Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En reporteranalys för att analysera intronisk mikroRNA-mognad i däggdjursceller

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Vi utvecklade en intronic microRNA biogenesis reporter assay som ska användas i celler in vitro med fyra plasmider: en med intronic miRNA, en med målet, en för att överuttrycka ett reglerande protein och en för Renilla luciferas. MiRNA bearbetades och kunde kontrollera luciferasuttryck genom att binda till målsekvensen.

Abstract

MikroRNA (miRNA) är korta RNA-molekyler som är utbredda i eukaryoter. De flesta miRNA transkriberas från introner, och deras mognad involverar olika RNA-bindande proteiner i kärnan. Mogna miRNA förmedlar ofta gendämpning, och detta har blivit ett viktigt verktyg för att förstå post-transkriptionella händelser. Förutom det kan det utforskas som en lovande metod för genterapier. Det saknas dock för närvarande direkta metoder för att bedöma miRNA-uttryck i däggdjurscellkulturer. Här beskriver vi en effektiv och enkel metod som hjälper till att bestämma miRNA-biogenes och mognad genom bekräftelse av dess interaktion med målsekvenser. Detta system möjliggör också separation av exogen miRNA-mognad från dess endogena aktivitet med användning av en doxycyklininducerbar promotor som kan styra primär miRNA (pri-miRNA) transkription med hög effektivitet och låg kostnad. Detta verktyg möjliggör också modulering med RNA-bindande proteiner i en separat plasmid. Förutom dess användning med en mängd olika miRNA och deras respektive mål kan den anpassas till olika cellinjer, förutsatt att dessa är mottagliga för transfektion.

Introduction

Prekursor-mRNA-splitsning är en viktig process för reglering av genuttryck i eukaryoter1. Avlägsnandet av introner och föreningen av exoner i moget RNA katalyseras av spliceosomen, ett 2 megadalton ribonukleoproteinkomplex bestående av 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 och U6) tillsammans med mer än 100 proteiner 2,3. Skarvningsreaktionen sker co-transkriptionellt, och skarven monteras vid varje ny intron som styrs av igenkänningen av bevarade skarvställen vid exon-introngränser och inom intron4. Olika introner kan ha olika skarvningshastigheter trots det anmärkningsvärda bevarandet av skarvkomplexet och dess komponenter. Förutom skillnaderna i bevarande av skarvplatser kan regleringssekvenser fördelade på introner och exoner styra RNA-bindande proteiner (RBP) och stimulera eller undertrycka skarvning 5,6. HuR är en allestädes närvarande uttryckt RBP och är en viktig faktor för att kontrollera mRNA-stabilitet7. Tidigare resultat från vår grupp visade att HuR kan binda till introner som innehåller miRNA, vilket indikerar att detta protein kan vara en viktig faktor för att underlätta miRNA-bearbetning och mognad, vilket också leder till generering av alternativa skarvningsisoformer 6,8,9.

Många mikroRNA (miRNA) kodas från introniska sekvenser. Medan vissa är en del av intronen, är andra kända som "mirtroner" och bildas av hela intron10,11. miRNA är korta icke-kodande RNA, som sträcker sig från 18 till 24 nukleotider i längd12. Deras mogna sekvens visar partiell eller total komplementaritet med målsekvenser i mRNA, vilket påverkar translations- och / eller mRNA-sönderfallshastigheter. Kombinationerna av miRNA och mål driver cellen till olika resultat. Flera miRNA kan driva celler till pro- eller antitumörfenotyper13. Onkogena miRNA riktar sig vanligtvis mot mRNA som utlöser en undertryckande egenskap, vilket leder till ökad cellulär spridning, migration och invasion14. Å andra sidan kan tumörsuppressiva miRNA rikta in sig på onkogena mRNA eller mRNA relaterade till ökad cellproliferation.

Bearbetningen och mognaden av miRNA är också beroende av deras ursprung. De flesta introniska miRNA bearbetas med deltagande av mikroprocessorn, bildad av ribonukleas Drosha och proteinkofaktorer12. Mirtroner bearbetas med spliceosomens aktivitet oberoende av Drosha15. Med tanke på den höga frekvensen av miRNA som finns inom introner, antog vi att RNA-bindande proteiner som är involverade i skarvning också kan underlätta bearbetningen och mognaden av dessa miRNA. I synnerhet har RBP hnRNP A2 / B1 redan associerats med mikroprocessorn och miRNA-biogenesen16.

Vi har tidigare rapporterat att flera RNA-bindande proteiner, såsom hnRNP och HuR, är associerade med introniska miRNA genom masspektrometri17. HuR:s (ELAVL1) samband med miRNA från miR-17-92 intronic-klustret bekräftades med hjälp av immunoprecipitation och in silico-analys 9. miR-17-92 är ett introniskt miRNA-kluster som består av sex miRNA med ökat uttryck i olika cancerformer18,19. Detta kluster är också känt som "oncomiR-1" och består av miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b och miR-92 a. miR-19 a och miR-19b är bland de mest onkogena miRNA i detta kluster 19. Det ökade uttrycket av HuR stimulerar miR-19a och miR-19b syntes9. Eftersom introniska regioner som flankerar detta kluster är associerade med HuR, utvecklade vi en metod för att undersöka om detta protein kunde reglera miR-19a och miR-19b uttryck och mognad. En viktig förutsägelse av vår hypotes var att HuR, som ett reglerande protein, kunde underlätta miRNA-biogenes, vilket ledde till fenotypiska förändringar. En möjlighet var att miRNA bearbetades genom stimulering av HuR men inte skulle vara mogna och funktionella och därför skulle effekterna av proteinet inte direkt påverka fenotypen. Därför utvecklade vi en skarvningsreporteranalys för att undersöka om en RBP som HuR kunde påverka biogenesen och mognaden av ett intronic miRNA. Genom att bekräfta miRNA-bearbetning och mognad visar vår analys interaktionen med målsekvensen och genereringen av ett moget och funktionellt miRNA. I vår analys kopplar vi ihop uttrycket av ett introniskt miRNA-kluster med en luciferasplasmid för att kontrollera miRNA-målbindning i odlade celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En översikt över protokollet som beskrivs här visas i figur 1.

1. Plasmid konstruktion

  1. pCAGGS-Cre: Denna plasmid tillhandahölls av Dr. E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Förstärk pre-miR-17-92 med PCR med användning av 0,5 μM av varje specifik primer (materialtabell), 150 ng cDNA, 1 mM dNTP, 1x Taq PCR-buffert och 5 U av högkvalitativ Taq DNA-polymeras. Utför en PCR-reaktion utan mallkontroll (använd vatten istället för cDNA) för att kontrollera DNA-kontaminering.
    2. Ligate PCR-produkten till pRD-RIPE (vänligen tillhandahållen av Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 inuti intronen mellan EcoRI- och EcoRV-begränsningsställena med DNA-ligas, vilket skapar pRD-miR-17-92. Bekräfta sekvensintegritet genom Sanger-sekvensering.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. Designa framåt- och bakåtprimers flankerade av XhoI / XbaI-begränsningsställen och med en NotI-begränsningsplats inuti. Blanda ekvimolära mängder framåt- och bakåtprimrar och inkubera blandningen vid 90 °C i 5 minuter och överför sedan till 37 °C i 15 minuter. Som kontroller använder du primers med krypterade målsekvenser (materialtabell).
    2. Klyva de glödgade fragmenten med hjälp av XhoI / XbaI-restriktionsenzymer och ligera dem nedströms luc2-sekvensen till pmiR-GLO, vilket genererar pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) och pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) reporterkonstruktioner. Bekräfta ligering med NotI-klyvning.
      OBS: Se till att de överhäng som skapas efter primerglödgning kompletterar vektorn efter klyvningsreaktion.
  4. pFLAG-HuR
    1. För att generera en HuR-överuttryckande plasmid, förstärka HuR-sekvensen med specifika primers. Blanda 300 ng cDNA, 0,5 μM av varje specifik primer, 1 mM dNTPs mix, 1x PCR-buffert och 5 U av högkvalitativ Taq DNA-polymeras.
    2. Blanda in PCR-produkten i pGEM-T och bekräfta DNA-sekvensens integritet genom Sanger-sekvensering. Ta bort HuR-fragmentet från pGEM-T och subklona det till pFLAG-CMV-3 däggdjursuttrycksvektor för att generera pFLAG-HuR-vektorn.

2. Cellodling

OBS: HeLa-Cre-cellinjen var en gåva från Dr. E. Makeyev21, och den papillära sköldkörtelcancercellen (BCPAP) tillhandahölls vänligen av Dr. Massimo Santoro (University "Federico II", Neapel, Italien). HeLa-cell, papillär sköldkörtelcancercell (BCPAP) och HEK-293T användes för att överuttrycka HuR.

  1. Behåll cellerna i DMEM/högglukos kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 200 mM L-glutamin och 1x penicillin-streptomycin (100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) i 100 mm petriskålar, om inte annat anges. Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med kontrollerad atmosfär (5 %CO2).
  2. Inkubera vidhäftande celler med trypsin/EDTA (0,5% lösningsblandning) vid 37 °C i 3-5 min. Låt dem lossna från plattan (inkubationsperioden kan variera beroende på celltyp).
  3. Utför transfektioner med ett lipidbaserat transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner. Se till att cellkulturerna är cirka 70% sammanflytande. Använd liknande mängder DNA för alla transfektionskombinationer, som beskrivs nedan, genom att lägga till lämpliga DNA. Utför transfektionsexperiment i replikat.
    1. Blanda 200 ng DNA och 1,25 μl transfektionsreagens i 100 μl av odlingsmediet. Tillsätt transfektionsblandningen till cellerna. Inkubera cellerna med transfektionsblandningarna i 4 timmar vid 37 °C. Byt sedan ut mediet med medium som innehåller 10% FBS och inkubera i ytterligare 24 timmar innan du tillsätter antibiotika för urval.

3. HuR överuttryck

  1. Transfekt pFLAG-HuR och tom pFLAG in i HeLa. Välj celler genom att öka koncentrationen av genetik (G418) (1 μg/ml) från 100 μg/ml till 1000 μg/ml, vilket genererar stabila cellinjer.
  2. Bekräfta överuttryck med kvantitativ PCR med hjälp av specifika primers för HuR mRNA, enligt beskrivningen i steg 7.

4. Total RNA-isolering

  1. Använd nyuppsamlade celler. Trypsinisera 70% konfluenta cellkulturer (för denna analys användes HeLa-Cre-celler), som beskrivs i steg 2.2.
  2. Samla upp cellpelleten genom centrifugering i 5 min vid 500 x g vid 4 °C och tvätta den med 1x PBS (fosfatbuffrad saltlösning). upprepa centrifugeringen.
  3. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml 1x PBS och överför den till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  4. Centrifugera i 5 minuter vid 500 x g vid 4 °C.
  5. Väg den torra cellpelleten och justera rörens volymer och storlek därefter. 1 mg celler ger ungefär 1 μg totalt RNA.
  6. Tillsätt 500-1 000 μl fenol/kloroform i en huva till cellpelleten (helst 750 μl per 0,25 g celler) och homogenisera den genom att pipettera upp och ner och blanda med virveln.
  7. Inkubera blandningen i 5 minuter vid rumstemperatur (20 °C till 25 °C) för att möjliggöra fullständig dissociation av nukleoproteinkomplex.
  8. Centrifugera provet vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
  9. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 200 μl kloroform per 1 ml fenol:kloroform som används. Täck provrören ordentligt.
  10. Blanda kraftigt i 15 s (för hand eller kort virvlande med lägre hastighet) och inkubera vid rumstemperatur (20 °C till 25 °C) i 2 minuter till 3 minuter.
  11. Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 °C.
  12. Kontrollera om det finns en lägre röd fenol-kloroformfas, en mellanliggande fas och en färglös övre vattenhaltig fas. RNA förblir i den övre vattenfasen. I en huva, samla den vattenhaltiga fasen, undvik att kontakta mellanfasen och överför till ett nytt rör.
  13. Fäll ut RNA genom att blanda vattenfasen med 400 μL isopropanol av molekylär kvalitet (1: 1-förhållande till fenol / kloroform som används) och 2 μL glykogen i varje rör (det hjälper till att visualisera närvaron av pelleten).
  14. Blanda kraftigt för hand eller homogenisera med spetsen i ~10 s. Inkubera i 15 minuter eller över natten vid −20 °C.
  15. Centrifugera provet vid 12 000 x g i 20 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
  16. Tvätta RNA-pelleten genom att tillsätta 3 volymer 100% etanol (ca 1 ml, utspädd med DEPC-vatten) och blanda provet genom virvel tills pelleten frigörs och flyter från botten.
  17. Centrifugera vid 7 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
  18. Tvätta RNA-pelleten 1x genom att tillsätta 1 ml 75% etanol och blanda provet genom virvel tills pelleten frigörs och flyter från botten. Upprepa centrifugeringen enligt beskrivningen i steg 4.17.
  19. Utför ytterligare en 5 s centrifugeringsspinn för att samla kvarvarande vätska från rörets sida och ta bort eventuell kvarvarande vätska med en pipett utan att störa pelleten.
  20. Lufttorka RNA-pelleten kort genom att öppna rörets lock vid rumstemperatur i 3-5 minuter och lös upp RNA-pelleten i 20-50 μL RNas-fritt DEPC-behandlat vatten. Inkubera RNA i 10 minuter vid 55–60 °C för att underlätta återsuspension av pelleten.

5. Bestämning av total RNA-koncentration och kvalitet

  1. Bestäm RNA-koncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 nm och 280 nm med hjälp av en spektrofotometer. Hämta fullständiga spektraldata innan du använder exemplen i underordnade program.
  2. Kontrollera RNA-kvaliteten genom att lösa 800-1000 ng på en 1,5% agarosgel med 0,5X TBE-buffert (45 mM Tris-bas, 45 mM borsyra, 1 mM EDTA). Totalt RNA separeras i två band som hänvisar till 28S och 18S rRNA.
    1. Gör alla reagenser och tvätta all utrustning som används för att köra gelén med DEPC-behandlat vatten. DEPC-behandlat vatten framställs i huven genom tillsats av 1 ml dietylpyrokarbonat till 1000 ml ultrarent vatten. Inkubera i ~2 timmar vid rumstemperatur eller vid 37 °C och autoklav. Förvara vid rumstemperatur i upp till 10 månader.
      OBS: Elektrofores av däggdjurs totala RNA leder till separation av 28S och 18S rRNA i ett förhållande av ungefär 2: 1. Banden ska vara intakta och synliga som två vassa band. Försämrat RNA kommer att resultera i suddiga band.

6. Omvänd transkription

  1. Ställ in omvänd transkriptionsreaktion med 1 μg totalt RNA.
  2. Utför omvänd transkription (RT) med hjälp av omvänd transkriptasenzym (se materialtabell) och 50 ng / μL slumpmässiga decamerprimrar.
    1. Blanda RNA, slumpmässiga primers och 1 mM dNTP-blandning (10 mM) i 10 μl. Inkubera vid 65 °C i 5 min och på is i 1 min. Lägg till följande reagenser: 1x RT-buffert, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U RNas-hämmare och 200 U omvänd transkriptas.
    2. Inkubera i 10 minuter vid 25 °C och i 1 timme vid 50 °C (temperaturen kan ändras om olika enzymer används). Avsluta reaktionen genom att inkubera vid 85 °C i 5 minuter.

7. Kvantitativ PCR

  1. För att montera reaktionen i en slutlig volym på 15 μl, blanda 3 μL cDNA (100 ng/μl), 3,2 pmol av varje primer, 6 μL masterblandning innehållande dNTP och enzym och 2,8 μl ultrarent vatten.
    OBS: Använd primers för endogena konstitutiva gener som kontroller (hushållningsgener) för att normalisera uttrycksnivåerna för HuR mRNA och miRNA. β-aktin och snRNA U6 (RNU6B) är tillgängliga alternativ för normalisering av mRNA respektive miRNA, men andra gener kan också vara lämpliga beroende på fallet.
  2. Kvantifiera uttrycksnivåerna med delta-delta Ct (2-ΔΔCt) metod20.

8. Reporteranalysen

  1. Celler som används för analysen
    1. Transfektera plasmiderna i HeLa-Cre-celler enligt följande. Transfekt med pTK-Renilla (40 ng), sedan pRD-miR-17-92, genererar HeLa-Cre-miR-17-92 och väljer med 1 μg / ml puromycin.
    2. Transfekt HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla med pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR eller pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, separat. Välj med penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 μg/ml). Dessa transfektioner genererar Luc-RAP-1-B och Luc-scrambled.
    3. Transfektera cellerna med pFLAG-HuR eller tom pFLAG (steg 3).
    4. Fortsätt till cellodling, som beskrivs i steg 2.2., med HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR och HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc tills cirka 80% av sammanflödet. Inducera med 1 μl doxycyklin (1 μg/ml) i 30 minuter vid 37 °C. Håll också alla celler utan doxycyklin som kontroller, under samma period.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av doxycyklin beror på vilken cellinje du väljer. Ett överskott av doxycyklin kan vara giftigt för däggdjursceller.
  2. Självlysande analys
    1. För att kvantifiera och jämföra olika luminiscensintensiteter, använd Dual-luciferase reporter analyssats. Tina luciferasanalyslösningar och lämna dem vid rumstemperatur innan analysen påbörjas.
    2. Förbered blandningen Stop och Glo (blå lockrör) genom att blanda 200 μL av substratet i 10 ml Luciferase Assay Buffer II. Förbered blandningen LAR II (gröna lockrör) genom att blanda 10 ml Luciferase Assay Buffer II i den bärnstensfärgade injektionsflaskan med Luciferase Assay Substrate II och skaka väl.
    3. Överför lösningarna till 15 ml centrifugrör som tidigare identifierats och skyddats från ljus.
      OBS: Som ett alternativ kan lösningarna tidigare framställas i 1-2 ml alikvoter och frysas vid −80 ° C skyddad från ljus i aluminiumfolie.
    4. Utför luminiscensavläsningarna med hjälp av en utrustning som Synergy; mått uttryckt luciferas som relativa ljusenheter (RLU).
    5. Exportera resultaten till ett kalkylblad för ytterligare statistisk analys.
    6. Utför normalisering av firefly-luciferasaktivitet av kontrollen Renilla (luciferase/Renilla) och plotta det som relativa ljusenheter (RLU) i en grafik. Upprepa detta för grupper med och utan doxycyklinininduktion.
    7. Beräkna medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (SEM). Utför en Students t-test eller tvåvägs ANOVA följt av Tukeys eftertest för att möjliggöra gruppjämförelse. Dessa analyser finns tillgängliga i ett paket som GraphPad Prism. Skillnader vid p-värden < 0,05 anses vara signifikanta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår ursprungliga hypotes var att HuR kunde underlätta intronisk miRNA-biogenes genom att binda till dess pre-miRNA-sekvens. Således kan anslutningen av HuR-uttryck och miR-17-92-klusterbiogenes peka på en ny mekanism som styr mognaden av dessa miRNA. Överuttryck av HuR vid transfektion av pFLAG-HuR bekräftades i tre olika cellinjer: HeLa, BCPAP och HEK-293T (figur 2). Som kontroller användes otransfekterade celler och celler transfekterade med tomma pFLAG-vektorer. Viktigt är att vi observerade att HuR-överuttryck i dessa celler stimulerar uttrycket av miR-19a (kompletterande tabell 1-resultat rapporterade i Gatti da Silva et al.9).

För att bekräfta att de inducerade miRNA verkligen var funktionella utformades ett in vitro-reportersystem , som beskrivs här. Den artificiella intronen i pRD-RIPE separerar två kodande regioner av eGFP. Denna kassett är under kontroll av ett tetracyklinresponsivt element (TRE). Uttrycket av eGFP styrs således av närvaron av antibiotikumet doxycyklin (DOX) i cellmediet (figur 3).

En in silico-sökning med miRbase och TargetScan avslöjade möjliga mRNA-mål för miR-19 a och miR-19 b (komponenter i miR-17-92-klustret). Som ett potentiellt mål för båda miRNA valdes sekvensen 5' TTTGCACA 3', som finns i RAP-IB 3' UTR-regionen, (tilläggstabell 2). RAP-IB är en GTPas-medlem i den Ras-associerade proteinfamiljen (RAS). De inducerade miRNA bearbetades korrekt och funktionella i vår analys när den hybridiserades till målsekvensen klonad bredvid luciferas (se figur 3, pmiR-GLO-mål). Därför blockerade den luciferasöversättning, vilket återspeglades i minskad luciferasaktivitet (figur 3). Som en kontroll för denna analys förvrängde vi målsekvensen och ersatte den med 5 'GGGTAAA 3' i Luc-krypterad plasmid (mål- och krypterade sekvenser understryks i oligossekvenserna i materialtabellen).

Under regelbundna förhållanden och utan induktion av pRD-miR-17-92-plasmiden hittade endogen miR-19a och / eller miR-19b målet på pmiR-GLO, vilket ledde till minskad luciferasaktivitet (data visas inte). Efter DOX-tillskott observerades en liten och inte statistiskt signifikant minskning av luciferasaktiviteten i celler med en förvrängd målsekvens. Detta kan bero på närvaron av målsekvenser för andra miRNA i denna sekvens. En stark minskning av luciferasaktiviteten observerades med RAP-IB 3'UTR vid ökat miR-19 a- och miR-19 b-uttryck från pRD-miR-17-92jämfört med HeLa-Cre-celler (se figur 4, jämför orange och svarta staplar). Transfekten av pFLAG-HuR i dessa celler i sig förändrade inte luciferasaktiviteten (se figur 4, jämför grå och svarta staplar). Överuttryck av HuR i kombination med doxycyklintillskott, stimulerande uttryck av miR-17-92-klustret, minskade dock ytterligare luciferasaktiviteten (se figur 4, jämför grå och röda staplar). Detta indikerar en positiv reglering av HuR över miR-19 a och miR-19 b, i kombination med korrekt bearbetning och mognad av dessa miRNA, som framgångsrikt kunde hitta sina mål (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (se figur 4).

Användningen av detta reportersystem bekräftade att HuR inducerar uttryck och korrekt mognad av miR-19 a och miR-19b i HeLa-celler.

Figure 1
Bild 1: En konceptuell översikt över protokollet som beskrivs här. Plasmider innehållande miRNA, målsekvensen, reglerande protein och pTK-Renilla transfekterades i odlade celler. Efter antibiotikaval användes dessa celler för att inducera miRNA-uttryck (med doxycyklin), med efterföljande kvantifiering av luciferasaktivitet och för RNA-analys för att bekräfta HuR-överuttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bekräftelse av FLAG-HuR-överuttryck i (A) HeLa, (B) BCPAP och (C) HEK293T-celler med qPCR. Transfektion med tom pFLAG användes som kontroll (vita staplar). β-aktin användes för att normalisera Ct-värden. Y-axeln representerar vikförändringen av uttrycket beräknat efter normalisering. Felstaplarna representerar standardfel beräknade från tre oberoende mätningar. **P <0,005, ****P < 0,0005 (figur anpassad från Gatti da Silva et al.9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Intronic miRNA-reportersystem. (A) Schematisk representation av pRD-RIPE-plasmiden som genererade pRD-miR-17-92. pre-miR-17-92 sattes in i intronen och var under kontroll av en dox-inducerbar promotor; till höger, pmiR-GLO-plasmiden med RAP-IB 3'UTR-målsekvensen (pmiRGLO-RAP-IB); kontrollen hade den krypterade målsekvensen (pmiRGLO-scrambled). (B) Detalj om sekvensen av pmiRGLO-RAP-IB, med fokus på målsekvensen som kompletterar miR-19 a och miR-19b. Luciferasaktiviteten reduceras vid interaktionen mellan miRNA och målet (figur anpassad från Gatti da Silva et al.9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: HeLa-Cre-celler transfekterades tillsammans med reporterplasmider pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 och pFLAG-HuR. Luciferasaktivitet på otransfekterade HeLa-Cre-celler (svart), HeLa-Cre miR-17-92-förvrängd (vit), HeLa-Cre-HuR (grå), HeLa-Cre miR-17-92-luc (orange) och HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (röd). Luciferasaktiviteten kvantifierades enligt beskrivningen i protokollet som den relativa aktiviteten hos firefly luciferas till Renilla luciferas (observerat med pTK-Renilla) och normaliserades efter tillsats av doxycyklin. Det visas som "relativa ljusenheter" (RLU) på y-axeln. **P < 0,005; P < 0,0005 (figur anpassad från Gatti da Silva et al.9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell 1: Råa Ct-värden observerade för qPCR för att analysera miR-19-uttryck. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 2: RAP-IB 3'UTR-sekvens och miR-19-målsekvens. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pre-mRNA-skarvning är en viktig process för reglering av genuttryck, och dess kontroll kan utlösa starka effekter på cellfenotypiska modifieringar22,23. Mer än 70% av miRNA transkriberas från introner hos människor, och vi antog att deras bearbetning och mognad skulle kunna underlättas genom skarvning av reglerande proteiner24,25. Vi utvecklade en metod för att analysera intronisk miRNA-bearbetning och funktion i odlade celler. Vår analys använder fyra olika plasmider och låter oss testa mognad av endogena och exogena eller inducerade miRNA. Metoden som beskrivs här kan utföras på 2-3 dagar och kräver inte dyra reagenser.

Med tanke på att HuR är ett RNA-bindande protein som är viktigt för mRNA-stabilitet och är immunutfällt med miR-18 och miR-19a miRNAs 17, testade denna analys om den kunde driva intronisk miRNA-biogenes och mognad. HuR finns inte i kärnan av spliceosomer men interagerar med proteiner som är involverade i mRNA-stabilisering26. Konsekvent har överuttryck av HuR associerats med utvecklingen av äggstocks- och blåscancer27,28. I papillära sköldkörtelcancerceller observerade vi att HuR ökar cellproliferation, migration och invasion9. HuR påverkar också mRNA-stabiliteten hos cellcykelregulatorer såsom PTEN, cyklin A2 och cyklin D2, vilket ökar cellproliferation och migration och leder till tumorigena egenskaper 29,30. En betydande del av dessa mRNA har emellertid också målsekvenser för miR-19 a och miR-19b. I synnerhet kan HuR binda till den introniska regionen där dessa miRNA transkriberas, vilket leder till uppfattningen att den kan kontrollera skarvning och mognad av dessa miRNAoch följaktligen förbättra tumorigena egenskaper.

För att testa det utvecklades denna analys med fyra olika plasmider. Den första innehåller miRNA-klustret miR-17-92 infört inuti en intron, och dess uttryck styrs vid doxycyklintillsats. Den andra plasmiden är den kommersiella pmiR-GLO som bär målsekvensen bredvid 3 'av luc2-genen. Bindning av miRNA till denna målsekvens påverkar luc2-uttryck, vilket kan mätas vid en luminiscensanalys. Den tredje plasmiden är pFLAG-HuR, vilket inducerar överuttrycket av detta reglerande protein. Slutligen används pTK-Renilla också för att inkludera Renilla luciferasfluorescens. Våra resultat indikerade att HuR stimulerar miR-17-92-uttryck och ökar associeringen av dess komponenter med målsekvenserna, vilket resulterar i mogna och funktionella miRNA-molekyler. Vi beskriver föreningen av HuR med miRNA i ett annat papper9. Målsekvenserna som användes i denna studie var specifika för miR-19 a och miR-19b miRNA. Denna metod kan dock också anpassas till användningen av kortare eller längre målsekvenser, inklusive flera målplatser. I detta fall måste ospecifik bindning av endogena miRNA till målsekvensen eller sekvenserna i närheten beaktas i analysen. De sekvenser som används kan ha andra möjliga målplatser, vilket kan påverka luciferasaktiviteten. Metoden som beskrivs här kan också användas för att validera olika mål för ett miRNA eller en grupp miRNA som transkriberas tillsammans, vilket möjliggör funktionella studier av miRNA och deras specifika fenotypiska förändringar. Det bör också noteras att det gör att resultaten kan jämföras mellan olika cellinjer och genetiska bakgrunder.

De mest kritiska stegen för en bredare användning av detta protokoll i däggdjursceller är effektiviteten hos transfektions- och induktionsstegen. Eftersom olika plasmider transfekteras in i cellerna är adekvata kontroller också kritiska. Dessa parametrar förändras med plasmidernas storlek och påverkas av den omfattande tiden i cellodling. Därför är en viktig punkt som ska beaktas innan analysen påbörjas den enkla transfektionen av de valda cellerna. Dessutom kan den omfattande användningen av olika antibiotika för att välja för de olika plasmiderna (gentamicin, puromycin och doxycyklin) och aktivera uttrycket vara skadligt för celler och minska effektiviteten hos följande experiment. Det är viktigt att denna analys först optimeras med celler med känd transfektionseffektivitet.

Reportern visade framgångsrikt att ökat HuR-uttryck kunde inducera miRNA-biogenes och bekräftade dess funktionella mognad. Viktigt är att överuttryck av HuR inte påverkade mängden intron som producerades eftersom vi inte observerade minskad luciferasaktivitet i detta tillstånd (figur 4). Ytterligare experiment kan utföras för att karakterisera RBP och miRNA med hjälp av detta reportersystem. Det skulle till exempel vara viktigt att skapa enstaka mutationer i miRNA-sekvenser eller i deras flankerande regioner och analysera effekterna av regulatoriska proteiner i miRNA-biogenes. Detta skulle möjliggöra specifik karakterisering av biogenesen av enskilda miRNA och kan också förbättra kunskapen om konserverade sekvenser för miRNA-bearbetning och mognad.

Vi anser att detta är ett viktigt metodologiskt bidrag till studien av miRNA-biogenes och mognad och rollen av skarvning av reglerande proteiner i dessa processer. Det kan också tillämpas på studier om reglering och kontroll av mRNA och miRNA i olika typer av celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) för HeLa-Cre-cellerna och pRD-RIPE och pCAGGS-Cre plasmider. Vi tackar Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes och Anselmo Moriscot för deras stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Tags

Cancerforskning nummer 184
En reporteranalys för att analysera intronisk mikroRNA-mognad i däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. … More

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter