Summary
我们开发了一种内旋microRNA生物发生报告基因检测方法，用于具有四种质粒 的体外 细胞：一种具有内旋性miRNA，一种具有靶标，一种用于过表达调节蛋白，另一种用于Renilla荧光素酶。miRNA经过处理，可以通过与靶序列结合来控制荧光素酶的表达。
Abstract
微RNA（miRNA）是短RNA分子，在真核生物中广泛存在。大多数miRNA是从内含子转录而来的，它们的成熟涉及细胞核中不同的RNA结合蛋白。成熟的miRNA经常介导基因沉默，这已成为理解转录后事件的重要工具。除此之外，它还可以被探索为一种有前途的基因疗法方法。然而，目前缺乏评估哺乳动物细胞培养物中miRNA表达的直接方法。在这里，我们描述了一种高效而简单的方法，该方法通过确认其与靶序列的相互作用来帮助确定miRNA生物发生和成熟。此外，该系统允许使用多西环素诱导的启动子将外源性miRNA成熟与其内源性活性分离，该启动子能够以高效率和低成本控制初级miRNA（pri-miRNA）转录。该工具还允许在单独的质粒中用RNA结合蛋白进行调节。除了与各种不同的miRNA及其各自的靶标一起使用外，只要这些细胞系适合转染，它还可以适应不同的细胞系。
Introduction
前体mRNA剪接是真核生物1中基因表达调控的重要过程。成熟RNA中内含子的去除和外显子的结合是由剪接体催化的，剪接体是一种2兆达尔顿的核糖核蛋白复合物，由5个snRNA（U1，U2，U4，U5和U6）以及100多个蛋白质2，3组成。剪接反应以共转录方式发生，并且剪接体在每个新内含子处组装，由外显子 - 内含子边界和内含子4内的保守剪接位点的识别引导。不同的内含子可能具有不同的剪接速率，尽管剪接体复合物及其组分具有显着的守恒。除了剪接位点保存的差异外，分布在内含子和外显子上的调节序列可以引导RNA结合蛋白（RBP）并刺激或抑制剪接5，6。HuR是一种普遍表达的RBP，是控制mRNA稳定性7的重要因素。我们小组先前的结果表明，HuR可以与含有miRNA的内含子结合，表明该蛋白可能是促进miRNA加工和成熟的重要因素，也导致产生替代剪接同种型6，8，9。
许多微纳（miRNA）是从内旋序列编码的。虽然有些是内含子的一部分，但其他的被称为“mirtrons”，由整个内含子10，11形成。miRNA是短的非编码RNA，长度为12的18至24个核苷酸。它们的成熟序列与mRNA中的靶序列具有部分或全部互补性，因此影响翻译和/或mRNA衰变率。miRNA和靶标的组合驱动细胞获得不同的结果。几种miRNA可以驱使细胞产生促肿瘤或抗肿瘤表型13。致癌性miRNA通常靶向触发抑制特征的mRNA，导致细胞增殖，迁移和侵袭增加14。另一方面，肿瘤抑制性miRNA可能靶向致癌性mRNA或与细胞增殖增加相关的mRNA。
miRNA的加工和成熟也取决于它们的来源。大多数内源性miRNA是在微处理器的参与下处理的，微处理器由核糖核酸酶Drosha和蛋白质辅助因子12形成。米氏物以剪接体的活性进行加工，独立于Drosha15。考虑到在内含子中发现的miRNA的高频，我们假设参与剪接的RNA结合蛋白也可以促进这些miRNA的加工和成熟。值得注意的是，RBP hnRNP A2 / B1已经与微处理器和miRNA生物发生16相关联。
我们之前已经报道过，几种RNA结合蛋白，如hnRNP和HuR，通过质谱17与内源性miRNA相关。使用免疫沉淀和计算机分析9证实了HuR（ELAVL1）与miR-17-92内旋簇的miRNA的关联。miR-17-92是一种内源性miRNA簇，由6个miRNA组成，在不同癌症中表达增加18，19。该簇也称为“oncomiR-1”，由 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20、miR-19b 和 miR-92a组成。HuR表达的增加刺激了miR-19a和miR-19b合成9。由于该簇两侧的内源性区域与HuR相关，我们开发了一种方法来研究该蛋白是否可以调节miR-19a和miR-19b的表达和成熟。对我们的假设的一个重要预测是，作为一种调节蛋白，HuR可以促进miRNA生物发生，导致表型改变。一种可能性是miRNA是通过HuR的刺激处理的，但不会成熟和功能化，因此，蛋白质的作用不会直接影响表型。因此，我们开发了一种剪接报告基因检测法，以研究像HuR这样的RBP是否会影响内源性miRNA的生物发生和成熟。通过确认miRNA处理和成熟，我们的测定显示了与靶序列的相互作用以及成熟和功能性miRNA的产生。在我们的测定中，我们将内旋性miRNA簇的表达与荧光素酶质粒偶联，以检查培养细胞中的miRNA靶标结合。
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Protocol
图 1 描述了此处描述的协议的概述。
1. 质粒构建
- pCAGGS-Cre：该质粒由E.马凯耶夫博士21提供。
- 17-92：
- 使用每个特定引物的0.5μM（材料表），150 ng的cDNA，1 mM dNTP，1x Taq PCR缓冲液和5 U的高保真Taq DNA聚合酶，通过PCR通过PCR前扩增。执行无模板对照PCR反应（用水代替cDNA）以检查DNA污染。
- 使用DNA连接酶将PCR产物在生态研究所和EcRV限制性位点之间的内含子内加入pRD-RIPE（由新加坡南洋理工大学E.马克耶夫博士提供）21 中，形成pRD-miR-17-92。通过桑格测序确认序列完整性。
- PMIRGLO-RAP-IB
- 设计正向和反向引物，两侧是 XhoI/XbaI 限制性位点，内部有一个 NotI 限制性位点。混合等摩尔量的正向和反向引物，并将混合物在90°C下孵育5分钟，然后转移到37°C下15分钟。作为对照，使用具有加扰目标序列的引物（材料表）。
- 使用 XhoI/XbaI 限制性内切酶切割退火片段，并将它们连接到茂铁 2 序列的下游，生成具有互补性粒细胞增多酶的检测器结构，生成用NotI裂解确认结扎。
注意：确保引物退火后产生的悬垂与裂解反应后的载体互补。
- 普弗拉格-胡尔
- 要生成HuR过度表达的质粒，请用特定的引物扩增HuR序列。混合 300 ng cDNA、0.5 μM 每个特定引物、1 mM dNTP 混合物、1x PCR 缓冲液和 5 U 高保真 Taq DNA 聚合酶。
- 将PCR产物与pGEM-T连接，并通过桑格测序确认DNA序列的完整性。从pGEM-T中取出HuR片段并将其亚克隆成pfLAG-CMV-3哺乳动物表达载体以生成pfLAG-HuR载体。
2. 细胞培养
注：HeLa-Cre细胞系是E.马克耶夫21博士的礼物，甲状腺癌细胞（BCPAP）由马西莫·桑托罗博士（意大利那不勒斯“费德里科二世”大学）提供。使用HeLa细胞，甲状腺状癌细胞（BCPAP）和HEK-293T来过表达HuR。
- 除非另有说明，否则将细胞维持在DMEM/高葡萄糖中，补充10%胎牛血清，1mM丙酮酸钠，200mM L-谷氨酰胺和1x青霉素 - 链霉素（100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素）。将细胞在37°C下在加湿的受控气氛培养箱（5%CO2）中孵育。
- 将贴壁细胞与胰蛋白酶/ EDTA（0.5%溶液混合物）在37°C下孵育3-5分钟。让它们从板中分离（潜伏期可能因细胞类型而异）。
- 按照制造商的说明，使用脂质基转染试剂进行转染。确保细胞培养物约70%汇合。通过添加适当的DNA，对所有转染组合使用相似量的DNA，如下所述。在重复中进行转染实验。
- 将200 ng DNA和1.25μL转染试剂混合在100μL培养基中。将转染混合物加入细胞中。将细胞与转染混合物在37°C下孵育4小时。 然后，用含有10%FBS的培养基替换培养基，并在加入抗生素进行选择之前再孵育24小时。
3. 胡氏硬度过表达
- 将消融阻燃剂-HuR并清空油画颜料放入海拉。通过将遗传素（G418）（1μg/mL）的浓度从100μg/mL增加到1000μg/mL来选择细胞，从而产生稳定的细胞系。
- 使用HuR mRNA的特异性引物进行定量PCR检测以确认过表达，如步骤7中所述。
4. 总核糖核酸分离
- 使用新鲜收集的细胞。胰蛋白酶消化70%汇合的细胞培养物（对于该测定，使用HeLa-Cre细胞），如步骤2.2中所述。
- 通过在4°C下以500× g 离心5分钟收集细胞沉淀，并用1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤;重复离心。
- 将细胞沉淀重悬于1 mL的1x PBS中，并将其转移到1.5 mL微量离心管中。
- 在4°C下以500× g 离心5分钟。
- 称量干细胞沉淀，并相应地调整管的体积和大小。1毫克细胞产生约1微克的总RNA。
- 在罩中，向细胞沉淀中加入500-1，000μL苯酚/氯仿（理想情况下每0.25g细胞750μL），并通过上下移液并与涡流混合使其均质化。
- 将混合物在室温（20°C至25°C）下孵育5分钟，以允许核蛋白复合物完全解离。
- 在4°C下以500× g 离心样品5分钟。
- 将上清液转移到新的1.5 mL微量离心管中，每使用1 mL苯酚：氯仿中加入200μL氯仿。牢固地盖住样品管。
- 剧烈混合15秒（用手或以较低的速度短暂涡旋），并在室温（20°C至25°C）下孵育2分钟至3分钟。
- 在4°C下以12，000× g 离心样品15分钟。
- 检查是否存在下层红色苯酚 - 氯仿相，中间相和无色上层水相。RNA保留在上层水相中。在抽油烟机中，收集水相，避免接触中间相，然后转移到新鲜的管中。
- 通过将水相与400μL分子级异丙醇（与使用的苯酚/氯仿的比例为1：1）和每个管中的2μL糖原混合来沉淀RNA（这将有助于可视化沉淀的存在）。
- 用手剧烈混合或与吸头均匀混合约10秒。在−20°C下孵育15分钟或过夜。
- 在4°C下以12，000× g 离心样品20分钟并弃去上清液。
- 通过加入3体积的100%乙醇（约1mL，用DEPC水稀释）洗涤RNA沉淀，并通过涡旋混合样品，直到沉淀被释放并从底部漂浮。
- 在4°C下以7，500× g 离心5分钟。
- 通过加入1mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀1x，并通过涡旋混合样品，直到沉淀被释放并从底部漂浮。按照步骤4.17中所述重复离心。
- 再进行5秒的离心旋转，以从管子的侧面收集残留液体，并用移液管除去任何残留液体，而不会干扰沉淀。
- 通过在室温下打开管盖3-5分钟将RNA沉淀短暂风干，并将RNA沉淀溶解在20-50μL无RNase DEPC处理的水中。将RNA在55-60°C下孵育10分钟，以促进沉淀的重悬。
5. 总RNA浓度和质量的测定
- 通过使用分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度来确定RNA浓度。在下游应用中使用样品之前，请先获取全光谱数据。
- 通过使用0.5X TBE缓冲液（45 mM Tris碱，45 mM硼酸，1 mM EDTA）在1.5%琼脂糖凝胶上分离800-1000 ng来控制RNA质量。总RNA分为两个条带，分别指28S和18S rRNA。
- 制作所有试剂，并用DEPC处理过的水清洗用于电泳凝胶的所有设备。DEPC处理过的水是在烟罩中加入1 mL碳酸二乙酯到1000 mL超纯水中制备的。在室温或37°C下孵育约2小时并高压灭菌。在室温下储存长达10个月。
注意：哺乳动物总RNA的电泳导致28S和18S rRNA的分离比例约为2：1。条带应完好无损，并可视为两条尖锐条带。降解的RNA会导致条带模糊。
- 制作所有试剂，并用DEPC处理过的水清洗用于电泳凝胶的所有设备。DEPC处理过的水是在烟罩中加入1 mL碳酸二乙酯到1000 mL超纯水中制备的。在室温或37°C下孵育约2小时并高压灭菌。在室温下储存长达10个月。
6. 逆转录
- 使用1μg总RNA设置逆转录反应。
- 使用逆转录酶（见 材料表）和50 ng / μL随机十满物引物进行逆转录（RT）。
- 在10μL中混合RNA，随机引物和1mM dNTP混合物（10mM）。加入以下试剂：1x RT缓冲液，5 mM MgCl2，10 mM DTT，40 U RNase抑制剂和200 U逆转录酶。
- 在25°C下孵育10分钟，在50°C下孵育1小时（如果使用不同的酶，温度可能会发生变化）。通过在85°C下孵育5分钟来终止反应，cDNA可以在-20°C下储存。
7. 荧光定量 PCR
- 为了在15μL的最终体积中组装反应物，混合3μLcDNA（100ng / μL），每个引物的3.2 pmol，含有dNTPs和酶的6μL预混液以及2.8μL超纯水。
注意：使用内源性组成基因的引物作为对照（管家基因），使HuR mRNA和miRNA的表达水平正常化。β-肌动蛋白和 snRNA U6 （RNU6B） 分别是用于 mRNA 和 miRNA 正常化的可用选项，但根据病例，其他基因也可能适用。 - 使用δ-ΔCt （2-ΔΔCt） 方法量化表达水平20。
8. 报告基因检测
- 用于测定的细胞
- 转染HeLa-Cre细胞中的质粒，如下所示。用pTK-雷尼拉（40纳克）转染，然后用pRD-miR-17-92转染，生成海拉-克雷米R-17-92，并选择1μg/mL嘌呤霉素。
- 转染海拉-克雷-米R-17-92-pTK-雷尼拉与吡格洛-RAP-IB-3ʹ-UTR或吡米格洛-加扰-3ʹ-UTR，单独。选择使用青霉素（100 U / mL）和链霉素（100μg / mL）。这些转染产生吕克-RAP-1-B和柳克加扰。
- 用普氏杀伤寒或空振霜转染细胞（步骤3）。
- 如步骤2.2中所述，继续进行细胞培养，用海拉克雷miR-17-92-luc，他拉-克雷miR-17-92-打乱，海拉克雷miR-17-92-HuR和他拉-克雷miR-17-92-胡氏混合，直到大约80%汇合。在37°C下用1μL多西环素（1μg/ mL）诱导30分钟。 此外，在同一时期内保持所有不含多西环素的细胞作为对照。
注意：多西环素的最终浓度取决于所选的细胞系。过量的多西环素可能对哺乳动物细胞有毒。
- 发光检测
- 要量化和比较不同的发光强度，请使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒。解冻荧光素酶测定溶液，并在开始测定之前将其置于室温下。
- 通过在10mL荧光素酶测定缓冲液II中混合200μL底物来制备混合停止和Glo（蓝色盖管）。通过将10mL荧光素酶测定缓冲液II混合到荧光素酶测定底物II的琥珀小瓶中并摇匀来制备混合物LAR II（绿色盖管）。
- 将溶液转移到先前鉴定的15 mL离心管中，并避光。
注意：作为替代方案，溶液可以预先以1-2 mL等分试样制备，并在-80°C下冷冻，以防止在铝箔中避光。 - 使用协同等设备执行发光读数;测量以相对光单位（RLU）表示的荧光素酶。
- 将结果导出到电子表格以进行进一步的统计分析。
- 通过对照雷尼拉（荧光素酶/雷尼拉）对萤火虫 - 荧光素酶活性进行归一化，并在图形中将其绘制为相对光单位（RLU）。对有和不联合多西环素诱导的组重复上述步骤。
- 计算均值和标准误 （SEM）。执行学生的 t 检验或双向方差分析，然后执行 Tukey 的后检验，以便进行组比较。这些分析以图形板等软件包形式提供。p 值 < 0.05 时的差异被视为显著。
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Representative Results
我们最初的假设是，HuR可以通过与其前miRNA序列结合来促进内源性miRNA生物发生。因此，HuR表达与miR-17-92簇生物发生的联系可能指向控制这些miRNA成熟的新机制。在三种不同的细胞系中证实了转染PFLAG-HuR时胡氏环氧铈的过表达：HeLa，BCPAP和HEK-293T（图2）。作为对照，使用未转染的细胞和用空的pfLAG载体转染的细胞。重要的是，我们观察到这些细胞中的HuR过表达刺激miR-19a的表达（Gatti da Silva等人报告了补充表1结果9）。
为了确认诱导的miRNA确实具有功能性，设计了体 外 报告系统，如下所述。pRD-RIPE中的人工内含子将eGFP的两个编码区域分开。该盒由四环素响应元件（TRE）控制。因此，eGFP的表达由细胞培养基中抗生素多西环素（DOX）的存在控制（图3）。
使用miR碱基和目标扫描进行计算机搜索揭示了miR-19 a和miR-19b（miR-17-92簇的组分）的可能的mRNA靶标。作为两种miRNA的潜在靶标，选择了在RAP-IB 3'UTR区域发现的序列5'TTTGCACA 3'（补充表2）。抗坏血酸-IB是抗坏血酸相关蛋白家族 （RAS） 的 GTP 酶成员。诱导的miRNA在我们的测定中得到了正确的处理和功能，因为它与在荧光素酶旁边克隆的靶序列杂交（参见图3，pmiR-GLO靶标）。因此，它阻断了荧光素酶的翻译，这反映在荧光素酶活性降低（图3）。作为该测定的对照，我们扰乱了目标序列，将其替换为Luc-scrazed质粒中的5' GGGTAAA 3'（目标序列和加扰序列在材料表中的寡核苷酸序列中加下划线）。
在正常条件下，在没有诱导pRD-miR-17-92质粒的情况下，内源性miR-19a和/或miR-19b在pmiR-GLO上发现了靶标，这导致荧光素酶活性降低（数据未显示）。在补充DOX后，在具有扰乱目标序列的细胞中观察到荧光素酶活性的轻微且无统计学意义的降低。这可能是由于该序列中存在其他miRNA的靶序列。与HeLa-Cre细胞相比，在pRD-miR-17-92的miR-19a和miR-19b表达增加时，RAP-IB 3'UTR观察到荧光素酶活性的显着降低（见图4，比较橙色和黑色条）。pFLAG-HuR在这些细胞中的转染本身并没有改变荧光素酶的活性（见图4，比较灰色和黑色条）。然而，HuR的过表达加上多西环素的补充，刺激miR-17-92簇的表达，进一步降低荧光素酶活性（见图4，比较灰色和红色条）。这表明HuR在miR-19 a和miR-19b上具有积极的调节，再加上这些miRNA的正确处理和成熟，它们能够成功找到它们的靶标（HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc）（见图4）。
该报告系统的使用证实了HuR在HeLa细胞中诱导 miR-19a和 miR-19b的表达和适当成熟。
图 1：此处描述的协议的概念性概述。 在培养的细胞中转染含有miRNA，靶序列，调节蛋白和pTK-Renilla的质粒。选择抗生素后，这些细胞用于诱导miRNA表达（使用多西环素），随后定量荧光素酶活性，并进行RNA分析以确认HuR过表达。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：通过 qPCR 确认 （A） 肝素、（B） 白细胞和 （C） HEK293T 细胞中标记 HuR 过表达。 使用空的PFLAG转染作为对照（白条）。β肌动蛋白用于规范化 Ct 值。y 轴表示归一化后计算的表达式的折叠变化。误差线表示通过三个独立测量计算的标准误差。**P <0.005， ****P < 0.0005（图改编自加蒂·达席尔瓦等人9）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：（A）生成pRD-miR-17-92的pRD-RIPE质粒的示意图。前miR-17-92入内含子内部，并在Dox诱导的启动子的控制下;在右侧，具有RAP-IB 3'UTR靶序列的 PMIR-GLO 质粒 （对照组具有加扰的目标序列（pmiRGLO加扰）。（B）关于吡咯荧光素酶活性在miRNA和靶标相互作用时降低（图改编自Gatti da Silva等人9）。请点击此处查看此图的大图。
图4：将HeLa-Cre细胞与报告基因质粒pTK-雷尼拉，吡米格鲁-RAP-IB，吡米格鲁加扰，pRD-miR-17-92和pFLAG-HuR共转染。 未转染的海拉克雷细胞（黑色），肝素酶miR-17-92-打乱（白色），肝素酶-胡氏环化（灰色），海拉-克雷米R-17-92-露克（橙色）和海拉克雷米R-17-92-胡氏菌（红色）的活性。荧光素酶活性按照方案中所述进行定量，作为萤火虫荧光素酶与雷尼拉荧光素酶（用pTK-Renilla观察到）的相对活性，并在多西环素添加后恢复正常。它在 y 轴上显示为“相对光单位”（RLU）。**P < 0.005;P <0.0005（图改编自加蒂·达席尔瓦等人9）。 请点击此处查看此图的大图。
附表1： 观察到qPCR的原始Ct值以分析miR-19表达。 请按此下载此表格。
附表2： 雷达波-IB 3'UTR 序列和 miR-19 靶序列。 请按此下载此表格。
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Discussion
前mRNA剪接是基因表达调控的重要过程，其控制可以触发对细胞表型修饰的强烈影响22，23。超过70%的miRNA是从人类内含子转录而来的，我们假设它们的加工和成熟可以通过剪接调节蛋白24，25来促进。我们开发了一种分析内源性miRNA处理和功能的方法。我们的测定使用四种不同的质粒，并允许我们测试内源性和外源性或诱导的miRNA的成熟。这里描述的方法可以在2-3天内进行，并且不需要昂贵的试剂。
考虑到HuR是一种对mRNA稳定性很重要的RNA结合蛋白，并且由 miR-18 和 miR-19a miRNA17免疫沉淀，该测定测试了它是否可以驱动内源性miRNA生物发生和成熟。HuR不在剪接体的核心中发现，但与参与mRNA稳定26的蛋白质相互作用。一致，HuR的过表达与卵巢癌和膀胱癌的发展有关27，28.在甲状腺状癌细胞中，我们观察到HuR增加细胞增殖，迁移和侵袭9。HuR还影响细胞周期调节剂如PTEN，细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白D2的mRNA稳定性，增加细胞增殖和迁移并导致致瘤特征29，30。然而，这些mRNA的很大一部分也具有 miR-19a和 miR-19b的靶序列，值得注意的是，HuR可以结合到转录这些miRNA的内源性区域，从而导致它可以控制这些miRNA的剪接和成熟，从而增强肿瘤特征。
为了测试这一点，该测定法是用四种不同的质粒开发的。第一个包含插入内含子内的miRNA簇 miR-17-92 ，其表达在多西环素添加时受到控制。第二个质粒是商业pmiR-GLO，携带紧挨着luc2基因3'的靶序列。miRNA与该靶序列的结合会影响luc2的表达，这可以在发光测定中测量。第三个质粒是pfLAG-HuR，它诱导这种调节蛋白的过表达。最后，pTK-雷尼拉也用于包括雷尼拉荧光素酶荧光。结果表明，HuR刺激 miR-17-92 表达，增加其组分与靶序列的缔合，从而产生成熟和功能性的miRNA分子。我们在另一篇论文9中描述了HuR与miRNA的关联。本研究中使用的靶序列对 miR-19a和 miR-19bmiRNA具有特异性。然而，这种方法也可以适应于使用更短或更长的目标序列，包括多个目标位点。在这种情况下，在分析中必须考虑内源性miRNA与靶序列或附近序列的非特异性结合。所使用的序列可能具有其他可能的靶位点，这可能会影响荧光素酶的活性。这里描述的方法也可用于验证一个miRNA或一组miRNA转录在一起的不同靶标，从而能够对miRNA及其特定的表型改变进行功能研究。还应该注意的是，它允许在不同的细胞系和遗传背景之间比较结果。
在哺乳动物细胞中更广泛地使用该方案的最关键步骤是转染和诱导步骤的效率。由于不同的质粒被转染到细胞中，因此充分的控制也至关重要。这些参数随质粒的大小而变化，并受到细胞培养中长时间的影响。因此，在开始测定之前要考虑的一个重要问题是所选细胞的易转染性。此外，广泛使用不同的抗生素来选择不同的质粒（庆大霉素、嘌呤霉素和多西环素）并激活表达可能对细胞有害并降低以下实验的效率。重要的是，该测定首先使用具有已知转染效率的细胞进行优化。
记者成功证明，增加HuR表达可以诱导miRNA生物发生，并证实了其功能成熟。重要的是，HuR的过表达不会影响内含子的产生量，因为我们在这种情况下没有观察到荧光素酶活性降低（图4）。可以使用该报告系统进行进一步的实验来表征RBP和miRNA。例如，在miRNA序列或其侧翼区域中创建单个突变并分析调节蛋白在miRNA生物发生中的影响非常重要。这将允许对单个miRNA的生物发生进行特异性表征，还可以改善对miRNA处理和成熟的保守序列的了解。
我们认为这是对研究miRNA生物发生和成熟以及剪接调节蛋白在这些过程中的作用的重要方法学贡献。它也可以应用于不同类型细胞中mRNA和miRNA的调控和控制的研究。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢E.马凯耶夫（新加坡南洋理工大学）的海拉克雷细胞和pRD-RIPE和pCAGGS-Cre质粒。我们感谢埃德娜·木村、卡罗琳娜·珀塞尔·戈伊斯、吉塞拉·拉莫斯、露西亚·罗塞蒂·洛佩斯和安塞尔莫·莫里斯科特的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
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| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
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| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
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| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
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| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
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| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
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| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
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| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
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