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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Abstract

Les microARN (miARN) sont des molécules d’ARN courtes qui sont répandues chez les eucaryotes. La plupart des miARN sont transcrits à partir d’introns, et leur maturation implique différentes protéines de liaison à l’ARN dans le noyau. Les miARN matures interviennent fréquemment dans le silençage génique, ce qui est devenu un outil important pour comprendre les événements post-transcriptionnels. En outre, il peut être exploré comme une méthodologie prometteuse pour les thérapies géniques. Cependant, il existe actuellement un manque de méthodes directes pour évaluer l’expression des miARN dans les cultures de cellules de mammifères. Ici, nous décrivons une méthode efficace et simple qui aide à déterminer la biogenèse et la maturation des miARN en confirmant son interaction avec les séquences cibles. En outre, ce système permet de séparer la maturation exogène du miARN de son activité endogène à l’aide d’un promoteur inductible par la doxycycline capable de contrôler la transcription primaire des miARN (pri-miARN) avec une efficacité élevée et un faible coût. Cet outil permet également la modulation avec des protéines de liaison à l’ARN dans un plasmide séparé. En plus de son utilisation avec une variété de miARN différents et leurs cibles respectives, il peut être adapté à différentes lignées cellulaires, à condition que celles-ci se prêtent à la transfection.

Introduction

L’épissage précurseur de l’ARNm est un processus important pour la régulation de l’expression génique chez les eucaryotes1. L’élimination des introns et l’union des exons dans l’ARN mature sont catalysées par le spliceosome, un complexe ribonucléoprotéique de 2 mégadaltons composé de 5 ARNn (U1, U2, U4, U5 et U6) ainsi que de plus de 100 protéines 2,3. La réaction d’épissage se produit co-transcriptionnellement, et le splicéosome est assemblé à chaque nouvel intron guidé par la reconnaissance des sites d’épissage conservés aux limites exon-intron et à l’intérieur de l’intron4. Différents introns peuvent avoir des taux d’épissage différents malgré la conservation remarquable du complexe spliceosome et de ses composants. En plus des différences dans la conservation du site d’épissage, les séquences régulatrices réparties sur les introns et les exons peuvent guider les protéines de liaison à l’ARN (RBP) et stimuler ou réprimer l’épissage 5,6. HuR est un RBP omniprésent et est un facteur important pour contrôler la stabilité de l’ARNm7. Les résultats antérieurs de notre groupe ont montré que HuR peut se lier aux introns contenant des miARN, ce qui indique que cette protéine pourrait être un facteur important pour faciliter le traitement et la maturation des miARN, conduisant également à la génération d’isoformes d’épissage alternatives 6,8,9.

De nombreux microARN (miARN) sont codés à partir de séquences introniques. Alors que certains font partie de l’intron, d’autres sont connus sous le nom de « mirtrons » et sont formés par l’intron entier10,11. Les miARN sont de courts ARN non codants, allant de 18 à 24 nucléotides de longueur12. Leur séquence mature montre une complémentarité partielle ou totale avec les séquences cibles dans les ARNm, affectant ainsi les taux de translation et/ou de désintégration de l’ARNm. Les combinaisons de miARN et de cibles conduisent la cellule à des résultats différents. Plusieurs miARN peuvent conduire les cellules à des phénotypes pro- ou anti-tumoraux13. Les miARN oncogènes ciblent généralement les ARNm qui déclenchent une caractéristique suppressive, entraînant une augmentation de la prolifération, de la migration et de l’invasioncellulaires 14. D’autre part, les miARN suppresseurs de tumeurs pourraient cibler les ARNm oncogènes ou les ARNm liés à une prolifération cellulaire accrue.

Le traitement et la maturation des miARN dépendent également de leur origine. La plupart des miARN introniques sont traités avec la participation du microprocesseur, formé par la ribonucléase Drosha et les cofacteurs protéiques12. Les mirtrons sont traités avec l’activité du spliceosome indépendamment de Drosha15. Compte tenu de la fréquence élevée des miARN trouvés dans les introns, nous avons émis l’hypothèse que les protéines de liaison à l’ARN impliquées dans l’épissage pourraient également faciliter le traitement et la maturation de ces miARN. Notamment, le RBP hnRNP A2/B1 a déjà été associé au microprocesseur et à la biogenèsemiARN 16.

Nous avons déjà signalé que plusieurs protéines de liaison à l’ARN, telles que hnRNP et HuR, sont associées aux miARN introniques par spectrométriede masse 17. L’association de HuR (ELAVL1) avec les miARN de l’amas intronique miR-17-92 a été confirmée par immunoprécipitation et analyse in silico 9. miR-17-92 est un amas de miARN introniques composé de six miARN avec une expression accrue dans différents cancers18,19. Ce groupe est également connu sous le nom de « oncomiR-1 » et est composé de miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b et miR-92 a. miR-19 a et miR-19b sont parmi les miARN les plus oncogènes de ce groupe 19. L’expression accrue de HuR stimule la synthèse miR-19a et miR-19b 9. Étant donné que les régions introniques flanquant ce groupe sont associées à HuR, nous avons développé une méthode pour déterminer si cette protéine pouvait réguler l’expression et la maturation de miR-19a et miR-19b. Une prédiction importante de notre hypothèse était que, en tant que protéine régulatrice, HuR pourrait faciliter la biogenèse des miARN, conduisant à des altérations phénotypiques. Une possibilité était que les miARN étaient traités par la stimulation de HuR mais ne seraient pas matures et fonctionnels et, par conséquent, les effets de la protéine n’auraient pas d’impact direct sur le phénotype. Par conséquent, nous avons développé un test de rapporteur d’épissage pour déterminer si une RBP telle que HuR pouvait affecter la biogenèse et la maturation d’un miARN intronique. En confirmant le traitement et la maturation des miARN, notre test montre l’interaction avec la séquence cible et la génération d’un miARN mature et fonctionnel. Dans notre essai, nous couplons l’expression d’un groupe de miARN intronique avec un plasmide luciférase pour vérifier la liaison à la cible du miARN dans les cellules en culture.

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Protocol

Une vue d’ensemble du protocole décrit ici est illustrée à la figure 1.

1. Construction plasmidique

  1. pCAGGS-Cre: Ce plasmide a été fourni par le Dr E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Amplifier le pré-miR-17-92 par PCR en utilisant 0,5 μM de chaque amorce spécifique (Tableau des matériaux), 150 ng d’ADNc, 1 mM de dNTP, 1x tampon Taq PCR et 5 U d’ADN polymérase Taq haute fidélité. Effectuer une réaction PCR de contrôle sans gabarit (utiliser de l’eau au lieu de l’ADNc) pour vérifier la contamination de l’ADN.
    2. Liférer le produit PCR en pRD-RIPE (aimablement fourni par le Dr E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapour)21 à l’intérieur de l’intron entre les sites de restriction EcoRI et EcoRV en utilisant l’ADN ligase, créant pRD-miR-17-92. Confirmez l’intégrité de la séquence par séquençage de Sanger.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. Concevez des amorces avant et arrière flanquées de sites de restriction XhoI/XbaI et d’un site de restriction NotI à l’intérieur. Mélanger des quantités équimolaires d’amorces avant et arrière et incuber le mélange à 90 °C pendant 5 min, puis transférer à 37 °C pendant 15 min. Comme témoins, utilisez des amorces avec des séquences cibles brouillées (Table des matériaux).
    2. Cliver les fragments recuits à l’aide d’enzymes de restriction XhoI/XbaI et les ligaturer en aval de la séquence luc2 dans pmiR-GLO, générant des constructions de rapporteur pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) et pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Confirmer la ligature avec le décolleté NotI.
      NOTE: Assurez-vous que les porte-à-faux créés après le recuit de l’apprêt sont complémentaires du vecteur après réaction de clivage.
  4. pFLAG-HuR
    1. Pour générer un plasmide de surexpression HuR, amplifiez la séquence HuR avec des amorces spécifiques. Mélanger 300 ng d’ADNc, 0,5 μM de chaque amorce spécifique, 1 mM de mélange de dNTP, 1x tampon PCR et 5 U d’ADN polymérase Taq haute fidélité.
    2. Libeller le produit PCR en pGEM-T et confirmer l’intégrité de la séquence d’ADN par séquençage de Sanger. Retirez le fragment HuR de pGEM-T et sous-clonez-le dans le vecteur d’expression de mammifère pFLAG-CMV-3 pour générer le vecteur pFLAG-HuR.

2. Culture cellulaire

NOTE: La lignée cellulaire HeLa-Cre était un cadeau du Dr E. Makeyev21, et la cellule papillaire du cancer de la thyroïde (BCPAP) a été aimablement fournie par le Dr Massimo Santoro (Université « Federico II », Naples, Italie). La cellule HeLa, la cellule papillaire du cancer de la thyroïde (BCPAP) et HEK-293T ont été utilisées pour surexprimer HuR.

  1. Maintenir les cellules dans du DMEM/hyperglycémie supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 mM de pyruvate de sodium, 200 mM de L-glutamine et 1x pénicilline-streptomycine (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine) dans des boîtes de Petri de 100 mm, sauf indication contraire. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à atmosphère contrôlée (5% CO2).
  2. Incuber les cellules adhérentes avec de la trypsine/EDTA (mélange de solution à 0,5 %) à 37 °C pendant 3 à 5 min. Laissez-les se détacher de la plaque (la période d’incubation peut varier selon le type de cellule).
  3. Effectuer des transfections avec un réactif de transfection à base de lipides en suivant les instructions du fabricant. Assurez-vous que les cultures cellulaires sont confluentes à environ 70 %. Utilisez des quantités similaires d’ADN pour toutes les combinaisons de transfection, comme décrit ci-dessous, en ajoutant les ADN appropriés. Effectuer des expériences de transfection dans des répliques.
    1. Mélanger 200 ng d’ADN et 1,25 μL de réactif de transfection dans 100 μL du milieu de culture. Ajouter le mélange de transfection aux cellules. Incuber les cellules avec les mélanges de transfection pendant 4 h à 37 °C. Ensuite, remplacez le milieu par un milieu contenant 10% de FBS et incuber pendant 24 heures supplémentaires avant d’ajouter les antibiotiques pour la sélection.

3. Surexpression de HuR

  1. Transfectez pFLAG-HuR et videz pFLAG dans HeLa. Sélectionner les cellules en augmentant la concentration de génétique (G418) (1 μg/mL) de 100 μg/mL à 1000 μg/mL, générant des lignées cellulaires stables.
  2. Confirmer la surexpression par PCR quantitative à l’aide d’amorces spécifiques pour l’ARNm HuR, comme décrit à l’étape 7.

4. Isolement total de l’ARN

  1. Utilisez des cellules fraîchement collectées. Trypsiniser 70% des cultures cellulaires confluentes (pour ce test, des cellules HeLa-Cre ont été utilisées), comme décrit à l’étape 2.2.
  2. Recueillir la pastille cellulaire par centrifugation pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et la laver avec 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate); Répétez la centrifugation.
  3. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de 1x PBS et transférez-la dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
  4. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C.
  5. Pesez la pastille sèche et ajustez les volumes et la taille des tubes en conséquence. 1 mg de cellules donne environ 1 μg d’ARN total.
  6. Dans une hotte, ajoutez 500 à 1 000 μL de phénol/chloroforme à la pastille cellulaire (idéalement 750 μL par 0,25 g de cellules) et homogénéisez-la en pipetant de haut en bas et en mélangeant avec le vortex.
  7. Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante (20 °C à 25 °C) pour permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques.
  8. Centrifuger l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  9. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL et ajouter 200 μL de chloroforme par 1 mL de phénol:chloroforme utilisé. Boucher solidement les tubes d’échantillon.
  10. Mélanger vigoureusement pendant 15 s (à la main ou en tourbillonnant brièvement à une vitesse inférieure) et incuber à température ambiante (20 °C à 25 °C) pendant 2 min à 3 min.
  11. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  12. Vérifiez la présence d’une phase phénol-chloroforme rouge inférieure, d’une phase intermédiaire et d’une phase aqueuse supérieure incolore. L’ARN reste dans la phase aqueuse supérieure. Dans une hotte, recueillir la phase aqueuse, en évitant d’entrer en contact avec la phase intermédiaire, et transférer dans un tube frais.
  13. Précipiter l’ARN en mélangeant la phase aqueuse avec 400 μL d’isopropanol de qualité moléculaire (rapport 1:1 au phénol/chloroforme utilisé) et 2 μL de glycogène dans chaque tube (cela aidera à visualiser la présence de la pastille).
  14. Mélanger vigoureusement à la main ou homogénéiser avec l’embout pendant ~10 s. Incuber pendant 15 min ou toute la nuit à −20 °C.
  15. Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C et éliminer le surnageant.
  16. Laver la pastille d’ARN en ajoutant 3 volumes d’éthanol à 100 % (environ 1 mL, dilué avec de l’eau DEPC) et mélanger l’échantillon en tourbillonnant jusqu’à ce que la pastille soit libérée et flotte du fond.
  17. Centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  18. Lavez la pastille d’ARN 1x en ajoutant 1 mL d’éthanol à 75% et mélangez l’échantillon par vortex jusqu’à ce que la pastille soit libérée et flotte du fond. Répétez la centrifugation comme décrit à l’étape 4.17.
  19. Effectuer un essorage de centrifugation supplémentaire de 5 s pour recueillir le liquide résiduel du côté du tube et éliminer tout liquide résiduel avec une pipette sans perturber la pastille.
  20. Sécher brièvement à l’air la pastille d’ARN en ouvrant le bouchon du tube à température ambiante pendant 3 à 5 minutes et dissoudre la pastille d’ARN dans 20 à 50 μL d’eau traitée au DEPC sans RNase. Incuber l’ARN pendant 10 min à 55-60 °C pour faciliter la remise en suspension de la pastille.

5. Détermination de la concentration et de la qualité de l’ARN total

  1. Déterminer la concentration d’ARN en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Obtenir des données spectrales complètes avant d’utiliser les échantillons dans des applications en aval.
  2. Contrôler la qualité de l’ARN en résolvant 800-1000 ng sur un gel d’agarose à 1,5% à l’aide d’un tampon de TBI 0,5X (45 mM Tris base, 45 mM d’acide borique, 1 mM d’EDTA). L’ARN total se sépare en deux bandes se référant aux ARNr 28S et 18S.
    1. Fabriquez tous les réactifs et lavez tout l’équipement utilisé pour faire fonctionner le gel avec de l’eau traitée au DEPC. L’eau traitée au DEPC est préparée dans la hotte en ajoutant 1 mL de diéthylpyrocarbonate à 1000 mL d’eau ultra-pure. Incuber pendant ~2 h à température ambiante ou à 37 °C et autoclaver. Conserver à température ambiante jusqu’à 10 mois.
      NOTE: L’électrophorèse des ARN totaux des mammifères conduit à la séparation des ARNr 28S et 18S dans un rapport d’environ 2:1. Les bandes doivent être intactes et visibles comme deux bandes pointues. L’ARN dégradé entraînera des bandes floues.

6. Transcription inverse

  1. Définir la réaction de transcription inverse en utilisant 1 μg d’ARN total.
  2. Effectuer la transcription inverse (RT) en utilisant l’enzyme de transcriptase inverse (voir le tableau des matériaux) et des amorces de décamer aléatoire de 50 ng/μL.
    1. Mélanger l’ARN, les amorces aléatoires et le mélange de dNTP de 1 mM (10 mM) dans 10 μL. Incuber à 65 °C pendant 5 min et sur glace pendant 1 min. Ajouter les réactifs suivants : 1x tampon RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U d’inhibiteur de RNase et 200 U de transcriptase inverse.
    2. Incuber pendant 10 min à 25 °C et pendant 1 h à 50 °C (les températures peuvent changer si différentes enzymes sont utilisées). Mettre fin à la réaction en incubant à 85 °C pendant 5 min. Les ADNc peuvent être stockés à −20 °C.

7. PCR quantitative

  1. Pour assembler la réaction dans un volume final de 15 μL, mélanger 3 μL d’ADNc (100 ng/μL), 3,2 pmol de chaque amorce, 6 μL de mélange maître contenant les dNTP et l’enzyme, et 2,8 μL d’eau ultrapure.
    REMARQUE : Utiliser des amorces pour les gènes constitutifs endogènes comme témoins (gènes ménagers) pour normaliser les niveaux d’expression de l’ARNm HuR et des miARN. β-actine et snRNA U6 (RNU6B) sont des options disponibles pour la normalisation des ARNm et des miARN, respectivement, mais d’autres gènes pourraient également convenir selon le cas.
  2. Quantifier les niveaux d’expression à l’aide de la méthode delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.

8. Le test rapporteur

  1. Cellules utilisées pour le test
    1. Transfecter les plasmides dans les cellules HeLa-Cre comme suit. Transfect avec pTK-Renilla (40 ng), puis pRD-miR-17-92, générant HeLa-Cre-miR-17-92, et sélectionnant avec 1 μg/mL de puromycine.
    2. Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla avec pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR ou pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, séparément. Choisissez en utilisant la pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (100 μg/mL). Ces transfections génèrent Luc-RAP-1-B et Luc-scrambled.
    3. Transfectez les cellules avec pFLAG-HuR ou pFLAG vide (étape 3).
    4. Procéder à la culture cellulaire, comme détaillé à l’étape 2.2., avec HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-brouillé, HeLa-Cre miR-17-92-HuR et HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc jusqu’à environ 80% de confluence. Induire avec 1 μL de doxycycline (1 μg/mL) pendant 30 min à 37 °C. Aussi, gardez toutes les cellules sans doxycycline comme témoins, pour la même période.
      NOTE: La concentration finale de doxycycline dépend de la lignée cellulaire choisie. Un excès de doxycycline peut être toxique pour les cellules de mammifères.
  2. Dosage luminescent
    1. Pour quantifier et comparer différentes intensités de luminescence, utilisez le kit de test Dual-luciferase reporter. Décongeler les solutions de dosage de la luciférase et les laisser à température ambiante avant de commencer l’essai.
    2. Préparer le mélange Stop et Glo (tubes à chapeau bleu) en mélangeant 200 μL du substrat dans 10 mL de Luciferase Assay Buffer II. Préparer le mélange LAR II (tubes à capuchon vert) en mélangeant 10 ml de Luciferase Assay Buffer II dans le flacon ambré de Luciferase Assay Substrate II et bien agiter.
    3. Transférer les solutions dans des tubes centrifugés de 15 mL préalablement identifiés et protégés de la lumière.
      REMARQUE : Comme alternative, les solutions peuvent être préalablement préparées dans des aliquotes de 1 à 2 mL et congelées à -80 °C à l’abri de la lumière dans du papier d’aluminium.
    4. Effectuer les lectures de luminescence à l’aide d’un équipement tel que Synergy; mesure exprimée en luciférase en unités de lumière relative (RLU).
    5. Exportez les résultats vers une feuille de calcul pour une analyse statistique plus approfondie.
    6. Effectuer la normalisation de l’activité des luciférases par le contrôle Renilla (luciférase/Renilla) et tracer cela en tant qu’unités de lumière relative (RLU) dans un graphique. Répétez cette opération pour les groupes avec et sans induction de doxycycline.
    7. Calculer la moyenne et l’erreur-type de la moyenne (MEB). Effectuez le test t ou l’ANOVA bidirectionnelle d’un étudiant suivi du post-test de Tukey pour permettre une comparaison de groupe. Ces analyses sont disponibles dans un package tel que GraphPad Prism. Les différences à des valeurs p < 0,05 sont considérées comme significatives.

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Representative Results

Notre hypothèse initiale était que HuR pourrait faciliter la biogenèse intronique des miARN en se liant à sa séquence pré-miARN. Ainsi, la connexion de l’expression de HuR et de la biogenèse des amas miR-17-92 pourrait indiquer un nouveau mécanisme régissant la maturation de ces miARN. La surexpression de HuR lors de la transfection de pFLAG-HuR a été confirmée dans trois lignées cellulaires différentes : HeLa, BCPAP et HEK-293T (Figure 2). Comme témoins, des cellules non transfectées et des cellules transfectées avec des vecteurs pFLAG vides ont été utilisées. Fait important, nous avons observé que la surexpression de HuR dans ces cellules stimule l’expression de miR-19a (résultats du tableau supplémentaire 1 rapportés dans Gatti da Silva et al.9).

Pour confirmer que les miARN induits étaient réellement fonctionnels, un système de rapporteur in vitro a été conçu, comme décrit ici. L’intron artificiel dans pRD-RIPE sépare deux régions codantes de l’eGFP. Cette cassette est sous le contrôle d’un élément sensible à la tétracycline (TRE). L’expression de l’eGFP est ainsi contrôlée par la présence de l’antibiotique doxycycline (DOX) dans le milieu cellulaire (Figure 3).

Une recherche in silico utilisant miRbase et TargetScan a révélé des cibles possibles d’ARNm pour miR-19 a et miR-19 b (composants du cluster miR-17-92). Comme cible potentielle pour les deux miARN, la séquence 5' TTTGCACA 3', trouvée sur la région UTR de RAP-IB 3', a été choisie (tableau supplémentaire 2). RAP-IB est un membre GTPase de la famille des protéines associées à Ras (RAS). Les miARN induits ont été correctement traités et fonctionnels dans notre essai car ils se sont hybridés à la séquence cible clonée à côté de la luciférase (voir Figure 3, cible pmiR-GLO). Par conséquent, il a bloqué la traduction de la luciférase, ce qui s’est traduit par une réduction de l’activité de la luciférase (Figure 3). Comme contrôle pour ce test, nous avons brouillé la séquence cible, la remplaçant par 5' GGGTAAA 3' dans le plasmide brouillé par Luc (les séquences cible et brouillée sont soulignées dans les séquences oligos dans le tableau des matériaux).

Dans des conditions régulières et sans induction du plasmide pRD-miR-17-92, les miR-19a et/ou miR-19b endogènes ont trouvé la cible sur pmiR-GLO, ce qui a entraîné une réduction de l’activité de la luciférase (données non présentées). Après la supplémentation en DOX, une légère réduction statistiquement significative de l’activité de la luciférase a été observée dans les cellules avec une séquence cible brouillée. Cela pourrait être dû à la présence de séquences cibles pour d’autres miARN dans cette séquence. Une forte réduction de l’activité de la luciférase a été observée avec RAP-IB 3'UTR lors de l’augmentation de l’expression de miR-19 a et miR-19 b de pRD-miR-17-92par rapport aux cellules HeLa-Cre(voir Figure 4, comparer les barres orange et noire). La transfection de pFLAG-HuR dans ces cellules n’a pas modifié l’activité de la luciférase (voir la figure 4, comparer les barres grises et noires). Cependant, la surexpression de HuR associée à une supplémentation en doxycycline, stimulant l’expression du cluster miR-17-92, a encore réduit l’activité de la luciférase (voir Figure 4, comparer les barres grises et rouges). Cela indique une régulation positive de HuR sur miR-19 a et miR-19 b, associée à un traitement et une maturation corrects de ces miARN, qui ont pu trouver avec succès leurs cibles (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (voir Figure 4).

L’utilisation de ce système rapporteur a confirmé que HuR induit l’expression et la maturation correcte de miR-19 a et miR-19b dans les cellules HeLa.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble conceptuelle du protocole décrit ici. Les plasmides contenant le miARN, la séquence cible, la protéine régulatrice et le pTK-Renilla ont été transfectés dans des cellules en culture. Après la sélection des antibiotiques, ces cellules ont été utilisées pour induire l’expression de miARN (avec de la doxycycline), avec quantification ultérieure de l’activité de la luciférase, et pour l’analyse de l’ARN afin de confirmer la surexpression de HuR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Confirmation de la surexpression de FLAG-HuR dans les cellules (A) HeLa, (B) BCPAP et (C) HEK293T par qPCR. La transfection avec pFLAG vide a été utilisée comme témoin (barres blanches). β-actine a été utilisée pour normaliser les valeurs de Ct. L’axe des y représente le changement de pli d’expression calculé après normalisation. Les barres d’erreur représentent les erreurs-types calculées à partir de trois mesures indépendantes. **P <0,005, ****P < 0,0005 (chiffre adapté de Gatti da Silva et al.9). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Système rapporteur de miARN intronic. (A) Représentation schématique du plasmide pRD-RIPE qui a généré le pRD-miR-17-92. le pré-miR-17-92 a été inséré à l’intérieur de l’intron et était sous le contrôle d’un promoteur inductible par dox; à droite, le plasmide pmiR-GLO avec séquence cible RAP-IB 3'UTR (pmiRGLO-RAP-IB); le contrôle avait la séquence de cible brouillée (pmiRGLO-brouillé). (B) Détail de la séquence de pmiRGLO-RAP-IB, en mettant l’accent sur la séquence cible complémentaire à miR-19 a et miR-19b. L’activité de la luciférase est réduite lors de l’interaction du miARN et de la cible (figure adaptée de Gatti da Silva et al.9). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Les cellules HeLa-Cre ont été co-transfectées avec les plasmides rapporteurs pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-brouillé, pRD-miR-17-92 et pFLAG-HuR. Activité de la luciférase sur les cellules HeLa-Cre non transfectées (noire), HeLa-Cre miR-17-92-brouillé (blanc), HeLa-Cre-HuR (gris), HeLa-Cre miR-17-92-luc (orange) et HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rouge). L’activité de la luciférase a été quantifiée comme décrit dans le protocole comme l’activité relative de la luciférase luciole par rapport à Renilla luciferase (observée avec pTK-Renilla) et normalisée après l’ajout de doxycycline. Il est représenté par des « unités lumineuses relatives » (RLU) sur l’axe des y. **P < 0,005; P < 0,0005 (figure adaptée de Gatti da Silva et al.9). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Valeurs brutes de Ct observées pour qPCR afin d’analyser l’expression de miR-19. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2 : Séquence RAP-IB 3'UTR et séquence cible miR-19. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

L’épissage pré-ARNm est un processus important pour la régulation de l’expression génique, et son contrôle peut déclencher de forts effets sur les modifications phénotypiques cellulaires22,23. Plus de 70% des miARN sont transcrits à partir d’introns chez l’homme, et nous avons émis l’hypothèse que leur traitement et leur maturation pourraient être facilités par l’épissage des protéines régulatrices24,25. Nous avons développé une méthode pour analyser le traitement et la fonction des miARN introniques dans des cellules en culture. Notre test utilise quatre plasmides différents et nous permet de tester la maturation de miARN endogènes et exogènes ou induits. La méthode décrite ici peut être effectuée en 2-3 jours et ne nécessite pas de réactifs coûteux.

Considérant que HuR est une protéine de liaison à l’ARN importante pour la stabilité de l’ARNm et qu’elle est immunoprécipitée avec les miARN miR-18 et miR-19a 17, ce test a testé s’il pouvait conduire la biogenèse et la maturation des miARN introniques. HuR ne se trouve pas dans le noyau des splicéosomes mais interagit avec les protéines impliquées dans la stabilisation de l’ARNm26. De façon constante, la surexpression de HuR a été associée au développement de cancers de l’ovaire et de la vessie27,28. Dans les cellules papillaires cancéreuses de la thyroïde, nous avons observé que HuR augmente la prolifération, la migration et l’invasioncellulaires 9. HuR affecte également la stabilité de l’ARNm des régulateurs du cycle cellulaire tels que PTEN, cycline A2 et cycline D2, augmentant la prolifération et la migration cellulaires et conduisant à des caractéristiques tumorigènes29,30. Cependant, une partie importante de ces ARNm ont également des séquences cibles pour miR-19 a et miR-19b. Notamment, HuR peut se lier à la région intronique où ces miARN sont transcrits, conduisant à l’idée qu’il peut contrôler l’épissage et la maturation de ces miARNet, par conséquent, améliorer les caractéristiques tumorigènes.

Afin de tester cela, ce test a été développé avec quatre plasmides différents. Le premier contient le groupe de miARN miR-17-92 inséré à l’intérieur d’un intron, et son expression est contrôlée lors de l’ajout de doxycycline. Le deuxième plasmide est le pmiR-GLO commercial portant la séquence cible à côté du 3' du gène luc2. La liaison du miARN à cette séquence cible affecte l’expression de luc2, qui peut être mesurée lors d’un test de luminescence. Le troisième plasmide est pFLAG-HuR, qui induit la surexpression de cette protéine régulatrice. Enfin, le pTK-Renilla est également utilisé pour inclure la fluorescence de Renilla luciférase. Nos résultats ont indiqué que HuR stimule l’expression de miR-17-92 et augmente l’association de ses composants avec les séquences cibles, ce qui donne des molécules de miARN matures et fonctionnelles. Nous décrivons l’association de HuR avec miARN dans un autre article9. Les séquences cibles utilisées dans cette étude étaient spécifiques aux miARN miR-19 a et miR-19b. Cependant, cette méthode peut également être adaptée à l’utilisation de séquences cibles plus courtes ou plus longues, y compris plusieurs sites cibles. Dans ce cas, la liaison non spécifique des miARN endogènes à la séquence cible ou aux séquences proches doit être prise en compte dans l’analyse. Les séquences utilisées peuvent avoir d’autres sites cibles possibles, ce qui pourrait affecter l’activité de la luciférase. La méthode décrite ici pourrait également être utilisée pour valider différentes cibles d’un miARN ou d’un groupe de miARN transcrits ensemble, permettant des études fonctionnelles des miARN et de leurs altérations phénotypiques spécifiques. Il convient également de noter qu’il permet de comparer les résultats entre différentes lignées cellulaires et antécédents génétiques.

Les étapes les plus critiques pour l’utilisation plus large de ce protocole dans les cellules de mammifères sont l’efficacité des étapes de transfection et d’induction. Étant donné que différents plasmides sont transfectés dans les cellules, des contrôles adéquats sont également essentiels. Ces paramètres changent avec la taille des plasmides et sont affectés par le temps long en culture cellulaire. Par conséquent, un point important à considérer avant de commencer le test est la facilité de transfection des cellules choisies. De plus, l’utilisation intensive de différents antibiotiques pour sélectionner les différents plasmides (gentamicine, puromycine et doxycycline) et activer l’expression peut être nocive pour les cellules et réduire l’efficacité des expériences suivantes. Il est important que ce test soit d’abord optimisé avec des cellules dont l’efficacité de transfection est connue.

Le rapporteur a montré avec succès qu’une expression accrue de HuR pouvait induire la biogenèse du miARN et a confirmé sa maturation fonctionnelle. Il est important de noter que la surexpression de HuR n’a pas affecté la quantité d’intron produite puisque nous n’avons pas observé d’activité réduite de la luciférase dans cette condition (Figure 4). D’autres expériences peuvent être effectuées pour caractériser les RBP et les miARN à l’aide de ce système rapporteur. Par exemple, il serait important de créer des mutations uniques dans les séquences de miARN ou dans leurs régions flanquantes et d’analyser l’impact des protéines régulatrices dans la biogenèse des miARN. Cela permettrait de caractériser spécifiquement la biogenèse des miARN individuels et pourrait également améliorer les connaissances sur les séquences conservées pour le traitement et la maturation des miARN.

Nous considérons qu’il s’agit d’une contribution méthodologique importante à l’étude de la biogenèse et de la maturation des miARN et du rôle de l’épissage des protéines régulatrices dans ces processus. Il pourrait également être appliqué à des études sur la régulation et le contrôle des ARNm et des miARN dans différents types de cellules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs remercient E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapour) pour les cellules HeLa-Cre et les plasmides pRD-RIPE et pCAGGS-Cre. Nous remercions Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes et Anselmo Moriscot pour leur soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

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Cancer Research numéro 184
Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères
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Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

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