Summary
イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、真核生物に広く普及している短いRNA分子です。ほとんどのmiRNAはイントロンから転写され、その成熟には核内の異なるRNA結合タンパク質が含まれます。成熟したmiRNAはしばしば遺伝子サイレンシングを媒介し、これは転写後の事象を理解するための重要なツールとなっている。それに加えて、それは遺伝子治療のための有望な方法論として探求することができます。しかしながら、現在、哺乳動物細胞培養物におけるmiRNA発現を評価するための直接的な方法は存在しない。ここでは、標的配列との相互作用の確認を通じてmiRNAの生合成と成熟の決定に役立つ効率的で簡単な方法について説明します。また、このシステムは、一次miRNA(pri-miRNA)転写を高効率かつ低コストで制御することができるドキシサイクリン誘導性プロモーターを用いて、外因性miRNA成熟をその内因性活性から分離することを可能にする。このツールは、別のプラスミド中のRNA結合タンパク質による調節も可能にする。さまざまな異なるmiRNAおよびそれらのそれぞれの標的と共に使用することに加えて、トランスフェクションに順応性がある限り、異なる細胞株に適合させることができる。
Introduction
前駆体mRNAスプライシングは、真核生物1における遺伝子発現調節のための重要なプロセスである。成熟RNA中のイントロンの除去およびエクソンの結合は、スプライソソーム、5つのsnRNA(U1、U2、U4、U5、およびU6)と100以上のタンパク質2,3からなる2メガダルトンリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。スプライシング反応は共転写的に起こり、スプライソソームは、エキソン-イントロン境界およびイントロン4内の保存されたスプライス部位の認識によって導かれて、各新しいイントロンで組み立てられる。異なるイントロンは、スプライソソーム複合体およびその成分の顕著な保存にもかかわらず、異なるスプライシング速度を有する可能性がある。スプライス部位保存の違いに加えて、イントロンおよびエキソンに分布する調節配列は、RNA結合タンパク質(RBP)を誘導し、スプライシングを刺激または抑制することができる5,6。HuRは遍在的に発現するRBPであり、mRNAの安定性を制御する重要な因子である7。我々のグループの以前の結果は、HuRがmiRNAを含むイントロンに結合することができることを示しており、このタンパク質がmiRNAのプロセシングおよび成熟を促進する重要な因子である可能性があり、また、選択的スプライシングアイソフォームの生成につながる可能性があることを示している6,8,9。
多くのマイクロRNA(miRNA)はイントロニック配列からコード化されている。いくつかはイントロンの一部ですが、他のものは「ミルトロン」として知られており、イントロン10,11全体によって形成されています。miRNAは短い非コードRNAであり、長さ12から18〜24ヌクレオチドの範囲である。それらの成熟配列は、mRNA中の標的配列と部分的または全体的な相補性を示し、したがって、翻訳および/またはmRNAの崩壊速度に影響を及ぼす。miRNAと標的の組み合わせは、細胞を異なる結果に駆り立てます。いくつかのmiRNAは、細胞をプロ腫瘍性または抗腫瘍性表現型に駆動することができる13。発癌性miRNAは通常、抑制特性を誘発するmRNAを標的とし、細胞増殖、遊走、および浸潤の増加をもたらす14。一方、腫瘍抑制性miRNAは、発癌性mRNAまたは細胞増殖の増加に関連するmRNAを標的とする可能性がある。
miRNAのプロセシングと成熟は、その起源にも依存します。ほとんどのイントロニックmiRNAは、リボヌクレアーゼDroshaおよびタンパク質補因子12によって形成されるマイクロプロセッサの関与により処理される。ミルトロンは、Drosha15とは無関係にスプライソソームの活性で処理される。イントロン内で見出されるmiRNAの頻度が高いことを考慮して、我々は、スプライシングに関与するRNA結合タンパク質もこれらのmiRNAの処理および成熟を促進する可能性があるという仮説を立てた。特に、RBP hnRNP A2/B1は、マイクロプロセッサおよびmiRNA生合成16と既に関連している。
我々は以前、質量分析によって、hnRNPやHuRなどのいくつかのRNA結合タンパク質がイントロニックmiRNAと関連していることを報告している17。miR-17-92イントロニッククラスターからのmiRNAとのHuR(ELAVL1)の関連は、免疫沈降およびインシリコ分析9を用いて確認された。miR-17-92は、異なる癌において発現が増加した6つのmiRNAからなるイントロニックmiRNAクラスターである18、19。このクラスターは「oncomiR-1」としても知られており、miR-17、miR-18 a、miR-19a、miR-20、miR-19 b、およびmiR-92 aから構成されており、miR-19 aおよびmiR-19bはこのクラスター19の中で最も発癌性の高いmiRNAの1つです。 HuRの発現増加は、miR-19aおよびmiR-19b合成を刺激する9。 このクラスターに隣接するイントロニック領域はHuRと関連していることから、このタンパク質がmiR-19aおよびmiR-19bの発現と成熟を調節できるかどうかを調べる方法を開発しました。我々の仮説の重要な予測の1つは、調節タンパク質として、HuRがmiRNAの生合成を促進し、表現型の変化をもたらす可能性があるということでした。1つの可能性は、miRNAはHuRの刺激によって処理されるが、成熟して機能的ではないため、タンパク質の効果が表現型に直接影響しないことであった。そこで、HuRなどのRBPがイントロニックmiRNAの生合成と成熟に影響を与えるかどうかを調べるスプライシングレポーターアッセイを開発しました。miRNAのプロセシングと成熟を確認することにより、私たちのアッセイは、標的配列との相互作用と成熟した機能的なmiRNAの生成を示しています。私たちのアッセイでは、イントロニックmiRNAクラスターの発現をルシフェラーゼプラスミドと結合させて、培養細胞におけるmiRNA標的結合をチェックします。
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Protocol
ここで説明するプロトコルの概要を 図 1 に示します。
1. プラスミド構築
- pCAGGS-Cre:このプラスミドは、E. Makeyev21博士によって提供された。
- pRD-miR-17-92:
- 0.5 μM の各特異的プライマー(材料表)、150 ng の cDNA、1 mM の dNTP、1x Taq PCR バッファー、および 5 U の高忠実度 Taq DNA ポリメラーゼを使用した PCR により、pre-miR-17-92 を増幅します。テンプレートなしのコントロールPCR反応(cDNAの代わりに水を使用)を実行して、DNA汚染をチェックします。
- PCR産物を、DNAリガーゼを用いてEcoRIとEcoRVの制限部位間のイントロン内のpRD-RIPE21(シンガポールの南洋理工大学E. Makeyev博士提供)21 にリゲートし、pRD-miR-17-92を作成します。サンガーシーケンシングにより配列の完全性を確認します。
- pmiRGLO-RAP-IB
- フォワードプライマーとリバースプライマーを XhoI/XbaI 制限サイトと 1 つの NotI 制限サイトを内部に配置して設計します。等モル量のフォワードプライマーとリバースプライマーを混合し、混合物を90°Cで5分間インキュベートした後、37°Cに15分間移す。対照として、スクランブルされた標的配列を有するプライマーを使用する(材料表)。
- XhoI/XbaI制限酵素を用いてアニールされた断片を切断し、luc2配列の下流でpmiR-GLOにリゲートし、pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR(Luc-RAP-1B)およびpmiRGLO-スクランブル-3ʹ-UTR(Luc-スクランブル)レポーター構築物を生成する。NotI切断によるライゲーションの確認。
メモ:プライマーアニーリング後に作成されたオーバーハングが、切断反応後のベクターと相補的であることを確認してください。
- pFLAG-HuR
- HuR過剰発現プラスミドを生成するには、特定のプライマーでHuR配列を増幅する。300 ng の cDNA、0.5 μM の各特異的プライマー、1 mM の dNTP ミックス、1x PCR バッファー、および 5 U の高忠実度 Taq DNA ポリメラーゼをミックスします。
- PCR産物をpGEM-Tにリゲートし、サンガーシーケンシングによりDNA配列の完全性を確認します。pGEM-TからHuR断片を除去し、それをpFLAG-CMV-3哺乳動物発現ベクターにサブクローニングしてpFLAG-HuRベクターを生成する。
2. 細胞培養
注:HeLa-Cre細胞株はE. Makeyev21博士からの贈り物であり、甲状腺乳頭癌細胞(BCPAP)はMassimo Santoro博士(大学「Federico II」、ナポリ、イタリア)によって親切に提供された。HeLa細胞、甲状腺乳頭癌細胞(BCPAP)、およびHEK-293Tは、HuRを過剰発現するために使用した。
- 特に断りのない限り、10%ウシ胎児血清、1 mMピルビン酸ナトリウム、200 mM L-グルタミン、および1xペニシリン - ストレプトマイシン(100 U / mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)を添加したDMEM/高グルコースで細胞を維持します。細胞を加湿した制御雰囲気のインキュベーター(5%CO2)中で37°Cでインキュベートする。
- 接着細胞をトリプシン/EDTA(0.5%溶液混合物)と共に37°Cで3〜5分間インキュベートする。それらをプレートから剥離させる(潜伏期間は細胞型によって変化し得る)。
- メーカーの指示に従って、脂質ベースのトランスフェクション試薬でトランスフェクションを実行します。細胞培養物が約70%コンフルエントであることを確認します。適切なDNAを添加することにより、以下に説明するように、すべてのトランスフェクションの組み合わせに同様の量のDNAを使用する。反復でトランスフェクション実験を行う。
- 100 μL の培養液に 200 ng の DNA と 1.25 μL のトランスフェクション試薬を混合します。トランスフェクション混合物を細胞に加える。細胞をトランスフェクション混合物と共に37°Cで4時間インキュベートする。 次いで、培地を10%FBSを含む培地と交換し、選択のために抗生物質を添加する前にさらに24時間インキュベートする。
3. HuRの過剰発現
- pFLAG-HuR と空の pFLAG を Hela にトランスフェクトします。ジェネティシン(G418)(1 μg/mL)の濃度を100 μg/mLから1000 μg/mLに増やして細胞を選択し、安定した細胞株を生成します。
- 工程7で説明したように、HuR mRNAに特異的なプライマーを用いた定量的PCRで過剰発現を確認する。
4. 全 RNA 単離
- 新しく集めた細胞を使用してください。70%コンフルエント細胞培養物をトリプシナイズし(このアッセイのために、HeLa−Cre細胞を使用した)、ステップ2.2に記載される。
- 細胞ペレットを4°Cで500 x g で5分間遠心分離して回収し、1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄する。遠心分離を繰り返す。
- 細胞ペレットを1 mLの1x PBSに再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- 4°Cで500 x g で5分間遠心分離する。
- 乾電池ペレットを計量し、それに応じてチューブの体積とサイズを調整します。1mgの細胞は、約1μgの総RNAを産生する。
- フード内で、500-1,000 μLのフェノール/クロロホルムを細胞ペレット(理想的には細胞0.25 gあたり750 μL)に加え、上下にピペッティングして渦と混合することによって均質化します。
- 混合物を室温(20°C〜25°C)で5分間インキュベートし、核タンパク質複合体の完全な解離を可能にする。
- サンプルを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を新しい1.5 mLの微量遠心チューブに移し、使用したフェノール:クロロホルム1 mLあたり200 μLのクロロホルムを加えます。サンプルチューブにしっかりとキャップを掛けます。
- 15秒間(手で、または低速で短時間ボルテックスで)激しく混合し、室温(20°C〜25°C)で2分〜3分間インキュベートする。
- サンプルを12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 下部の赤色フェノール - クロロホルム相、中間相、および無色の上部水相の存在を確認する。RNAは上部水相に留まる。フード内で、水相を収集し、中間相との接触を避け、新鮮なチューブに移す。
- 水相を各チューブ内の分子グレードのイソプロパノール400 μL(フェノール/クロロホルムに対する1:1の比率)および2 μLのグリコーゲンと混合してRNAを沈殿させます(ペレットの存在を視覚化するのに役立ちます)。
- 手で激しく混ぜるか、先端で〜10秒間均質化します。-20°Cで15分間または一晩インキュベートする。
- サンプルを12,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を捨てる。
- 3倍量の100%エタノール(約1mL、DEPC水で希釈)を加えてRNAペレットを洗浄し、ペレットが解放されて底から浮かぶまでボルテックスでサンプルを混合する。
- 7,500 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- 1mLの75%エタノールを加えてRNAペレット1xを洗浄し、ペレットが解放されて底から浮かぶまでボルテックスでサンプルを混合する。ステップ4.17で説明したように遠心分離を繰り返します。
- さらに5秒間の遠心分離スピンを実行して、チューブの側面から残留液体を収集し、ペレットを乱すことなくピペットで残留液体を除去します。
- チューブのキャップを室温で3~5分間開けてRNAペレットを短時間風乾し、RNAペレットをRNase非含有DEPC処理水20~50μLに溶解する。ペレットの再懸濁を容易にするために、RNAを55〜60°Cで10分間インキュベートする。
5. 総RNA濃度と品質の測定
- 分光光度計を用いて260nmおよび280nmにおける吸光度を測定してRNA濃度を求める。ダウンストリームアプリケーションでサンプルを使用する前に、フルスペクトルデータを取得します。
- 0.5X TBEバッファー(45 mM トリス塩基、45 mM ホウ酸、1 mM EDTA)を使用して、1.5% アガロースゲル上で 800 ~ 1000 ng を分割して RNA の品質を制御します。トータルRNAは、28Sおよび18S rRNAを指す2つのバンドに分離する。
- すべての試薬を作り、ゲルの洗浄に使用するすべての機器をDEPC処理水で洗浄します。DEPC処理水は、1000mLの超純水に1mLのジエチルピロカーボネートを加えることによってフード内で調製される。室温または37°Cおよびオートクレーブで〜2時間インキュベートする。室温で最大10ヶ月間保存してください。
注:哺乳類の総RNAの電気泳動は、約2:1の比率で28Sおよび18S rRNAの分離につながります。バンドは無傷で、2つの鋭いバンドとして見えるはずです。分解されたRNAは、ぼやけたバンドをもたらす。
- すべての試薬を作り、ゲルの洗浄に使用するすべての機器をDEPC処理水で洗浄します。DEPC処理水は、1000mLの超純水に1mLのジエチルピロカーボネートを加えることによってフード内で調製される。室温または37°Cおよびオートクレーブで〜2時間インキュベートする。室温で最大10ヶ月間保存してください。
6. 逆転写
- 逆転写反応は総RNA1 μgを用いて設定した。
- 逆転写酵素( 材料表参照)と50ng/μLランダムデカマープライマーを用いて逆転写(RT)を行います。
- RNA、ランダムプライマー、および1 mM dNTP ミックス (10 mM) を 10 μL に混ぜ、65 °C で 5 分間、氷上で 1 分間インキュベートします。1x RT バッファー、5 mM MgCl2、10 mM DTT、40 U の RNase 阻害剤、および 200 U の逆転写酵素の試薬を追加します。
- 25°Cで10分間、50°Cで1時間インキュベートします(異なる酵素を使用すると温度が変わる可能性があります)。85°Cで5分間インキュベートすることにより反応を終了させる。cDNAは−20°Cで保存することができる。
7. 定量PCR
- 15 μL の最終容量で反応を組み立てるには、3 μL の cDNA (100 ng/μL)、3.2 pmol の各プライマー、6 μL の dNTP と酵素を含むマスターミックス、および 2.8 μL の超純水を混合します。
注:HuR mRNAおよびmiRNAの発現レベルを正常化するためのコントロール(ハウスキーピング遺伝子)として内因性構成遺伝子のプライマーを使用してください。β-Actin および snRNA U6 (RNU6B) は、それぞれ mRNA および miRNA の正規化に利用できるオプションですが、ケースによっては他の遺伝子も適している可能性があります。 - デルタデルタCt(2-ΔΔCt)法20を用いて発現レベルを定量する。
レポーターアッセイ
- アッセイに使用した細胞
- 以下のようにしてHeLa-Cre細胞にプラスミドをトランスフェクトする。pTK-ウミシ(40 ng)でトランスフェクトし、次いでpRD-miR-17-92をトランスフェクトし、HeLa-Cre-miR-17-92を生成し、1 μg/mLのピューロマイシンで選択します。
- HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla を pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR または pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR と別々にトランスフェクトします。ペニシリン(100U/mL)とストレプトマイシン(100μg/mL)を用いて選択します。これらのトランスフェクションは、Luc-RAP-1-BおよびLuc-スクランブルを生成する。
- 細胞をpFLAG-HuRまたは空のpFLAGでトランスフェクトする(ステップ3)。
- ステップ2.2で詳述するように、HeLa-Cre miR-17-92-luc、HeLa-Cre miR-17-92-スクランブル、HeLa-Cre miR-17-92-HuR、およびHeLa-Cre miR-17-92-HuR-lucを合流点の約80%になるまで細胞培養に進みます。1 μLのドキシサイクリン(1 μg/mL)を37°Cで30分間誘導する。 また、ドキシサイクリンを含まない全ての細胞を対照として、同じ期間保管する。
注:ドキシサイクリンの最終濃度は、選択した細胞株に依存する。過剰のドキシサイクリンは、哺乳動物細胞に対して毒性であり得る。
- 発光アッセイ
- 異なる発光強度を定量化して比較するには、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキットを使用します。ルシフェラーゼアッセイ溶液を解凍し、アッセイを開始する前に室温で放置する。
- 10 mLのルシフェラーゼアッセイバッファーIIに200 μLの基質を混合することによって、ミックスストップとGlo(ブルーキャップチューブ)を調製する。10 mLのルシフェラーゼアッセイバッファーIIをルシフェラーゼアッセイ基質IIのアンバーバイアルに混合してミックスLAR II(グリーンキャップチューブ)を調製し、よく振とうする。
- 溶液を、以前に識別され、光から保護された15mL遠沈管に移す。
注:代替として、溶液を1〜2mLアリコートで事前に調製し、アルミニウム箔中の光から保護された−80°Cで凍結することができる。 - シナジーなどの機器を使用して発光読み取りを実行します。ルシフェラーゼを相対光単位(RLU)として表した。
- 結果をスプレッドシートにエクスポートして、さらに統計分析します。
- 対照のウミシニラ(ルシフェラーゼ/ウミシニラ)によるホタル - ルシフェラーゼ活性の正規化を実行し、それを相対光単位(RLU)としてグラフィックにプロットする。ドキシサイクリン誘導の有無にかかわらず、これを繰り返します。
- 平均の平均と標準誤差(SEM)を計算します。スチューデントのt検定または二元配置分散分析を実行し、その後にTukeyの事後検定を実行して、グループ比較を可能にします。これらの分析は、GraphPad Prismなどのパッケージで利用できます。p値が0.05<の差は有意であると見なされます。
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Representative Results
私たちの最初の仮説は、HuRがそのプレmiRNA配列に結合することによってイントロニックmiRNA生合成を促進することができるということでした。したがって、HuR発現と miR-17-92クラスター生合成の関連は、これらのmiRNAの成熟を支配する新しいメカニズムを指し示す可能性がある。pFLAG-HuRのトランスフェクション時のHuRの過剰発現は、HeLa、BCPAP、およびHEK-293Tの3つの異なる細胞株で確認された(図2)。対照として、トランスフェクトされていない細胞および空のpFLAGベクターでトランスフェクトされた細胞が用いられた。重要なことに、我々は、これらの細胞におけるHuR過剰発現が miR−19a の発現を刺激することを観察した(Gatti da Silvaらにおいて報告された補足 表1 の結果9)。
誘導されたmiRNAが本当に機能的であることを確認するために、ここで説明するように、 in vitro レポーターシステムを設計した。pRD-RIPEにおける人工イントロンは、eGFPの2つのコード領域を分離する。このカセットは、テトラサイクリン応答素子(TRE)の制御下にある。したがって、eGFPの発現は、細胞培地中の抗生物質ドキシサイクリン(DOX)の存在によって制御される(図3)。
miRbaseとTargetScanを用いたインシリコ検索では、miR-19aおよびmiR-19b(miR-17-92クラスターの構成要素)のmRNA標的の可能性が明らかになった。両方のmiRNAの潜在的な標的として、RAP−IB3'UTR領域上に見出される5'TTTGCACA 3'配列を選択した(補足表2)。RAP-IBは、Ras関連タンパク質ファミリー(RAS)のGTPaseメンバーである。誘導されたmiRNAは、ルシフェラーゼの隣にクローニングされた標的配列にハイブリダイズするため、我々のアッセイにおいて正しくプロセシングされ、機能した(図3、pmiR-GLO標的を参照)。そのため、ルシフェラーゼ翻訳を遮断し、これがルシフェラーゼ活性の低下に反映された(図3)。このアッセイの対照として、我々は標的配列をスクランブルし、Luc-スクランブルプラスミド中の5'GGGTAAA 3'に置き換えた(標的配列およびスクランブル配列は、材料表のオリゴ配列において下線が引かれている)。
通常の条件下で、pRD-miR-17-92プラスミドの誘導なしに、内因性miR-19aおよび/またはmiR-19bはpmiR-GLO上に標的を見つけ、ルシフェラーゼ活性の低下をもたらした(データは示さず)。DOX補充後、スクランブルされた標的配列を有する細胞において、ルシフェラーゼ活性のわずかなかつ統計的に有意ではない低下が観察された。これは、この配列中に他のmiRNAの標的配列が存在することが原因である可能性があります。HeLa-Cre細胞と比較して、pRD-miR-17-92からのmiR-19aおよびmiR-19b発現を増加させた後、RAP-IB 3'UTRでルシフェラーゼ活性の強い低下が観察された(図4、オレンジと黒のバーを比較する)。これらの細胞におけるpFLAG-HuRのトランスフェクション自体は、ルシフェラーゼ活性を変化させなかった(図4、灰色と黒色のバーを比較する参照)。しかしながら、ドキシサイクリン補充と結合したHuRの過剰発現は、miR−17−92クラスターの発現を刺激し、ルシフェラーゼ活性をさらに低下させた(図4参照、灰色および赤色のバーを比較する)。これは、miR-19 aおよびmiR-19bに対するHuRの正の調節と、これらのmiRNAの正しい処理および成熟と相まって、標的(HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc)を首尾よく見つけることができたことを示している(図4参照)。
このレポーターシステムの使用により、HuRがHeLa細胞における miR-19aおよび miR-19bの発現および適切な成熟を誘導することを確認した。
図 1: ここで説明するプロトコルの概念的な概要。 miRNA、標的配列、調節タンパク質、およびpTK−ウミシカを含むプラスミドを培養細胞にトランスフェクトした。抗生物質選択後、これらの細胞をmiRNA発現誘導(ドキシサイクリンによる)、その後のルシフェラーゼ活性の定量、およびHuR過剰発現を確認するためのRNA分析に使用した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:qPCRによる(A)HeLa、(B)BCPAP、および(C)HEK293T細胞におけるFLAG-HuR過剰発現の確認。 空のpFLAGによるトランスフェクションをコントロールとして使用した(白いバー)。βアクチンを使用してCt値を正規化しました。Y 軸は、正規化後に計算された式のフォールド変化を表します。エラーバーは、3つの独立した測定値から計算された標準誤差を表します。**P <0.005, ****P < 0.0005 (Gatti da Silva et al.9 から改作された図)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)pRD-miR-17-92を生成したpRD-RIPEプラスミドの模式図。pre-miR-17-92はイントロンの内部に挿入され、ドックス誘導性プロモーターの制御下にあった。右側に、RAP-IB 3'UTR標的配列を有するpmiR-GLOプラスミド(pmiRGLO-RAP-IB);コントロールは、スクランブルされた標的配列(pmiRGLOスクランブル)を有していた。(b)pmiRGLO-RAP-IBの配列に関する詳細は、miR-19aおよびmiR-19bに相補的な標的配列に着目する。ルシフェラーゼ活性は、miRNAと標的との相互作用により低下する(Gatti da Silvaらから適応された図9)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:HeLa-Cre細胞を、レポータープラスミドpTK-ウミシ、pmiRGLO-RAP-IB、pmiRGLO-スクランブル、pRD-miR-17-92、およびpFLAG-HuRと同時トランスフェクトした。 トランスフェクトされていないHeLa-Cre細胞(黒色)、HeLa-Cre miR-17-92-スクランブル(白色)、HeLa-Cre-HuR(灰色)、HeLa-Cre miR-17-92-luc(オレンジ色)、およびHeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc(赤色)に対するルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケに対するホタルルシフェラーゼの相対活性(pTK−ウミシイタで観察される)としてプロトコールに記載されているように定量し、ドキシサイクリン添加後に正規化した。Y 軸上には「相対光単位」(RLU)として表示されます。**P < 0.005;P < 0.0005 (Gatti da Silva et al.9 から改作された図)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1: miR-19発現を分析するためのqPCRについて観察された生のCt値。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2: RAP-IB 3'UTR配列およびmiR-19標的配列。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プレmRNAスプライシングは遺伝子発現調節のための重要なプロセスであり、その制御は細胞表現型改変に強い効果を引き起こす可能性がある22、23。miRNAの70%以上がヒトのイントロンから転写されており、我々は、調節タンパク質をスプライシングすることによって、それらのプロセシングと成熟を促進することができるという仮説を立てた24,25。培養細胞におけるイントロニックmiRNAのプロセシングと機能を分析する方法を開発しました。私たちのアッセイは4つの異なるプラスミドを使用し、内因性および外因性または誘導性のmiRNAの成熟を試験することを可能にします。ここで説明する方法は、2〜3日で実行することができ、高価な試薬を必要としない。
HuRがmRNA安定性に重要なRNA結合タンパク質であり、miR-18およびmiR-19a miRNA 17で免疫沈降していることを考慮して、このアッセイは、イントロニックmiRNAの生合成および成熟を駆動できるかどうかをテストした。HuRはスプライソソームのコアには見られず、mRNA安定化に関与するタンパク質と相互作用する26。一貫して、HuRの過剰発現は、卵巣癌および膀胱癌の発症と関連している27,28。甲状腺乳頭がん細胞では、HuRが細胞の増殖、遊走、浸潤を増加させることが観察されました9。HuRはまた、PTEN、サイクリンA2、サイクリンD2などの細胞周期調節因子のmRNA安定性にも影響し、細胞の増殖および遊走を増加させ、腫瘍形成特性をもたらす29,30。しかし、これらのmRNAのかなりの部分は、miR-19aおよびmiR-19bの標的配列も有しており、特に、HuRはこれらのmiRNAが転写されるイントロニック領域に結合することができ、これらのmiRNAのスプライシングおよび成熟を制御し、その結果、腫瘍形成機能を増強することができるという概念につながる。
それを試験するために、このアッセイは4つの異なるプラスミドを用いて開発された。1つ目は、イントロン内部に挿入されたmiRNAクラスターmiR-17-92を含み、ドキシサイクリン添加によりその発現が制御される。2番目のプラスミドは、luc2遺伝子の3'の隣に標的配列を保有する市販のpmiR-GLOである。この標的配列へのmiRNAの結合はluc2発現に影響し、これは発光アッセイで測定することができる。第3のプラスミドはpFLAG-HuRであり、これはこの調節タンパク質の過剰発現を誘導する。最後に、pTK−ウミシイタケは、ウミシイタケ蛍光を含むためにも使用される。我々の結果は、HuRがmiR-17-92発現を刺激し、その成分と標的配列との会合を増加させ、したがって成熟した機能的なmiRNA分子をもたらすことを示した。HuRとmiRNAとの関連については、別の論文9で説明しています。本研究で用いた標的配列は、miR-19 aおよびmiR-19b miRNAに特異的であった。しかしながら、この方法は、複数の標的部位を含む、より短いまたはより長い標的配列の使用に適合させることもできる。この場合、標的配列または近くの配列への内因性miRNAの非特異的結合を解析において考慮しなければならない。使用される配列は、ルシフェラーゼ活性に影響を及ぼす可能性のある他の標的部位を有する可能性がある。ここで説明する方法は、一緒に転写されたmiRNAまたはmiRNAのグループの異なる標的を検証するためにも使用され、miRNAおよびそれらの特異的表現型変化の機能的研究を可能にする。また、異なる細胞株および遺伝的背景の間で結果を比較することができることにも留意すべきである。
哺乳動物細胞におけるこのプロトコルのより広範な使用のための最も重要なステップは、トランスフェクションおよび誘導ステップの効率である。異なるプラスミドが細胞内にトランスフェクトされるため、適切なコントロールも重要です。これらのパラメータはプラスミドのサイズによって変化し、細胞培養における広範な時間によって影響を受ける。したがって、アッセイを開始する前に考慮すべき重要な点は、選択された細胞のトランスフェクションの容易さである。さらに、異なるプラスミド(ゲンタマイシン、ピューロマイシン、およびドキシサイクリン)を選択し、発現を活性化するために異なる抗生物質を広範囲に使用すると、細胞に有害であり、以下の実験の効率を低下させる可能性がある。このアッセイは、まず、既知のトランスフェクション効率を持つ細胞で最適化することが重要です。
レポーターは、HuR発現の増加がmiRNAの生合成を誘導できることを首尾よく示し、その機能的成熟を確認した。重要なことに、HuRの過剰発現は、この条件でルシフェラーゼ活性の低下が観察されなかったため、産生されるイントロンの量に影響を及ぼさなかった(図4)。このレポーターシステムを用いてRBPおよびmiRNAを特徴付けるためにさらなる実験を行うことができる。例えば、miRNA配列またはそれらの隣接領域に単一の変異を作成し、miRNAの生合成における調節タンパク質の影響を分析することが重要です。これにより、個々のmiRNAの生合成の特異的な特徴付けが可能になり、miRNAのプロセシングおよび成熟のための保存配列に関する知識も向上する可能性がある。
これは、miRNAの生合成と成熟の研究、およびこれらのプロセスにおける調節タンパク質のスプライシングの役割に対する重要な方法論的貢献であると考えています。また、異なるタイプの細胞におけるmRNAおよびmiRNAの調節および制御に関する研究にも適用され得る。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、HeLa-Cre細胞およびpRD-RIPEおよびpCAGGS-Creプラスミドについて、E. Makeyev(シンガポール南洋理工大学)に感謝している。エドナ・キムラ、カロライナ・パーセル・ゴーズ、ヒセラ・ラモス、ルシア・ロセッティ・ロペス、アンセルモ・モリスコットのサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
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