wurden bei der Verfeinerung einer 2,3 Å-Struktur von AAV verwendet, wodurch eine nahezu Nyquist-Auflösung erreicht wurde.

Filme wurden zuerst in cryoSPARC v3 importiert und anschließend bewegungs- und CTF-korrigiert, um gemittelte Mikroaufnahmen zu erzeugen. Bei der Auswahl von Mikroaufnahmen für die weitere Verarbeitung ist es wichtig, solche mit einer guten CTF-Passform und niedrigem Astigmatismus zu wählen (Abbildung 2), da die Einbeziehung von Mikroaufnahmen von schlechter Qualität spätere Verarbeitungsschritte behindern kann, was zu einer Rekonstruktion mit geringerer Auflösung führt. 27.364 Partikel wurden dann entnommen und aus den ausgewählten Mikroaufnahmen extrahiert. Da der Durchmesser des AAV ca. 220 Å und die Pixelgröße 1.045 Å beträgt, wurde eine Boxgröße von 300 px verwendet. Als nächstes wurde die iterative 2D-Klassifizierung verwendet, um Artefakte und Partikel zu entfernen, die nicht zu stabilen Klassen konvergieren. Beispiele für ausgewählte und ausgeschlossene 2D-Klassendurchschnitte sind in Abbildung 3 dargestellt. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Klassendurchschnitte, die unterschiedliche Konformationen der Probe widerspiegeln, separat verfeinert werden sollten, um mehrere 3D-Rekonstruktionen zu erhalten. In einem solchen Fall sollten mehrere ab initio Startvolumina berechnet werden. Hier wurden 26.741 Partikel ausgewählt und für die Ab-initio-Modellierung und homogene Verfeinerung einer einzigen 2,9-Å-Struktur verwendet.

Nachdem wir die Koordinaten der in cryoSPARC v3 ausgewählten Partikel nach RELION-3 übertragen hatten, führten wir vier zusätzliche Runden der 2D-Klassifizierung durch, bis der Datensatz zu stabilen 2D-Klassen konvergierte. Die oben beschriebene 2D-Klassifizierung entfernte weitere 3.154 Partikel aus dem Datensatz. Unter Verwendung der in cryoSPARC v3 generierten Struktur als erstes Modell ergab die 3D-Verfeinerung in RELION-3 eine Struktur mit einer fast gleichwertigen Auflösung von 2,95 Å. Nachfolgende strukturelle Verfeinerungen, die eine Korrektur der Bewegung pro Partikel und CTF-Verfeinerungen umfassten, erhöhten die Auflösung auf 2,61 Å. Eine vollständige Liste der von uns durchgeführten Verfeinerungen ist in Tabelle 1 dargestellt. Das in RELION-3 berechnete Volumen wurde dann in Scipion 3 mit mehreren Runden hochauflösender Verfeinerung (Xmipp3 - highres) weiter verfeinert. Während der anschließenden Verfeinerungsrunden wurden weitere 3.186 Partikel aus dem Datensatz entfernt, was zu einem endgültigen Satz von 20.401 Partikeln führte, was zu einer 2,3 Å Rekonstruktion von AAV führte (Abbildung 5 und Abbildung 6). Angesichts der Pixelgröße von 1,045 Å haben unsere Verfeinerungen also fast die Nyquist-Grenze erreicht. FSC-Kurven, die Strukturen darstellen, die mit jedem Programm berechnet wurden, sind in Abbildung 6 dargestellt. Diese FSC-Kurven zeigen die Erhöhung der Auflösung während des gesamten Workflows an. Da die Auflösung von Punkt zu Punkt in der Karte variieren kann, ist es oft angemessener, die Verteilung der lokalen Auflösungsschätzungen in der Karte darzustellen, anstatt eine einzelne Auflösungsschätzung nach einem einzigen Kriterium (z. B. 0,143-Kriterium) aus der FSC-Kurve zu melden. Daher haben wir eine solche Analyse mit Xmipp - MonoRes in Scipion 3 durchgeführt. Abbildung 7 zeigt einen Vergleich der lokalen Auflösungsschätzungen für Karten, die mit cryoSPARC v3 und Scipion 3 erhalten wurden. Auflösungsschätzungen an vier verschiedenen Schnitten durch die Strukturen (Abbildung 7A,B) und Auflösungshistogramme (Abbildung 7C) zeigen deutlich die inkrementelle Verbesserung der lokalen Auflösung zwischen den Karten während des gesamten Workflows. Die FSC-Kurve, die mit dem Programm Xmipp3 - highres in Scipion 3 berechnet wurde, zeigt an, dass der Nyquist-Grenzwert erreicht wurde (Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass die Auflösungsschätzung sehr wahrscheinlich durch Undersampling29 begrenzt ist. Die in Abbildung 7C dargestellte MonoRes-Analyse sowie eine sorgfältige Analyse der EM-Karte und die Anpassung der Karte an atomare Koordinaten von AAV (Abbildung 5) deuten jedoch darauf hin, dass eine angemessenere Auflösungsschätzung für die Karte 2,3 Å beträgt. Eine ähnliche Strategie, die die FSC- und MonoRes-Auflösungsschätzungen in Einklang bringt, wurde bereits vorgestellt24,25. Da Auflösungsschätzungen durch die Maske beeinflusst werden können, die während der Verfeinerungsschritte verwendet wird, ist es wichtig sicherzustellen, dass die Maske keinen Teil der Dichte ausschließt. Die in dieser Studie verwendete Maske, die sich mit den 3D-Rekonstruktionen überschnitt, ist in Abbildung 7D dargestellt. Die schrittweise Erhöhung der Auflösung im vorgestellten Workflow unterstreicht den Vorteil der Verwendung von Algorithmen aus mehreren SPA-Softwarepaketen, um eine qualitativ hochwertige und hochauflösende 3D-Rekonstruktion zu erreichen.

Das Erstellen von In-situ-Modellen oder das Anpassen der Karte an ein bereits vorhandenes atomares Modell kann als Qualitätsprüfung für die berechnete Struktur dienen. Wir haben die endgültige Karte in UCSF Chimera visualisiert und die Karte mit einem zuvor veröffentlichten Atommodell (PDB ID: 7kfr)30 ausgestattet. Abbildung 5 zeigt Regionen der Kryo-EM-Karte, die mit atomaren Koordinaten von AAV ausgestattet sind. Gut definierte EM-Dichten ermöglichen die Anpassung von Seitenketten einzelner Aminosäuren, Wassermoleküle und Magnesiumionen und bestätigen die Übereinstimmung der Kryo-EM-Karte mit dem Atommodell.

Figure 1
Abbildung 1: Vollständiger SPA-Workflow für cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 und Phenix 1.18. Schritte, die in cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 und Phenix 1.18 ausgeführt werden, werden mit violetten, orangefarbenen, grünen bzw. grauen Kästchen gekennzeichnet. Die Zeit, die für die Fertigstellung jedes Schritts mit dem Verarbeitungsserver benötigt wird, der mit 8 GPUs, 40 CPUs und 750 GB RAM ausgestattet ist, ist in jeder einzelnen Box angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Auswahl von Mikroaufnahmen für die nachgelagerte Verarbeitung in cryoSPARC v3 . (A) Mikroaufnahmen mit gut aufeinander abgestimmten geschätzten und experimentellen Thon-Ringen wurden für die weitere Verarbeitung verwendet, während solche mit hohem Astigmatismus und schlechter Passform (B) verworfen wurden. Mikroaufnahmen mit CTF-Fit über 5 Å, Astigmatismus über 400 Å und relativer Eisdicke unter 2 wurden aus der Weiterverarbeitung entfernt, d.h. 70/395 Mikroaufnahmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Auswählen von 2D-Klassen Mittelwerte der 2D-Klasse mit genau definierten Klassen werden ausgewählt (A), und solche mit niedriger Auflösung, Rauschen und partiellen Partikeln werden abgelehnt (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Workflow und repräsentative Ergebnisse für die AAV-Verarbeitung in cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3. Schritte, die in cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 ausgeführt werden, sind mit violetten, orangefarbenen bzw. grünen Pfeilen gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Die hochauflösende Struktur von AAV zeigt gut definierte EM-Dichten, die verschiedene sekundäre Strukturelemente und einzelne Aminosäure-Seitenketten darstellen. (A) Eine endgültige Karte von AAV. (B) Ein Teil der Karte, der Beta-Blätter mit Atomkoordinaten von AAV (PDB ID: 7kfr)30 darstellt. (C) Kartierung von Dichten, die einzelne Aminosäuren darstellen. Von links nach rechts: Arginin, Phenylalanin und Tryptophan. (D) Zu den hochauflösenden Merkmalen der Karte gehören Wassermoleküle, die in roten und Magnesiumionen dargestellt sind, die als grüne Kugeln dargestellt werden. Das in der Abbildung dargestellte Mg2+- Ion wird durch Histidin (links) und Argininreste koordiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: FSC-Kurven von cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 zeigen eine zunehmende Auflösung im gesamten Workflow. Während die mit dem Programm Xmipp3 - highres in Scipion 3 berechnete FSC-Kurve anzeigt, dass der Nyquist-Grenzwert erreicht wurde, was darauf hindeutet, dass die Auflösungsschätzung durch Undersampling29 begrenzt ist, wird eine angemessenere Analyse der Kartenauflösung in Abbildung 7 dargestellt und im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse24,25 diskutiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Validierung der endgültigen Rekonstruktion in Scipion 3 mit Xmipp - MonoRes. Die Auflösung der Karte lässt sich besser beschreiben, indem lokale Auflösungsverteilungen dargestellt werden, anstatt eine einzelne Auflösungsschätzung nach einem einzigen Kriterium aus der FSC-Kurve. (A-B) Die Felder A und B zeigen verschiedene Slices aus Karten, die in cryoSPARC v3 bzw. Scipion 3 generiert wurden. (C) Histogramme, die eine systematische Erhöhung der lokalen Auflösung für Karten zeigen, die in KryoSPARC v3 (rosa Balken) und Scipion 3 (blaue Balken) berechnet wurden. (D) Die Maske (grau), die für lokale Auflösungsberechnungen verwendet wird, enthält alle Teile der AAV-Dichten, die in beiden Programmen verfeinert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Programm Einschränkungstyp Skript
cryoSPARC v3 Homogene Verfeinerung Homogene Verfeinerung
Ungleichmäßige Verfeinerung Ungleichmäßige Verfeinerung
Heterogene Verfeinerung Heterogene Verfeinerung
Bewegungskorrektur pro Partikel Lokale Bewegungskorrektur
RELION-3 3D-Verfeinerung Verfeinerung von 3D
Nachbearbeitung - B-Faktor-Schärfung, MTF-Korrektur Verfeinerung von 3D
Polieren von Partikeln Bayessches Polieren
CTF-Verfeinerung - Strahlneigung CtfRefine
CTF-Verfeinerung - anisotrope Vergrößerung CtfRefine
CTF-Verfeinerung - Defokus pro Partikel, Astigmatismus pro Partikel / Mikroaufnahme CtfRefine
Ewald-Kugelkrümmungskorrektur Relion_reconstruct
Scipion 3 Hochauflösende Verfeinerung Xmipp3 - hochauflösend
Phenix 1,18 Dichtemodifikation und -schärfung ResolveCryoEM

Tabelle 1: Im gesamten Workflow implementierte Verfeinerungen. Ob bestimmte Verfeinerungen auf ein bestimmtes Projekt anwendbar sind, hängt von der Datenqualität und den Erfassungsparametern ab. Beispielsweise kann die Ewald-Kugelkrümmungskorrektur für Karten angewendet werden, die bereits eine hohe Auflösung haben.

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Discussion

In diesem Artikel stellen wir einen robusten SPA-Workflow für die Kryo-EM-Datenverarbeitung über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen (Abbildung 1). Dieser Workflow ist auf eine Vielzahl von biologischen Makromolekülen anwendbar. Die nachfolgenden Schritte des Protokolls sind in Abbildung 4 dargestellt, einschließlich Filmvorverarbeitung, Partikelkommissionierung und -klassifizierung sowie mehrerer Methoden zur Strukturverfeinerung (Tabelle 1) und Validierung. Es wurden Verarbeitungsschritte in cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 sowie Methoden zur Datenübertragung zwischen den Softwarepaketen vorgestellt. Wir haben die im gesamten Protokoll erhaltenen Zwischenstrukturen mit zunehmender Auflösung gezeigt (Abbildung 4, Abbildung 6 und Abbildung 7).

Während die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden zur Strukturbestimmung verschiedener Proteine und biologischer Anordnungen verwendet werden können, ist es wichtig zu beachten, dass AAV ein idealer Kandidat für die hochauflösende Strukturbestimmung durch Kryo-EM und SPA ist, da seine große Größe einen hohen Kontrast im Mikroskop erzeugt und die ikosaedrische Symmetrie Partikel mit 60-facher Subunit-Redundanz ergibt. Die Gewinnung hochauflösender Rekonstruktionen wird für kleine (d. h. weniger als 100 kD), dynamische und heterogene Proben immer schwieriger. Um dieses Protokoll erfolgreich auszuführen, ist es wichtig, dass viele qualitativ hochwertige Filme für die Verarbeitung gesammelt werden. Bei Rohdaten von schlechter Qualität ist es nicht möglich, eine hochauflösende und qualitativ hochwertige Rekonstruktion zu erhalten. Wenn beispielsweise die Eisdicke für die Strukturbestimmung nicht optimal ist oder wenn Partikel an der Eis-Wasser-Grenzfläche haften oder bevorzugte Orientierungen aufweisen, sollten Sie sich die Bedingungen für den Gittergefrierpunkt noch einmal ansehen.

Ein weiterer wichtiger Schritt im Workflow ist die Partikelkommissionierung und -extraktion. Während der Partikelentnahme sollte die Schachtelgröße etwa 1,4-2,5 mal größer sein als die längste Achse des Partikels, da eine ausreichende Schachtelgröße erforderlich ist, um hochauflösende Informationen zu erfassen, die aufgrund von Defokussierung verteilt sind. Größere Kartongrößen erfordern jedoch längere Verarbeitungszeiten aufgrund der erhöhten Größe der bei der Partikelextraktion erzeugten Dateien. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl einer Schachtelgröße den Partikeldurchmesser und die Pixelgröße. Bei vielen Partikeln möchte der Benutzer möglicherweise Partikel während der Extraktion für die Erstverarbeitung in den Papierkorb werfen und dann Partikel in voller Größe für die endgültige Verfeinerung erneut extrahieren. Dieses Protokoll verwendet die manuelle Partikelkommissionierung, um Vorlagen für die automatische Auswahl zu generieren. KryoSPARC v3 bietet jedoch auch vollautomatische Kommissioniermethoden, einschließlich eines blob-basierten Pickers und eines Topaz-Wrappers, der Deep Learning verwendet, um Partikel basierend auf früheren Picks auszuwählen. Während diese Algorithmen sehr robust sind, müsste eine beträchtliche Anzahl von Picks später durch 2D- und 3D-Klassifizierung entfernt werden.

Zu den kritischen Schritten gehört auch die 2D- und 3D-Klassifizierung, die verwendet wird, um Artefakte wie strahlungsgeschädigte Partikel zu entfernen und verschiedene strukturelle Formen der in der Probe vorhandenen Probe zu trennen. Die Anzahl der vom Benutzer festgelegten 2D-Klassen sollte von der Anzahl der aus Mikroaufnahmen extrahierten Partikel, dem Kontrast und der Heterogenität in der Probe abhängen, da das Ziel darin besteht, jede einzelne Ansicht des Partikels in eine separate 2D-Klasse aufzuteilen. Als allgemeine Regel gilt: Fügen Sie eine 2D-Klasse für jeweils 100 Partikel hinzu, und wenn Sie eine neue Probe mit einer großen Anzahl von Partikeln verarbeiten, sind 100 Klassen ein guter Ausgangspunkt. Wenn auch nach vielen Runden der 2D- und 3D-Klassifizierung eine niedrige oder moderate Auflösung erreicht wird, versuchen Sie, Partikel mit einer größeren Schachtelgröße erneut zu extrahieren, um zu sehen, ob mehr strukturelle Informationen erhalten werden können. Während der Berichterstattung über die Auflösung der endgültigen Rekonstruktion sollte man die nach der Goldstandardmethode erhaltene FSC-Kurve zusammen mit den lokalen Auflösungsschätzungen und der sorgfältigen Inspektion der Kartendichten sowie deren Übereinstimmung mit dem Atommodell analysieren.

Für die Verfeinerung der Virusstrukturen hat die in RELION-3 implementierte Ewald-Kugelkrümmungskorrektur Verbesserungen bei hoher Auflösung gezeigt31. Wenn Sie Strukturen dynamischer Multiproteinkomplexe verfeinern, versuchen Sie es mit einer 3D-Multibody-Verfeinerung, die in RELION-3 implementiert ist, oder einer fokussierten Klassifizierung mit Bildsubtraktion, die in RELION-3 und cryoSPARC v3 implementiert ist. Wenn die Heterogenität rechnerisch nicht aufgelöst werden kann, müssen die Bedingungen für die Probenvorbereitung erneut überprüft werden32. Unzureichende Reinheit oder unzureichende Vorbereitung, die zum Proteinabbau führt, behindern die Qualität der 3D-Rekonstruktion. Darüber hinaus begrenzen Pufferbedingungen, die Proteine destabilisieren oder die Aggregation fördern, die Anzahl der gut definierten Partikel, die für die Strukturberechnung verwendet werden können, erheblich. Um die hier vorgestellten Methoden am effektivsten nutzen zu können, ist es daher unerlässlich, optimale Bedingungen für die Probenstabilität zu identifizieren. Wir empfehlen eine negativ färbende Elektronenmikroskopie, um die Proben vor der Kryo-EM zu screenen.

Da Kryo-EM für immer mehr Strukturbiologen zur bevorzugten Methode für die 3D-Strukturbestimmung geworden ist, wird die Notwendigkeit eines integrativen und robusten Workflows für die Bildverarbeitung und Strukturbestimmung immer deutlicher. CryoSPARC bietet eine einfach zu bedienende, webbasierte grafische Benutzeroberfläche (GUI), die es Benutzern aller Erfahrungsstufen ermöglicht, Daten schnell zu verarbeiten und eine 3D-Struktur zu berechnen. Insbesondere verwendet CryoSPARC einen stochastischen Gradientenabstieg, um eine 3D-Rekonstruktion ab initio durchzuführen. Darüber hinaus verwendet die Software einen Algorithmus zur Optimierung der Verzweigung und gebundenen Wahrscheinlichkeit für eine schnelle 3D-Kartenverfeinerung7. Die in diesem Artikel beschriebene Verarbeitungspipeline verwendet cryoSPARC v3, um eine erste 3D-Karte zu erhalten. Die 3D-Rekonstruktion wird dann in RELION-3 verfeinert, einem beliebten Paket, das einen empirischen Bayes'schen Ansatz verwendet, um kritische Parameter basierend auf dem Datensatz des Benutzers zu schätzen, wodurch der Bedarf an Expertenwissen für den Programmbetrieb reduziert wird10. Insbesondere verwenden wir Bayes'sche Politur für die Bewegungskorrektur pro Partikel und CTF-Verfeinerungen, um die Auflösung zu verbessern. Schließlich wird die resultierende Struktur in Scipion 311, einer integrativen Python-Shell, die Algorithmen von mehreren Plattformen unterstützt, einschließlich Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 und anderen, weiter verfeinert und validiert. Während viele verschiedene Softwarepakete für Kryo-EM-Benutzer verfügbar sind, gibt es derzeit keine universelle SPA-Plattform, die von der Praxis akzeptiert wird. Obwohl der SPA-Workflow in jedem der drei in diesem Artikel beschriebenen Softwarepakete vollständig ausgeführt werden kann, können unterschiedliche Algorithmen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Folglich müssen einzelne Schritte in Abhängigkeit von der Stichprobe und der Qualität der Daten angepasst werden. Für den aktuellen Datensatz erhöhte beispielsweise 3Drefine in RELION-3 die Auflösung der 3D-Rekonstruktion, während die ungleichmäßige Verfeinerung in cryoSPARC v3 zu einer leichten Abnahme der Auflösung führte. Daher ist es sehr vorteilhaft, eine Vielzahl von Programmen zu verwenden, um Strukturen neu zu berechnen, um eine optimale Qualität und Auflösung zu erreichen und die Validierung der Rekonstruktionen zu erleichtern. Obwohl Scipion 3 zahlreiche Algorithmen aus cryoSPARC v3 und RELION-3 enthält, sind die neuesten Implementierungen dieser Programme in Scipion nicht sofort verfügbar. Zum Beispiel bietet von den Programmen, die in diesem Manuskript verwendet werden, nur RELION-3 eine Ewald-Kugelkrümmungskorrektur durch das Skript Relion_reconstruct. Die in diesem Artikel vorgestellte Pipeline bietet sowohl neuen als auch erfahrenen Benutzern eine Anleitung zur erfolgreichen Verwendung von Algorithmen, die in cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 implementiert sind, um 3D-Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung zu berechnen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Carlos Oscar Sorzano für die Hilfe bei der Installation von Scipion3 und Kilian Schnelle und Arne Moeller für die Hilfe beim Datentransfer zwischen verschiedenen Verarbeitungsplattformen. Ein Teil dieser Forschung wurde durch den NIH-Zuschuss U24GM129547 unterstützt und am PNCC an der OHSU durchgeführt und über EMSL (grid.436923.9), eine vom Office of Biological and Environmental Research gesponserte DOE Office of Science User Facility, zugänglich gemacht. Diese Studie wurde durch ein Start-up-Stipendium der Rutgers University an Arek Kulczyk unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biochemie Ausgabe 179 Kryo-Elektronenmikroskopie Kryo-EM Einzelpartikelanalyse SPA cryoSPARC RELION Scipion Bildverarbeitung Strukturberechnung AAV
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