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Genetics

उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन के माउस मॉडल में रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम पैथोलॉजी का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

माउस मॉडल रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) के जीव विज्ञान की जांच के लिए उपयोगी उपकरण हो सकते हैं। यह स्थापित किया गया है कि चूहे आरपीई विकृति की एक सरणी विकसित कर सकते हैं। यहां, हम प्रकाश, संचरण इलेक्ट्रॉन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चूहों में आरपीई विकृति को स्पष्ट करने और निर्धारित करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) उम्र बढ़ने वाली आबादी में एक दुर्बल रेटिना विकार है। यह व्यापक रूप से माना जाता है कि रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) की शिथिलता एएमडी में एक महत्वपूर्ण पैथोबायोलॉजिकल घटना है। आरपीई डिसफंक्शन का कारण बनने वाले तंत्र को समझने के लिए, शोधकर्ताओं द्वारा माउस मॉडल का उपयोग किया जा सकता है। यह पिछले अध्ययनों द्वारा स्थापित किया गया है कि चूहे आरपीई विकृति विकसित कर सकते हैं, जिनमें से कुछ एएमडी के निदान वाले व्यक्तियों की आंखों में देखे जाते हैं। यहां, हम चूहों में आरपीई विकृति का आकलन करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रकाश माइक्रोस्कोपी और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रेटिना क्रॉस-सेक्शन की तैयारी और मूल्यांकन शामिल है, साथ ही कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आरपीई फ्लैट माउंट भी शामिल हैं। हम इन तकनीकों द्वारा देखे गए सामान्य प्रकार के मुराइन आरपीई विकृति और सांख्यिकीय परीक्षण के लिए निष्पक्ष तरीकों के माध्यम से उन्हें निर्धारित करने के तरीकों का विस्तार करते हैं। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम इस आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग चूहों में देखे गए आरपीई विकृति को मापने के लिए करते हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 135 (Tmem135) और वृद्ध जंगली-प्रकार C57BL / 6J चूहों को अतिरंजित करते हैं। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य एएमडी के माउस मॉडल का उपयोग करने वाले वैज्ञानिकों के लिए निष्पक्ष मात्रात्मक आकलन के साथ मानक आरपीई फेनोटाइपिंग विधियों को प्रस्तुत करना है।

Introduction

उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) एक आम अंधा बीमारी है जो 55 1 वर्ष से अधिक उम्र की आबादी को प्रभावित करतीहै। कई शोधकर्ताओं का मानना है कि रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) के भीतर शिथिलता एएमडी2 में एक प्रारंभिक और महत्वपूर्ण पैथोबायोलॉजिकल घटना है। आरपीई ध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जिसे पड़ोसी फोटोरिसेप्टर और कोरॉयडल रक्त वाहिकाओंके होमियोस्टैसिस को बनाए रखने का काम सौंपा गया है। आरपीई के भीतर रोग से जुड़े तंत्र की जांच करने के लिए विभिन्न प्रकार के मॉडल मौजूद हैं, जिनमें सेल कल्चर मॉडल 4,5 और चूहे 6,7,8 शामिल हैं। एक हालिया रिपोर्ट ने आरपीई सेल कल्चर मॉडल4 के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल और गुणवत्ता नियंत्रण मानदंडों का वर्णन किया है, फिर भी किसी भी रिपोर्ट ने माउस मॉडल में आरपीई के फेनोटाइपिंग को मानकीकृत करने का प्रयास नहीं किया है। वास्तव में, एएमडी के माउस मॉडल पर कई प्रकाशनों में आरपीई का पूरा विवरण या उनमें आरपीई विकृति का परिमाणीकरण नहीं है। इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एएमडी माउस मॉडल का उपयोग करने वाले वैज्ञानिकों के लिए निष्पक्ष मात्रात्मक आकलन के साथ मानक आरपीई फेनोटाइपिंग विधियों को प्रस्तुत करना है।

पिछले प्रकाशनों ने तीन इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से चूहों में कई आरपीई विकृति की उपस्थिति का उल्लेख किया है। उदाहरण के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं को मुराइन रेटिना (चित्रा 1 ए) की सकल आकृति विज्ञान को देखने और आरपीई विकृति जैसे आरपीई पतलापन, रिक्तीकरण और प्रवासन का पता लगाने की अनुमति देता है। एएमडी माउस मॉडल में आरपीई पतलेपन को उनके संबंधित नियंत्रणों (चित्रा 1 बी) से आरपीई ऊंचाई में विचलन द्वारा उदाहरण दिया जाता है। आरपीई वैक्यूलाइजेशन को दो अलग-अलग श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: माइक्रोवैक्यूलाइजेशन (चित्रा 1 सी) और मैक्रोवैक्यूलाइजेशन (चित्रा 1 डी)। आरपीई माइक्रोवैक्यूलाइजेशन को आरपीई में रिक्तिकाओं की उपस्थिति से संक्षेपित किया जाता है जो इसकी समग्र ऊंचाई को प्रभावित नहीं करते हैं, जबकि मैक्रोवैक्यूलाइजेशन को रिक्तिकाओं की उपस्थिति से इंगित किया जाता है जो फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंडों में फैलते हैं। आरपीई माइग्रेशन को रेटिना क्रॉस-सेक्शन (चित्रा 1 ई) में आरपीई मोनोलेयर के ऊपर वर्णक के फोकल एग्रीगेट द्वारा प्रतिष्ठित किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एएमडी दाता आंखों में प्रवासी आरपीई कोशिकाएं प्रतिरक्षा कोशिका मार्करों के लिए विकृति प्रदर्शित करती हैं, जैसे कि भेदभाव 68 (सीडी 68)9 का समूह, और आरपीई मलबे या आरपीई को घेरने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व कर सकताहै। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नामक एक और इमेजिंग तकनीक शोधकर्ताओं को आरपीई और उसके तहखाने झिल्ली (चित्रा 2 ए) की अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने की अनुमति दे सकती है। यह तकनीक चूहों में प्रमुख उप-आरपीई जमा की पहचान कर सकती है, जिसे बेसल लैमिनर डिपॉजिट (बीएलएएमडी) (चित्रा 2 बी)10 के रूप में जाना जाता है। अंत में, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग आरपीई फ्लैट माउंट (चित्रा 3 ए) के माध्यम से आरपीई कोशिकाओं की संरचना को प्रकट कर सकती है। यह विधि आरपीई डिस्मॉर्फिया को उजागर कर सकती है, अपने क्लासिक हनीकॉम्ब आकार (चित्रा 3 बी) से आरपीई का विचलन। यह आरपीई मल्टीन्यूक्लियेशन का भी पता लगा सकता है, एक आरपीई सेल के भीतर तीन या अधिक नाभिक की उपस्थिति (चित्रा 3 सी)। वर्तमान एएमडी माउस मॉडल में मौजूद आरपीई विकृति के प्रकारों के सारांश के लिए, हम शोधकर्ताओं को साहित्य 6,7 से इन समीक्षाओं के लिए संदर्भित करते हैं।

एएमडी का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं को फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल से पहले आरपीई विकृति की जांच करने के लिए चूहों का उपयोग करने के फायदे और नुकसान के बारे में पता होना चाहिए। चूहे अपने अपेक्षाकृत कम जीवन काल और लागत-प्रभावशीलता के साथ-साथ उनके आनुवंशिक और फार्माकोलॉजिकल मैनिपुलेबिलिटी के कारण फायदेमंद हैं। चूहे आरपीई अपक्षयी परिवर्तनों को भी प्रदर्शित करते हैं, जिसमें आरपीई माइग्रेशन, डिस्मोर्फिया और मल्टीन्यूक्लियेशन शामिल हैं, जो एएमडी दाता आंखों 11,12,13,14,15,16,17 में देखे जाते हैं; इससे पता चलता है कि इसी तरह के तंत्र चूहों और मनुष्यों में इन आरपीई विकृति के विकास को कम कर सकते हैं। हालांकि, महत्वपूर्ण अंतर हैं जो मानव एएमडी के लिए माउस अध्ययन की हस्तांतरणीयता को सीमित करते हैं। सबसे पहले, चूहों में एक मैक्युला नहीं होता है, जो दृश्य तीक्ष्णता के लिए आवश्यक मानव रेटिना का एक शारीरिक रूप से अलग क्षेत्र है जो एएमडी में अधिमानतः प्रभावित होता है। दूसरा, चूहों में कुछ आरपीई विकृति, जैसे आरपीई पतला होना और वैक्यूलाइजेशन, आमतौर पर एएमडीदाता आंखों में नहीं देखा जाता है। तीसरा, चूहों में ड्रूसन विकसित नहीं होता है, जो एएमडी पैथोलॉजी19 की एक पहचान है। ड्रुसेन लिपिड- और प्रोटीन युक्त जमा होते हैं जिनमें बहुत कम तहखाने झिल्ली प्रोटीन होते हैं जो आरपीई बेसल लैमिना और ब्रुच की झिल्ली (बीआरएम) 19 की आंतरिक कोलेजनस परत के बीच बनते हैं। ड्रुसेन उनकी संरचना और शारीरिक स्थान दोनों में चूहों में सामान्य उप-आरपीई जमा, बीएलएमडी से भिन्न होता है। बीएलएएमडी उम्र और तनाव-निर्भर बाह्य मैट्रिक्स-समृद्ध असामान्यताएं हैं जो बीआरएम के आरपीई बेसल लैमिना और आरपीई20 के बेसल इनफोल्डिंग के बीच बनती हैं। दिलचस्प बात यह है कि बीएलएएमडी में चूहों और मनुष्यों दोनों में एक समान प्रोटीन संरचना और उपस्थिति 6,10,21 है। हाल के काम से पता चलता है कि बीएलएएमडी एएमडी की प्रगति को इसके बाद के चरणों18,22 तक प्रभावित करके एएमडी के पैथोबायोलॉजी में कार्य कर सकते हैं; इस प्रकार, ये जमा माउस रेटिना में रोगग्रस्त आरपीई का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। माउस अध्ययन से एएमडी में परिणामों का अनुवाद करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए इन लाभों और सीमाओं का ज्ञान महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल में, हम आरपीई विकृति की कल्पना करने के लिए प्रकाश, संचरण इलेक्ट्रॉन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए आंखों को तैयार करने के तरीकों पर चर्चा करते हैं। हम यह भी वर्णन करते हैं कि सांख्यिकीय परीक्षण के लिए निष्पक्ष तरीके से आरपीई विकृति की मात्रा कैसे निर्धारित की जाए। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम चूहों और वृद्ध जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) सी 57बीएल / 6 जे चूहों को अतिरंजित करने वाले ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 135- (टीएमईएम 135) में देखे गए संरचनात्मक आरपीई विकृति की जांच करने के लिए आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं। सारांश में, हम एएमडी माउस मॉडल में आरपीई को चिह्नित करने के लिए फेनोटाइपिंग पद्धति का वर्णन करना चाहते हैं, क्योंकि वर्तमान में कोई मानक प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं हैं। फोटोरिसेप्टर या कोरॉइड के विकृति की जांच और मात्रा निर्धारित करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ता, जो एएमडी माउस मॉडल में भी प्रभावित होते हैं, इस प्रोटोकॉल को उनके अध्ययन के लिए उपयोगी नहीं पा सकते हैं।

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Protocol

पशु विषयों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) स्टेटमेंट के अनुपालन में हैं।

1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा माउस आरपीई का मूल्यांकन

  1. एक फिक्सेटिव बफर बनाएं जिसमें कांच की बोतल में कमरे के तापमान (आरटी) पर 2% पैराफॉर्मलडिहाइड और 2% ग्लूटाराल्डिहाइड की अंतिम एकाग्रता हो।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, अधिक से अधिक, प्रति माउस 14 एमएल फिक्सेटिव बफर की आवश्यकता होती है।
    सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड और ग्लूटाराल्डिहाइड खतरनाक पदार्थ हैं। इन पदार्थों के साथ काम करते समय कृपया मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें।
  2. फ्यूम हुड में कार्डियक छिड़काव के लिए एक शोषक अंडरपैड पर गुरुत्वाकर्षण-फ़ीड छिड़काव प्रणाली तैयार करें (पूरक चित्रा 1 ए)।
    1. छिड़काव प्रणाली के सिरिंज बैरल में फिक्सेटिव बफर के 40 एमएल रखें (पूरक चित्रा 1 बी)।
    2. वाल्व को तब तक घुमाएं जब तक कि यह ट्यूबिंग लाइन के समानांतर न हो जाए ताकि बफर को ट्यूबिंग लाइन (पूरक चित्रा 1 सी) के माध्यम से प्रवाहित किया जा सके। लाइन को बफर के साथ फ्लश करें जब तक कि लाइन से सभी हवा के बुलबुले हटा न दिए जाएं।
    3. वाल्व को तब तक घुमाएं जब तक कि यह ट्यूबिंग लाइन के लंबवत न हो जाए ताकि बफर को ट्यूबिंग लाइन में बहने से रोका जा सके (पूरक चित्र 1 डी)।
      नोट: छिड़काव प्रणाली अब उपयोग के लिए तैयार है।
  3. माउस को कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) कक्ष में रखकर इच्छामृत्यु करें और सीओ2 को प्रति मिनट कक्ष की मात्रा के 30% की प्रवाह दर पर कक्ष में प्रवाहित करने की अनुमति दें। एक बार जब माउस सांस लेना बंद कर देता है, तो सीओ2 को कम से कम 1 मिनट के लिए कक्ष में बहने दें। अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले सत्यापित करें कि माउस मर चुका है।
    नोट: फार्माकोलॉजिकल एजेंटों के इंजेक्शन के माध्यम से इच्छामृत्यु का उपयोग इस प्रोटोकॉल में सीओ2 इनहेलेशन के विकल्प के रूप में किया जा सकता है।
  4. इच्छामृत्यु माउस पर कार्डियक छिड़काव करें।
    1. माउस को छिड़काव प्रणाली के पास एक उथले ट्रे में स्थानांतरित करें, जिसके पेट का सामना ऊपर की ओर हो। पेट को 70% इथेनॉल (ईटीओएच) के साथ स्प्रे करें।
    2. पेट की गुहा को उजागर करने के लिए चार चीरे लगाएं (पूरक चित्र 2 ए)।
      1. माउस के सबसे दूर बाईं ओर त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से घुमावदार कैंची और बल का उपयोग करके 5 सेमी अवर कट बनाएं जो सीधे पसली पिंजरे के नीचे है।
      2. माउस की त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से 3 सेमी औसत दर्जे का कट बनाने के लिए आगे बढ़ें जो अवर कट के शीर्ष पर शुरू होता है।
      3. पसली के पिंजरे के ठीक नीचे माउस के सबसे दूर दाईं ओर त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से औसत दर्जे के कट के अंत में एक और 5 सेमी हीन कट बनाएं।
      4. पेट की त्वचा को घुमावदार बल से फड़फड़ाने के लिए एक और 3 सेमी का चीरा लगाएं।
    3. दिल को उजागर करने के लिए डायाफ्राम और उरोस्थि के माध्यम से काटें (पूरक चित्रा 2 बी)।
      नोट: हृदय, धमनियों और नसों को निखारने से बचने के लिए सावधान रहें। इन्हें निकरने से एक अक्षम कार्डियक छिड़काव होगा।
    4. गेज सुई को दिल के बाएं वेंट्रिकल में डालें। वाल्व को तब तक घुमाएं जब तक कि यह ट्यूबिंग लाइन के समानांतर न हो जाए। दाएं आलिंद को घुमावदार कैंची से काटें ताकि रक्त और फिक्सेटिव दिल से बाहर निकल सकें (पूरक चित्र 2 सी)।
    5. कम से कम 1-2 मिनट के लिए माउस में प्रवेश करने के लिए 10 एमएल फिक्सेटिव बफर की अनुमति दें, या जब तक कि यकृत का रंग पीला न हो जाए और दाहिने आलिंद से कोई रक्त न बहता हो। एक बार छिड़काव पूरा हो जाने के बाद, वाल्व को तब तक घुमाएं जब तक कि यह बफर के प्रवाह को रोकने के लिए ट्यूबिंग लाइन के लंबवत न हो जाए।
  5. कार्डियक छिड़काव के बाद माउस से आंखों को अलग करें।
    1. माउस को उथले ट्रे से निकालें और माउस को फ्यूम हुड में शोषक अंडरपैड पर रखें। माउस के सिर को इस तरह उन्मुख करें कि बाईं आंख प्रयोगकर्ता का सामना कर रही है और दाईं आंख दृश्य से बाहर है। ऊतक अंकन डाई के साथ आंख के बेहतर पक्ष को एनोटेट करें।
    2. आंख सॉकेट से आंख के प्रकोप का कारण बनने के लिए आंख सॉकेट के चारों ओर अंगूठे और तर्जनी उंगली से धीरे से नीचे धक्का दें (पूरक चित्रा 3 ए)।
    3. घुमावदार कैंची लें और इसे आंख सॉकेट से 30 डिग्री कोण पर ब्लेड के साथ पकड़ें। 30 ° कोण पर घुमावदार कैंची के साथ आंख के चारों ओर काटने के लिए आगे बढ़ें (पूरक चित्र 3 बी)।
      नोट: नेत्रगोलक की अखंडता को बनाए रखने के लिए आंख सॉकेट से अतिरिक्त ऊतक को काटना ठीक है।
    4. घुमावदार बल के साथ सिर से नेत्रगोलक निकालें और इसे एक शोषक अंडरपैड पर रखें। कॉर्निया को 11 नंबर स्केलपेल ब्लेड के साथ निक करें और घुमावदार बल के साथ आंख को 2 एमएल माइक्रोट्यूब में 2 एमएल फिक्सेटिव बफर के साथ रखें। माउस पहचान के साथ 2 एमएल माइक्रोट्यूब और बाईं आंख को इंगित करने के लिए 'बाएं' लेबल करें।
      नोट: कॉर्निया में निक फिक्सेटिव को इसे बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए आंख में आसानी से प्रवेश करने की अनुमति देता है।
    5. दाईं आंख के लिए चरण 1.5.1-1.5.4 दोहराएं।
  6. आंखों को 75 घूर्णन प्रति मिनट (आरपीएम) की गति से 4 डिग्री सेल्सियस (सी) कमरे में एक शेकर पर रात भर फिक्सेटिव बफर में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  7. फिक्सेटिव बफर को 1x फॉस्फेट बफर सेलाइन (पीबीएस) के 2 एमएल के साथ बदलें। आरटी और 75 आरपीएम पर एक शेकर पर 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में आंखों को इनक्यूबेट करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  8. पीछे के खंडों को उत्पन्न करने के लिए आंखों को साफ और विच्छेदित करें।
    नोट: पिछला खंड तंत्रिका रेटिना, आरपीई, कोरॉइड और स्क्लेरा के साथ माउस नेत्रगोलक है जिसमें कॉर्निया, आईरिस और लेंस नहीं हैं।
    1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (पूरक चित्रा 4 ए) के तहत 1x पीबीएस से भरे पेट्री डिश में आंख रखें।
    2. धीरे-धीरे किसी भी वसा और मांसपेशियों को नेत्रगोलक से दूर उठाएं। नेत्रगोलक के समानांतर दिशा में सूक्ष्म-विच्छेदन कैंची के साथ वसा और मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक ट्रिम करें जब तक कि नेत्रगोलक का रंग एक समान नीला-काला न हो (पूरक चित्र 4 बी)।
      नोट: लंबवत दिशा में न काटें, क्योंकि यह नेत्रगोलक को नुकसान पहुंचाता है। इसके अलावा, यदि प्रसंस्करण के दौरान ऊतक अंकन डाई बंद हो जाती है, तो नेत्रगोलक के बेहतर पक्ष को तुरंत पुन: व्यवस्थित करें।
    3. कॉर्नियल पंचर साइट पर बारीक-बारीक बल रखें। नेत्रगोलक से कॉर्निया और आईरिस को हटाने के लिए, पंचर साइट से शुरू होने वाले कॉर्निया की परिधि के चारों ओर काट लें, माइक्रो-विच्छेदन कैंची के साथ।
    4. बारीक छिद्रित बल लें और पीछे के खंड (पूरक चित्रा 4 डी) को प्राप्त करने के लिए नेत्रगोलक से लेंस को धीरे से हटा दें।
    5. पीछे के खंड को 1x PBS के 2 mL के साथ 2 mL माइक्रोट्यूब में वापस रखें। पीछे के खंड को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।
      नोट: पीछे के खंड आगे की प्रक्रिया से पहले कई हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में रह सकते हैं।
  9. अध्ययन में अन्य चूहों से आंखों को तैयार करने के लिए चरण 1.3-1.8 दोहराएं।
  10. सेक्शनिंग के लिए पैराफिन में प्रत्येक माउस से पीछे के खंडों में से एक को संसाधित और एम्बेड करें। सुनिश्चित करें कि पीछे के खंड का बेहतर पक्ष शीर्ष पर है।
    नोट: लेखक इन कार्यों को करने के लिए विस्कॉन्सिन-मैडिसन (यूडब्ल्यू) ट्रांसलेशनल रिसर्च इनिशिएटिव्स इन पैथोलॉजी (ट्रिप) प्रयोगशाला में विश्वविद्यालय पर भरोसा करते हैं। यहां एक समान पैराफिन प्रसंस्करण और एम्बेडिंग विधि23,24 का उपयोग करके प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं।
  11. प्रत्येक पैराफिन ब्लॉक को ट्रिम और सेक्शन करके 5 μm मोटी रेटिना सेक्शन प्राप्त करें जिसमें ऑप्टिक तंत्रिका सिर शामिल है, साथ ही चार अतिरिक्त 5 μm मोटी रेटिना सेक्शन जो एक दूसरे से 250 μm अलग हैं। स्लाइड्स को माउस पहचान और सीरियल अनुभाग संख्या (यानी, 1, 2, 3, 4, या 5) के साथ लेबल करें। स्लाइड्स को स्लाइड बॉक्स में संग्रहीत करें.
    नोट: लेखक पैराफिन सेक्शनिंग में अपनी सेवाओं के लिए यूडब्ल्यू ट्रिप प्रयोगशाला पर भरोसा करते हैं। यहां समान पैराफिन सेक्शनिंग विधि25,26 का उपयोग करके प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं।
  12. रेटिना वर्गों वाले स्लाइड्स को हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दें। एच एंड ई धुंधला होने का एक प्रोटोकॉल पूरक चित्र 5 में पाया जा सकता है।
    नोट: एच एंड ई धुंधला प्रक्रिया के सभी चरणों को फ्यूम हुड में पूरा किया जाना चाहिए।
  13. 20x आवर्धन पर प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्केल बार के साथ एच एंड ई-दाग वाले रेटिना वर्गों की सिले हुए चित्र एकत्र करें।
  14. प्रत्येक नमूने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर युक्त रेटिना छवियों में आरपीई मोटाई की मात्रा निर्धारित करें।
    1. डाउनलोड करें और फिजी इमेजजे प्रोग्राम खोलें। ऑप्टिक तंत्रिका सिर वाले सभी सिले हुए रेटिना छवियों को फिजी इमेजजे टास्कबार में खींचें। सत्यापित करें कि छवि स्केल μm में कैलिब्रेट किया गया है और पिक्सेल नहीं।
      नोट: छवि स्केल फिजी इमेजजे कार्यक्रम में एक रेटिना छवि वाली खिड़की के ऊपरी बाएं कोने में स्थित है। यदि स्केल पिक्सेल में सेट किया गया है, तो कृपया पिक्सेल को μm में बदलने के लिए फिजी इमेजजे प्रोग्राम के निर्देश मैनुअल को देखें।
    2. ऑप्टिक तंत्रिका सिर के किनारे से रेटिना के अंत तक प्रत्येक छवि में हर 300 μm अंतराल को चिह्नित करें (ora serrata)। फिजी इमेजजे टास्कबार में सीधे आइकन पर क्लिक करें। ऑप्टिक तंत्रिका सिर के किनारे से ओरा सेराटा की ओर एक रेखा पर क्लिक करें और खींचें जो लंबाई में 300 μm है। फिजी इमेजजे टास्कबार में पेंटब्रश टूल पर क्लिक करें और इसे चिह्नित करने के लिए 300 μm लाइन के अंत पर क्लिक करें।
    3. प्रत्येक चिह्नित अंतराल पर आरपीई मोटाई को मापें। फिजी इमेजजे टास्कबार में सीधे आइकन पर क्लिक करें। आरपीई (पूरक चित्रा 6) के ऊपर से नीचे तक एक रेखा क्लिक करें और खींचें। आरपीई मोटाई प्राप्त करने के लिए फिजी इमेजजे मेनू बार में विश्लेषण > माप पर क्लिक करें।
    4. आरपीई मोटाई माप को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें और माउस पहचान के साथ माप वाले कॉलम को लेबल करें। 'चिह्नित अंतराल' के साथ एक अतिरिक्त कॉलम लेबल करें और ऑप्टिक तंत्रिका मूल्यों (यानी, 300, 600, 900, आदि) से दूरी दर्ज करें।
      नोट: पहला मापा अंतराल ऑप्टिक तंत्रिका से 300 μm दूर से मेल खाता है, दूसरा मापा अंतराल 600 μm दूर से मेल खाता है, और इसी तरह।
  15. प्रत्येक नमूने के लिए रेटिना छवियों के आधार पर आरपीई पैथोलॉजी घटना दर की मात्रा निर्धारित करें।
    1. फिजी इमेजजे प्रोग्राम खोलें।
    2. फिजी इमेजजे प्रोग्राम के भीतर सेल काउंटर एप्लिकेशन खोलें। फिजी इमेजजे मेनू बार में > सेल काउंटर का विश्लेषण करने के > प्लगइन्स पर क्लिक करें। फिजी इमेजजे टास्कबार में एक रेटिना छवि खींचें और सेल काउंटर विंडो में आरंभ पर क्लिक करें।
    3. सेल काउंटर एप्लिकेशन का उपयोग करके प्रति रेटिना अनुभाग आरपीई विकृति की संख्या की गणना करें। काउंटर्स के तहत टाइप 1 पर क्लिक करें और फिर छवि में सभी माइक्रोवैक्यूलाइजेशन घटनाओं पर क्लिक करें। काउंटर्स के तहत टाइप 2 पर क्लिक करें और फिर छवि में सभी मैक्रोवैक्यूलाइजेशन ईवेंट पर क्लिक करें। काउंटर के तहत टाइप 3 पर क्लिक करें और फिर छवि में सभी व्यक्तिगत माइग्रेशन ईवेंट पर क्लिक करें।
    4. आरपीई पैथोलॉजी की संख्या को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें। पंक्तियों को या तो माइक्रोवैक्यूलाइजेशन, मैक्रोवैक्यूलाइजेशन, या माइग्रेशन, और माउस पहचान के साथ कॉलम लेबल करें।
    5. नमूने की अन्य छवियों के लिए चरण 1.15.2-1.15.4 दोहराएँ। स्प्रेडशीट में नमूने के लिए प्रत्येक आरपीई पैथोलॉजी की घटना दर की गणना करने के लिए प्रति नमूने आरपीई पैथोलॉजी की संख्या को औसत करें और पांच से विभाजित करें।
  16. प्रत्येक अंतराल पर आरपीई मोटाई और आरपीई पैथोलॉजी घटना दर पर सांख्यिकीय विश्लेषण करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि अध्ययन में समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं या नहीं।

2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा माउस आरपीई का मूल्यांकन

  1. रेजर ब्लेड के साथ बेहतर निशान के माध्यम से चरण 1.5-1.9 के बाद दिए गए अन्य पीछे के खंडों को दो खंडों में काट लें। ऊतक अंकन डाई के साथ विभाजित पीछे के खंडों के बेहतर पक्ष को पुन: परिभाषित करें। विभाजित पश्चवर्ती खंडों को नए 2 एमएल माइक्रोट्यूबों में अलग करें जिसमें 2 एमएल 1x पीबीएस और माउस पहचान हो।
    नोट: माउस पश्चवर्ती खंड एक टुकड़े में संसाधित करने के लिए बहुत बड़ा है और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रसंस्करण के लिए आधे में काटा जाना चाहिए।
  2. 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर, पीएच 7.2 के 2 मिलीलीटर के साथ ऊतकों को धोएं। बेंचटॉप पर आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  3. 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर को 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (ओएसओ4) के 2 एमएल के साथ 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर में पतला करें। फ्यूम हुड में आरटी पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: ओएसओ4 एक जहरीला पदार्थ है। OsO4 के साथ कार्य करते समय कृपया मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें.
  4. फ्यूम हुड में आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर के 2 मिलीलीटर के साथ ऊतकों को कुल्ला करें। इस चरण को एक बार दोहराएं।
  5. फ्यूम हुड में आरटी में 50% से 100% तक ईटीओएच कमजोर पड़ने के साथ ऊतकों को निर्जलित करें। निर्जलीकरण प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल पूरक चित्रा 7 में पाया जा सकता है।
  6. ऊतकों से 100% ईटीओएच निकालें और ऊतकों में 2 एमएल प्रोपलीन ऑक्साइड जोड़ें। 15 मिनट के लिए फ्यूम हुड में आरटी पर इनक्यूबेट करें। ऊतकों से प्रोपलीन ऑक्साइड निकालें और ऊतकों में 2 एमएल ताजा प्रोपलीन ऑक्साइड जोड़ें। 15 मिनट के लिए फ्यूम हुड में आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: प्रोपलीन ऑक्साइड एक विषाक्त पदार्थ है। प्रोपलीन ऑक्साइड के साथ काम करते समय कृपया मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें।
  7. ऊतकों से प्रोपलीन ऑक्साइड निकालें और ऊतकों में प्रोपलीन ऑक्साइड और राल के 1: 1 मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी में फ्यूम हुड में एक वैक्यूम के नीचे रात भर छोड़ दें।
    चेतावनी: राल मनुष्यों के लिए एक खतरनाक पदार्थ है। राल के साथ काम करते समय कृपया प्रयोगशाला की मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें।
  8. ऊतकों से प्रोपलीन ऑक्साइड और राल के 1: 1 मिश्रण को 2 एमएल शुद्ध राल के साथ बदलें। आरटी में फ्यूम हुड में एक वैक्यूम के नीचे रात भर छोड़ दें।
  9. राल में ऊतकों को एम्बेड करें। पेंसिल में माउस पहचान के साथ एक लेबल रखें और सांचे में राल की एक बूंद रखें। राल की बूंद पर ऊतक रखें। मोल्ड को राल से भरें और फ्यूम हुड में आरटी पर 1 घंटे के लिए वैक्यूम के नीचे रखें।
  10. शीर्ष पर पीछे के आईकप अनुभाग के पीछे के हिस्से के साथ, लेबल और नमूनों को बारीक-बारीक बल के साथ पुनर्स्थापित करें। फ्यूम हुड में एक ओवन में 65 डिग्री सेल्सियस पर मोल्ड को रात भर छोड़ दें।
  11. ओवन से सांचे निकालें। बेंचटॉप पर आरटी के लिए मोल्ड्स को ठंडा होने दें। मोल्डों से ब्लॉक हटा दें।
    नोट: ब्लॉक अब ट्रिमिंग के लिए तैयार हैं।
  12. ट्रेपोज़ॉइड बनाने के लिए रेजर ब्लेड के साथ राल ब्लॉकों को आकार दें। ऑप्टिक तंत्रिका सिर दिखाई देने तक माइक्रोटोम का उपयोग करके राल ब्लॉकों को ट्रिम करें। 0.5 μm की मोटाई के साथ राल ब्लॉकों से सेमीथिन वर्गों को काटने के लिए हीरे के चाकू का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: यहां माइक्रोटोमसेक्शनिंग 27 पर एक प्रकाशित प्रोटोकॉल है। यदि वांछित हो, तो राल ब्लॉकों से 0.5 μm मोटी सेमीथिन खंडों को एकत्र किया जा सकता है और नमूने की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए दाग दिया जा सकता है।
  13. अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके प्रत्येक छंटनी ब्लॉक से 70 एनएम मोटी अल्ट्राथिन सेक्शन काटें। 400-जाल पतली-बार तांबा ग्रिड पर 70 एनएम मोटी अल्ट्राथिन अनुभाग एकत्र करें। ग्रिड को ग्रिड स्टोरेज बॉक्स में रखें और स्लॉट को माउस पहचान के साथ लेबल करें।
    नोट: यहां अल्ट्रामाइक्रोटोमसेक्शनिंग 28 पर एक प्रकाशित प्रोटोकॉल है।
  14. ग्रिड को 5 मिनट के लिए 2% यूरिनिल एसीटेट के साथ दागें और फिर फ्यूम हुड में आरटी पर 5 मिनट के लिए 3.5% लीड साइट्रेट घोल के साथ दाग दें।
    सावधानी: यूरिनाइल एसीटेट और लीड साइट्रेट खतरनाक पदार्थ हैं। इन पदार्थों के साथ काम करते समय कृपया मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें।
  15. 15,000x के आवर्धन पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए चित्र प्राप्त करें, जहां कॉपर ग्रिड की ग्रिड लाइनें आरपीई और बीआरएम को प्रतिच्छेद करती हैं।
    नोट: प्रति अनुभाग कम से कम 20 से 35 छवियां और प्रति नमूना 40 से 70 छवियां होनी चाहिए।
  16. अध्ययन में नमूनों के लिए छवियों में बीएलएएमडी ऊंचाइयों की मात्रा निर्धारित करें।
    1. फिजी इमेजजे प्रोग्राम खोलें। नमूना अनुभाग से सभी छवियों को फिजी इमेजजे टास्कबार में खींचें। सत्यापित करें कि छवियों को μm में कैलिब्रेट किया गया है और पिक्सेल में नहीं।
    2. छवियों में BLamD ऊंचाई मापें। फिजी इमेजजे टास्कबार में सीधे आइकन पर क्लिक करें। बीआरएम के लोचदार लैमिना से छवि में सबसे ऊंचे जमा के शीर्ष पर एक रेखा पर क्लिक करें और खींचें (पूरक चित्र 8)। छवि में BLamD ऊंचाई प्राप्त करने के लिए फिजी इमेजजे मेनू बार में विश्लेषण > माप पर क्लिक करें।
      नोट: यदि छवि में कोई बीएलएमडी नहीं हैं, तो बीआरएम के लोचदार लैमिना से आरपीई के बेसल लैमिना तक एक रेखा खींचें।
    3. BLamD ऊंचाइयों को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें और माउस पहचान के साथ लेबल करें।
  17. प्रति जीनोटाइप बीएलएएमडी ऊंचाइयों की संचयी आवृत्तियों की गणना करें और स्प्रेडशीट में प्रति माउस बीएलएएमडी ऊंचाइयों के औसत की गणना करें। यह निर्धारित करने के लिए बीएलएएमडी ऊंचाइयों के औसत पर सांख्यिकीय विश्लेषण करें कि अध्ययन में समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं या नहीं।

3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से माउस आरपीई का मूल्यांकन

  1. चूहों से आंखें इकट्ठा करें। चरण 1.3 में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु दें। चरण 1.5 का उपयोग करके आंखों को शुद्ध करें। घुमावदार बल का उपयोग करके आंखों को 2 एमएल माइक्रोट्यूब में 1x पीबीएस और माउस पहचान के 2 एमएल के साथ रखें।
    नोट: चूहों को अंधेरे-अनुकूलित न करें, क्योंकि फोटोरिसेप्टर और आरपीई एपिकल प्रक्रियाओं का इंटरडिजिटाइजेशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से आरपीई के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
  2. माउस के पीछे के आईकप उत्पन्न करने के लिए माउस आंखों को तुरंत साफ और विच्छेदित करें।
    नोट: पश्चवर्ती आईकप पीछे के खंड से अलग है क्योंकि इसमें तंत्रिका रेटिना नहीं है।
    1. आंख को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (पूरक चित्रा 9 ए) के तहत 1x पीबीएस युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    2. नेत्रगोलक से वसा और मांसपेशियों को हटा दें, जैसा कि चरण 1.8.2 (पूरक चित्रा 9 बी) में वर्णित है।
    3. निक ने 11 नंबर स्केलपेल ब्लेड के साथ नेत्रगोलक का कॉर्निया बनाया। कॉर्निया और आईरिस को हटा दें, जैसा कि चरण 1.8.3 (पूरक चित्रा 9 सी) में विस्तृत है।
    4. लेंस को बारीक-बारीक बल के साथ बाहर खींचें। दो बारीक-बारीक बल लें और धीरे से तंत्रिका रेटिना को पीछे के खंड से अलग करें।
    5. पीछे के आईकप से हटाने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर तंत्रिका रेटिना को सावधानीपूर्वक काटें (पूरक चित्रा 9 डी)।
    6. पीछे के आईकप को एक नए 2 एमएल माइक्रोट्यूब में रखें जिसमें माउस पहचान के साथ 1x PBS के 500 μL होते हैं।
  3. मेथनॉल (एमईओएच) के साथ पीछे के आईकप को ठीक करें (पूरक चित्र 10)।
    नोट: चरण 3.3 को पूरा करने में लगभग 2 घंटे और 40 मिनट लगते हैं।
    1. ऊतकों में MeOH के 500 μL जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें।
    2. ऊतकों से 500 μL घोल निकालें और MeOH के 500 μL जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर शेकर पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण को एक और बार दोहराएं।
    3. ऊतकों से पूरे समाधान को निकालें और MeOH के 500 μL जोड़ें। आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए 75 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: चरण 3.3.3 के विकल्प के रूप में, पीछे के आईकप को 4 डिग्री सेल्सियस कमरे में 75 आरपीएम पर शेकर पर एमईओएच में रात भर इनक्यूबेट किया जा सकता है।
    4. ऊतकों में 1x PBS के 500 μL जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें।
    5. ऊतकों से 500 μL घोल निकालें और 1x PBS के 500 μL जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें। इस चरण को एक और बार दोहराएं।
    6. ऊतकों से पूरे समाधान को हटा दें और इसे 1x PBS के 500 μL के साथ बदलें।
      नोट: ऊतक पूरी तरह से एमईओएच द्वारा तय किए जाते हैं और कम से कम 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखा जा सकता है।
  4. आरपीई के तंग जंक्शनों और नाभिक की कल्पना करने के लिए पीछे के आईकप के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला पन का प्रदर्शन करें (पूरक चित्र 11)।
    1. नमूने से 1x PBS के 500 μL निकालें और 1x PBS घोल में 100 μL पतला 10% सामान्य गधा सीरम जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें।
    2. नमूनों से पतला 10% सामान्य गधा सीरम समाधान निकालें और 1x पीबीएस में खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-ज़ोनुला ऑक्लुडेंस -1 (जेडओ -1) एंटीबॉडी के 1:50 कमजोर पड़ने के 100 μL जोड़ें। नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस कमरे में स्थानांतरित करें और 75 आरपीएम पर शेकर पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    3. नमूनों से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को हटा दें और 1x पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें। आरटी पर 10 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
    4. नमूने से 1x PBS निकालें। 488 फ्लोरोफोरे-संयुग्मित टैग के साथ गधे विरोधी खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी के 1:250 कमजोर पड़ने के 100 μL और 1x PBS में 4', 6-डायमिडाइन-2'-फेनिलिन्डोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (DAPI) के 1:250 कमजोर पड़ने से नमूने में जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ नमूने कवर करें और आरटी पर 2 घंटे के लिए 75 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए नमूने पूरी तरह से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए।
    5. नमूनों से एंटीबॉडी और डीएपीआई कमजोर पड़ने को हटा दें। नमूने में 1x PBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ फिर से कवर करें, और आरटी पर 10 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर शेकर पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: आरपीई के तंग जंक्शन और नाभिक अब क्रमशः पूरी तरह से लेबल और दागदार हैं।
  5. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पीछे के आईकप माउंट करें।
    1. माउस पहचान के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड लेबल करें। पीछे के आईकप को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्थानांतरित करें, जिसमें कोरॉयडल साइड नीचे की ओर हो। इसे सूखने से रोकने के लिए पीछे के आईकप में 1x पीबीएस की एक बूंद जोड़ें (पूरक चित्र 12)।
    2. चार स्थानों पर 11 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके पीछे के आईकप को काटें जो कार्डिनल दिशाओं (यानी, उत्तर, पूर्व, दक्षिण और पश्चिम) के अनुरूप चार चतुर्थांश उत्पन्न करेगा। पीछे के आईकप की परिधि से ऊतक के साथ अतिरिक्त 1x पीबीएस दबाएं। ऊंट के हेयरब्रश और बारीक-बारीक बल के साथ पीछे की आंखों को धीरे से समतल करें (पूरक चित्र 12)।
      नोट: परिणामी उत्पाद अब आरपीई फ्लैट माउंट के रूप में जाना जाता है।
    3. आरपीई फ्लैट माउंट में माउंटिंग माध्यम की एक बूंद जोड़ें और इसके ऊपर एक कवरस्लिप रखें। कवरस्लिप को सील करने के लिए स्पष्ट नाखून पॉलिश लागू करें और इसे बंद दराज में आरटी पर कम से कम 30 मिनट तक सूखने दें। स्लाइड को स्लाइड वाहक बॉक्स में रखें और बॉक्स को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें।
      नोट: आरपीई फ्लैट माउंट पर बुलबुले पेश करने से बचने के लिए सावधान रहें। आरपीई फ्लैट माउंट को 2 सप्ताह की समय सीमा के भीतर चित्रित किया जा सकता है।
  6. प्रत्येक नमूने के लिए 20x आवर्धन पर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर आरपीई फ्लैट माउंट के ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास के चार चतुर्थांशों में से प्रत्येक की एक छवि प्राप्त करें। आरपीई फ्लैट माउंट छवि का एक उदाहरण पूरक चित्र 13 ए में पाया जा सकता है।
    नोट: आरपीई फ्लैट माउंट की जेड-स्टैक इमेजिंग करना आवश्यक हो सकता है जहां आरपीई फ्लैट माउंट के आयामी अंतर की भरपाई के लिए कई छवियां ली जाती हैं और ढेर की जाती हैं।
  7. प्रत्येक आरपीई फ्लैट माउंट छवि के भीतर आरपीई कोशिकाओं के तंग जंक्शनों का पता लगाएं। ट्रेस किए गए आरपीई फ्लैट माउंट छवि का एक उदाहरण पूरक चित्र 13 बी में पाया जा सकता है।
    1. फिजी इमेजजे प्रोग्राम खोलें। फिजी इमेजजे टास्कबार में एक आरपीई फ्लैट माउंट छवि खींचें। सत्यापित करें कि छवि माइक्रोमीटर में कैलिब्रेट की गई है, न कि पिक्सेल में।
    2. ब्रश की चौड़ाई 3, पारदर्शिता को 0 और रंग को लाल पर सेट करने के लिए फिजी इमेजजे टास्कबार में ओवरले ब्रश टूल आइकन पर डबल-क्लिक करें। ओवरले ब्रश उपकरण विंडो में बंद करें बटन क्लिक करें।
    3. ओवरले ब्रश टूल आइकन पर क्लिक करें। सभी आरपीई कोशिकाओं के तंग जंक्शनों पर क्लिक करें और खींचें जो पूरी तरह से छवि के भीतर हैं।
      नोट: यदि कोई ट्रेसिंग गलती की जाती है, तो ओवरले ब्रश टूल आइकन पर डबल-क्लिक करें और छवि से ट्रेसिंग गलती को हटाने के लिए ओवरले ब्रश टूल विंडो में अनडू बॉक्स पर क्लिक करें।
    4. फिजी इमेजजे टास्कबार में आयत आइकन पर क्लिक करें। छवि पर क्लिक करें और छवि की परिधि के चारों ओर खींचें। ट्रेस की गई लाइनों को रखने और छवि से किसी भी नीले और हरे रंग को हटाने के लिए फिजी इमेजजे मेनू बार पर संपादित करें > साफ़ करें पर क्लिक करें।
    5. ट्रेस छवि को माउस पहचान, चतुर्थांश स्थान (यानी, उत्तर, दक्षिण, पूर्व या पश्चिम), और एक सीपी प्रत्यय लेबल के साथ एक उपयुक्त स्थान पर सहेजें।
      नोट: चरण 3.7.4 को पूरा करने से पहले RPE ट्रेस छवि को सहेजें नहीं।
  8. प्रत्येक नमूने के लिए आरपीई सेल क्षेत्रों की गणना करें।
    1. कंप्यूटर डेस्कटॉप स्क्रीन पर एक फ़ोल्डर बनाकर RPE क्षेत्र विश्लेषण से फ़ाइलों को सहेजने के लिए एक स्थान निर्दिष्ट करें। प्रत्येक आरपीई ट्रेस छवि के लिए सबफ़ोल्डर उत्पन्न करें और माउस पहचान के साथ-साथ क्वाड्रंट स्थान (यानी, उत्तर, दक्षिण, पूर्व या पश्चिम) के साथ सबफ़ोल्डर्स को लेबल करें।
    2. स्थापित करें और कक्ष Profiler प्रोग्रामखोलें 29. Ikeda_RPE क्षेत्र कैलकुलेटर.cpproj (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) प्रोजेक्ट फ़ाइल डाउनलोड करें। सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम मेनू पट्टी में फ़ाइल > खोलें प्रोजेक्ट क्लिक करके Ikeda_RPE क्षेत्र कैलकुलेटर.cpproj फ़ाइल खोलें ।
    3. सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम विंडो में छवि > ड्रॉप फ़ाइलें और फ़ोल्डर्स यहाँ बॉक्स में एक आरपीई ट्रेस छवि खींचें।
    4. फ़ोल्डर का स्थान सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम में इनपुट करें जो RPE ट्रेस छवि से मेल खाता है। सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम विंडो के निचले बाएं कोने में आउटपुट सेटिंग्स बटन पर क्लिक करें और डिफ़ॉल्ट इनपुट फ़ोल्डर और डिफ़ॉल्ट आउटपुट फ़ोल्डर पाठ बक्से में फ़ोल्डर का स्थान दर्ज करें।
    5. सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम विंडो के निचले बाएं कोने में छवियों का विश्लेषण करें बटन पर क्लिक करें। विश्लेषण पूरा होने के बाद, स्क्रीन पर एक विश्लेषण पूर्ण विंडो दिखाई देगी। विश्लेषण पूर्ण विंडो में ठीक बटन पर क्लिक करें।
      नोट: यह क्रिया एक csv फ़ाइल और jpeg छवि उत्पन्न करेगा। सीएसवी फ़ाइल में ट्रेस छवि के भीतर आरपीई कोशिकाओं के लिए क्षेत्र होंगे। जेपीईजी छवि आरपीई ट्रेस छवि के अनुरूप होगी, जहां प्रत्येक आरपीई सेल को एक संख्या (पूरक चित्रा 13 सी) के साथ लेबल किया जाएगा।
    6. RPE क्षेत्रों को CSV फ़ाइल से स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें। स्प्रेडशीट को माउस पहचान के साथ लेबल करें।
    7. यह पुष्टि करके डेटा का गुणवत्ता नियंत्रण सर्वेक्षण करें कि CSV फ़ाइल में प्रत्येक RPE क्षेत्र एक jpeg छवि में पूरी तरह से ट्रेस किए गए RPE सेल से लिंक करता है। स्प्रेडशीट से किसी भी मान को हटा दें जो पूरी तरह से ट्रेस किए गए आरपीई कोशिकाओं के अनुरूप नहीं हैं।
    8. सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम पर लौटें। ड्रॉप फ़ाइलें और फ़ोल्डर्स यहाँ बॉक्स में आरपीई ट्रेस छवि नाम पर राइट-क्लिक करें और सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम से छवि को हटाने के लिए सूची साफ़ करें का चयन करें।
    9. नमूने के शेष तीन आरपीई ट्रेस छवियों के लिए आरपीई आकार की गणना करने के लिए चरण 3.8.3-3.8.8 दोहराएं।
  9. स्प्रेडशीट में प्रत्येक नमूने के लिए आरपीई सेल आकार औसत की मात्रा निर्धारित करें।
  10. स्प्रेडशीट में प्रत्येक नमूने के लिए आरपीई सेल घनत्व की मात्रा निर्धारित करें। आरपीई सेल घनत्व की गणना करने के लिए, सेल प्रोफाइलर प्रोग्राम द्वारा पता लगाए गए प्रति क्वाड्रंट आरपीई कोशिकाओं के कुल क्षेत्र से प्रति क्वाड्रंट आरपीई कोशिकाओं की कुल संख्या को विभाजित करें। प्रति नमूने चार चतुर्थांश से आरपीई सेल घनत्व का औसत निर्धारित करें।
  11. प्रत्येक नमूने के लिए प्रति आरपीई फ्लैट माउंट में बहुराष्ट्रीय आरपीई कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। फिजी इमेजजे प्रोग्राम के भीतर सेल काउंटर एप्लिकेशन का उपयोग करें, जैसा कि चरण 1.15.1-1.15.3 में वर्णित है, नमूने के चार चतुर्थांश में तीन से अधिक नाभिक वाले आरपीई कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए।
  12. आरपीई सेल आकार और घनत्व औसत पर सांख्यिकीय विश्लेषण करें, साथ ही साथ यह निर्धारित करने के लिए बहुराष्ट्रीय आरपीई कोशिकाओं की संख्या कि अध्ययन में समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं या नहीं।

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Representative Results

इस लेख में वर्णित आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का पूरा होना एएमडी के माउस मॉडल में आमतौर पर देखी जाने वाली संरचनात्मक आरपीई असामान्यताओं का मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए, हमने इसे चूहों में इस्तेमाल किया जो आरपीई विकृति प्रदर्शित करने के लिए जाने जाते हैं, जिसमें ट्रांसजेनिक चूहे शामिल हैं जो चिकन बीटा-एक्टिन प्रमोटर (Tmem135 TG)30 और वृद्ध C57BL / 6J चूहों 31,32 द्वारा संचालित WT Tmem135 को ओवरएक्सप्रेस करते हैं। इन प्रयोगों का उद्देश्य प्रतिनिधि परिणाम दिखाना है जो माउस मॉडल के लिए नए शोधकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

हमने प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके आरपीई विकृति का मूल्यांकन करने के लिए डब्ल्यूटी और टीएमईएम 135 टीजी चूहों से आंखों को संसाधित करने और मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोकॉल के चरण 1 में विधियों का पालन किया। हमने पाया कि 4 महीने के Tmem135 TG चूहों में पोस्ट-हॉक ट्यूकी परीक्षण (चित्रा 4) के साथ एनोवा के माध्यम से उम्र-मिलान डब्ल्यूटी के सापेक्ष दो मापा अंतराल पर आरपीई मोटाई में महत्वपूर्ण कमी आई है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ऑप्टिक तंत्रिका से 600 और 900 μm दूर उम्र के मिलान वाले डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में 4 महीने के Tmem135 TG चूहों में RPE पतला है।

इसके अलावा, प्रोटोकॉल के चरण 1 के तरीकों का उपयोग करते हुए, हमने आरपीई विकृति की घटनाओं की गणना की, जिसमें माइक्रोवैक्यूलाइजेशन, मैक्रोवैक्यूलाइजेशन, और तीन 25-दिवसीय डब्ल्यूटी और टीएमईएम 135 टीजी चूहों के प्रवास शामिल हैं (चित्रा 5 ए)। डब्ल्यूटी चूहों में प्रति स्लाइड आरपीई माइक्रोवैक्यूलाइजेशन पैथोलॉजी की औसत आवृत्ति 0.67 ± 0.31 थी और टीएमईएम 135 टीजी चूहों में 7.07 ± 0.61 थी (चित्रा 5 बी)। डब्ल्यूटी चूहों में कोई आरपीई मैक्रोवैक्यूलाइजेशन नहीं था, लेकिन औसतन 5.33 ± 2.02 टीजी चूहों में 2.02 मैक्रोवैक्यूलाइजेशन घटनाएं थीं (चित्रा 5 सी)। अंत में, प्रति स्लाइड प्रवासी आरपीई कोशिकाओं की दर डब्ल्यूटी चूहों में शून्य थी और टीएमईएम 135 टीजी चूहों में 0.4 ± 0.35 थी (चित्रा 5 डी)। एक छात्र के टी-टेस्ट करने के बाद, डब्ल्यूटी और टीएमईएम 135 टीजी चूहों के बीच आरपीई माइक्रोवैक्यूलाइजेशन और माइक्रोवैक्यूलाइजेशन की घटनाएं काफी अलग थीं। हालांकि, Tmem135 TG चूहों में RPE प्रवासी कोशिकाओं की उच्च घटना WT (p = 0.1161) की तुलना में काफी अलग नहीं थी। इस डेटा से पता चलता है कि आरपीई माइक्रोवैक्यूलाइजेशन और मैक्रोवैक्यूलाइजेशन, लेकिन माइग्रेशन नहीं, डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में 25 दिन के टीएमईएम 135 टीजी में काफी अधिक है।

चरण 2 में शामिल प्रोटोकॉल के तरीकों का पालन करते हुए, हमने बीएलएएमडी की उपस्थिति और ऊंचाइयों का विश्लेषण करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए 2 महीने और 24 महीने के डब्ल्यूटी सी 57बीएल / 6 जे चूहों से रेटिना अनुभाग तैयार किए। हमने पाया कि 24 महीने के डब्ल्यूटी रेटिना में बीएलएएमडी मौजूद थे जो 2 महीने के डब्ल्यूटी रेटिना (चित्रा 6 ए) में विशेष रूप से अनुपस्थित थे। हमने 24 महीने पुराने डब्ल्यूटी रेटिना में बीएलएएमडी की ऊंचाइयों को उनकी घटना की संचयी आवृत्तियों की गणना और प्लॉटिंग करके प्रस्तुत किया। जमा ऊंचाइयों के वितरण को चित्रित करने के लिए जमा ऊंचाई के खिलाफ बीएलएएमडी ऊंचाइयों की संचयी आवृत्तियों को ग्राफ किया गया था। 2 महीने पुरानी डब्ल्यूटी बीएलएमडी ऊंचाइयों की तुलना में 24 महीने के डब्ल्यूटी बीएलएमडी ऊंचाइयों के लिए लाइन के दाईं ओर एक बदलाव है, जो 24 महीने के डब्ल्यूटी चूहों में जमा की वृद्धि का प्रदर्शन करता है (चित्रा 6 बी)। यह ग्राफ 2 महीने के डब्ल्यूटी रेटिना (0.23 μm ± 0.017 μm) की तुलना में 24 महीने के WT रेटिना (1.01 μm ± 0.43 μm) में BLAMD ऊंचाइयों के बड़े औसत द्वारा समर्थित है, जो एक छात्र के टी-टेस्ट (चित्रा 6 C) से काफी भिन्न थे। सारांश में, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि 24 महीने के डब्ल्यूटी चूहों में 2 महीने के डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में उनके रेटिना के उप-आरपीई स्थान में बड़े बीएलएमडी हैं।

हमने आरपीई डिस्मोर्फिया और मल्टीन्यूक्लियेशन का पता लगाने और विश्लेषण के लिए आरपीई फ्लैट माउंट उत्पन्न करने के लिए चरण 3 में 4 महीने के डब्ल्यूटी और टीएमईएम 135 टीजी चूहों से आंखें तैयार करने के तरीकों को लागू किया। इस प्रोटोकॉल में, हमने आरपीई सेल आकार और उनके नियंत्रण के सापेक्ष एएमडी माउस मॉडल में घनत्व में परिवर्तन द्वारा आरपीई डिस्मोर्फिया को परिभाषित किया। हमने पाया कि 4 महीने के Tmem135 TG चूहों में RPE डिस्मॉर्फिक हैं (चित्रा 7 ए)। Tmem135 TG रेटिना में RPE उम्र से मेल खाने वाले WT रेटिना (चित्रा 7B, C) की तुलना में बड़ा (806.89 μm 2 ± 252.67 बनाम 291.69μm 2 ± 26.31) और कम घना (0.0014 कोशिकाएं/ μm2 ± 0.00039 बनाम 0.00039 ± 0.00024) है। इसके अलावा, डब्ल्यूटी नियंत्रणों की तुलना में टीएमईएम 135 टीजी रेटिना में अधिक बहुउद्देशीय आरपीई कोशिकाएं थीं (8.04 कोशिकाएं ±5.54 बनाम 0.33 कोशिकाएं ± 0.29) (चित्रा 7 डी)। ये सभी पैरामीटर एक छात्र के टी-टेस्ट के साथ सांख्यिकीय महत्व तक पहुंच गए। साथ में, 4 महीने के Tmem135 TG चूहों में 4 महीने के WT चूहों की तुलना में अधिक डिस्मॉर्फिक और मल्टीन्यूक्लियेटेड आरपीई कोशिकाएं होती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया गया आरपीई विकृति। डब्ल्यूटी (ए) में सामान्य आरपीई और टीएमईएम 135 टीजी चूहों (बी-ई) में असामान्य आरपीई की प्रतिनिधि छवियां। Tmem135 TG चूहों में देखी गई आरपीई विकृतियों में RPE थिनिंग (B), मैक्रोवैक्यूलाइजेशन (C), माइक्रोवैक्यूलाइजेशन (D), और माइग्रेशन (E) शामिल हैं। प्रत्येक विकृति को एक काले तीर द्वारा चित्रित किया गया है। स्केल बार = 100 μm. आवर्धन = 20x. संक्षेप: आरजीसी = रेटिना गैंग्लियन सेल परत, आईपीएल = आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत, आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत, ओपीएल = बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत, ओएनएल = बाहरी परमाणु परत, आईएस = फोटोरिसेप्टर आंतरिक खंड, ओएस = फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड, आरपीई = रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम, चो = कोरॉयड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाए गए आरपीई विकृति। युवा सीएफएच-एच / एच और (बी) 2 वर्षीय सीएफएच-एच / एच चूहों में (ए) आरपीई की प्रतिनिधि छवियां जिनमें प्रचुर मात्रा में बेसल लैमिनर जमा (बीएलएएमडी) हैं। छवि में पीले बिंदुओं के साथ बीएलएएमडी का पता लगाया जाता है। स्केल बार = 800 एनएम। आवर्धन = 15,000x। संक्षेप: एन = न्यूक्लियस, एम = माइटोकॉन्ड्रियन, पी = पिगमेंट ग्रेन्युल, बीआई = बेसल इनफोल्डिंग, ईएल = इलास्टिक लैमिना, आरपीई = रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम, बीआरएम = ब्रुच की झिल्ली, चो = कोरॉयड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया गया आरपीई विकृति। (ए) 8 महीने के डब्ल्यूटी के सामान्य आरपीई और (बी) 8 महीने के टीएमई 135 टीजी चूहों के असामान्य आरपीई की प्रतिनिधि छवियां जो आरपीई डिस्मॉर्फिया प्रदर्शित करती हैं। सफेद वर्ग को तीन नाभिकों के साथ एक बहुराष्ट्रीय आरपीई सेल को चित्रित करने के लिए (सी) में ज़ूम किया गया है। हरा रंग एंटी-ZO1 संबद्ध आरपीई तंग जंक्शन है, और नीला रंग आरपीई नाभिक का DAPI धुंधला है। स्केल बार = 50 μm. आवर्धन = 20x. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 4 महीने के जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) और टीएमईएम 135 टीजी चूहों में आरपीई मोटाई। (ए) 4 महीने के डब्ल्यूटी और टीएमईएम 135 टीजी (टीजी) चूहों से रेटिना की प्रतिनिधि छवियां। आवर्धन = 20x। स्केल बार = 100 μm. (B) ऑप्टिक तंत्रिका से 3,000 μm दूर 4 महीने के WT (काले) और Tmem135 TG चूहों (हरे) में RPE मोटाई माप के रेखा ग्राफ़। जीनोटाइप के बाद की संख्या इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या को दर्शाती है। * पी < 0.05, पोस्ट-हॉक ट्यूकी परीक्षण के साथ एनोवा। सभी डेटा एसडी ± माध्य हैं। कृपया रेटिना परतों के संक्षिप्तीकरण के लिए चित्रा 1 किंवदंती देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 25 दिन के Tmem135 TG चूहों में आरपीई विकृति। (ए) तीन 25 दिन के टीएमई 135 टीजी (टीजी) चूहों में आरपीई माइक्रोवैक्यूलाइजेशन, मैक्रोवैक्यूलाइजेशन और माइग्रेशन की प्रतिनिधि छवियां। आरपीई विकृति को प्रत्येक छवि में काले तीर द्वारा हाइलाइट किया जाता है। आवर्धन = 40x। स्केल बार = 20 μm. (B-D) 25 दिन पुराने WT और Tmem135 TG चूहों में RPE माइक्रो- और मैक्रोवैक्यूलाइजेशन के साथ-साथ प्रवासी RPE कोशिकाओं का परिमाणीकरण। कोष्ठक में संख्याएं इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या को दर्शाती हैं। * पी < 0.05 और ****पी < 0.0001, छात्र का टी-टेस्ट। सभी डेटा एसडी ± माध्य हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: युवा और वृद्ध डब्ल्यूटी रेटिना में बीएलएएमडी का अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण । (ए) 2 महीने और 24 महीने के डब्ल्यूटी आरपीई के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। आवर्धन = 15,000x। स्केल बार = 800 एनएम। बेसल लैमिनर डिपॉजिट (बीएलएएमडी) का एक उदाहरण एक ब्रैकेट के साथ आरेखित किया गया है। (बी) बीएलएएमडी ऊंचाइयों की संचयी आवृत्तियों। (सी) बीएलएएमडी ऊंचाई औसत। कोष्ठक में संख्या इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रति जीनोटाइप चूहों की कुल संख्या को दर्शाती है। ** पी < 0.01, छात्र का टी-टेस्ट। सभी डेटा एसडी ± माध्य हैं। कृपया रेटिना परतों के संक्षिप्तीकरण के लिए चित्रा 2 किंवदंती देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: आरपीई फ्लैट माउंट टीएमई 135 टीजी चूहों में आरपीई विकृति को प्रकट करते हैं। (ए) 4 महीने पुराने डब्ल्यूटी और टीएमईएम 135 टीजी (टीजी) आरपीई फ्लैट माउंट की प्रतिनिधि छवियां हरे रंग में एंटी-जेडओ -1 और नीले रंग में डीएपीआई के साथ हैं। आवर्धन = 20x। स्केल बार = 100 μm. (B) RPE सेल आकार, (C) RPE सेल घनत्व, और (D) 4 महीने के WT और Tmem135 TG चूहों में RPE मल्टीन्यूक्लियेशन। कोष्ठक में संख्या अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या को दर्शाती है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01 और ****पी < 0.0001, छात्र का टी-टेस्ट। सभी डेटा SD ± माध्य हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: कार्डियक छिड़काव सेटअप और उपयोग का योजनाबद्ध। (ए) गुरुत्वाकर्षण-फ़ीड छिड़काव प्रणाली। (बी) फिक्सेटिव बफर के लिए छिड़काव प्रणाली का सिरिंज बैरल। (सी) वाल्व को तब तक चालू किया जाना चाहिए जब तक कि यह ट्यूबिंग लाइन के समानांतर न हो जाए ताकि बफर को ट्यूबिंग लाइन के माध्यम से बहने की अनुमति मिल सके। (डी) वाल्व को तब तक चालू किया जाना चाहिए जब तक कि यह ट्यूबिंग लाइन के साथ लंबवत न हो जाए ताकि बफर को ट्यूबिंग लाइन में बहने से रोका जा सके। बायोरेंडर में बनाई गई छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: माउस के कार्डियक छिड़काव के लिए प्रक्रिया का योजनाबद्ध। (ए) पेट की गुहा को उजागर करने के लिए किए गए चार चीरे। (बी) दिल को उजागर करने के लिए डायाफ्राम और उरोस्थि के माध्यम से काटा गया। (सी) गेज सुई दिल के बाएं वेंट्रिकल में डाली गई। वाल्व को तब तक घुमाया जाता है जब तक कि यह ट्यूबिंग लाइन के समानांतर न हो। दाहिने आलिंद को घुमावदार कैंची से काटा जाता है ताकि रक्त और फिक्सेटिव बाहर निकल सकें। बायोरेंडर में बनाई गई छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: माउस से आंखों को अलग करने के लिए प्रक्रिया का योजनाबद्ध। (ए) आंख सॉकेट के चारों ओर अंगूठे और तर्जनी उंगली से धीरे से नीचे धक्का दें ताकि आंख सॉकेट से आंख का प्रकोप हो। (बी) घुमावदार कैंची लें और उन्हें आंख के सॉकेट से 30 डिग्री कोण पर ब्लेड से पकड़ें। 30 ° कोण पर घुमावदार कैंची के साथ आंख के चारों ओर काटने के लिए आगे बढ़ें। रंगीन बिंदु माउस या घुमावदार कैंची पर उंगली प्लेसमेंट का प्रतिनिधित्व करते हैं। बायोरेंडर में बनाई गई छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 4: माउस पश्चवर्ती खंड उत्पन्न करने के लिए माउस आंख विच्छेदन के चित्र। (ए) आंख को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित किया जाता है। (बी) नेत्रगोलक से वसा और मांसपेशियों को हटा दिया गया। (सी) नेत्रगोलक से कॉर्निया और आईरिस को हटा दिया गया। (डी) नेत्रगोलक से लेंस हटा दिया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 5: हेमटोक्सीलिन ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला प्रक्रिया। पैराफिन-एम्बेडेड रेटिना वर्गों को दागने के लिए एच एंड ई प्रक्रिया को दर्शाने वाला योजनाबद्ध। तीर चरणों के बीच स्थानांतरण का संकेत देते हैं। प्रत्येक चरण का समय लाल फ़ॉन्ट में दिया गया है। धुंधला करने के लिए अभिकर्मक ग्लास धुंधला कंटेनरों के भीतर काले फ़ॉन्ट में प्रदान किए जाते हैं। उपरोक्त आरेख में शामिल प्रत्येक अभिकर्मक के लिए एक ग्लास स्टेनिंग कंटेनर तैयार किया जाना चाहिए। सभी चरणों को फ्यूम हुड में पूरा किया जाना चाहिए। स्लाइड में कवरस्लिप जोड़ते समय, सावधान रहें कि स्लाइड में बुलबुले पेश न करें। प्रक्रिया के पूरा होने के बाद, स्लाइड ्स को स्लाइड बॉक्स में संग्रहीत किया जा सकता है। बायोरेंडर में बनाई गई छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 6: आरपीई मोटाई माप का उदाहरण। काला तीर आरपीई के ऊपर से नीचे तक एक लाल रेखा को दर्शाता है। आरपीई की मोटाई निर्धारित करने के लिए इस रेखा को मापा जा सकता है। स्केल बार = 100 μm. आवर्धन = 20x. आरपीई को आसानी से देखने के लिए बॉक्स किए गए क्षेत्र को ज़ूम आउट किया गया है। कृपया रेटिना परतों के संक्षिप्तीकरण के लिए चित्रा 1 किंवदंती देखें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 7: टीईएम प्रसंस्करण के लिए माउस पश्चवर्ती खंडों की ईटीओएच निर्जलीकरण प्रक्रिया। बायोरेंडर में बनाई गई छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 8: बीएलएमडी ऊंचाई माप का उदाहरण। लाल रेखा इस छवि में सबसे बड़ी BLamD को दर्शाती है। पीले बिंदु छवि में बीएलएएमडी को चित्रित करते हैं। इस छवि में इस बीएलएमडी की ऊंचाई निर्धारित करने के लिए इस लाल रेखा को मापा जा सकता है। स्केल बार = 800 एनएम। आवर्धन = 15,000x। कृपया रेटिना परतों के संक्षिप्तीकरण के लिए चित्रा 2 किंवदंती देखें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 9: आरपीई फ्लैट माउंट के लिए माउस आंख विच्छेदन। (ए) आंख को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत 1x पीबीएस युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जाता है। (बी) नेत्रगोलक से वसा और मांसपेशियों को हटा दिया गया। (सी) नेत्रगोलक से कॉर्निया और आईरिस को हटा दिया गया। (डी) नेत्रगोलक से लेंस और रेटिना हटा दिए गए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 10: माउस पश्चवर्ती आईकप की मेथनॉल (एमईओएच) निर्धारण प्रक्रिया। बायोरेंडर में बनाई गई छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 11: आरपीई कोशिकाओं के तंग जंक्शनों और नाभिक को लेबल करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रक्रिया। इस प्रोटोकॉल से इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक के चरणों को दर्शाने वाला आरेख। ध्यान दें कि इस तकनीक को पूरा होने में 2 दिन लगते हैं। सभी चरण आरटी पर और 75 आरपीएम की गति के साथ एक शेकर पर होते हैं, जब तक कि आरेख में विशेष रूप से उल्लेख न किया गया हो। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया प्राथमिक (1 °) एंटीबॉडी खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-जेडओ 1 था, और इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला द्वितीयक (2º) एंटीबॉडी 488 फ्लोरोफोरे-संयुग्मित गधा एंटी-खरगोश आईजीजी था। एक बार जब द्वितीयक एंटीबॉडी और डीएपीआई को नमूनों में जोड़ा जाता है, तो नमूने के फोटोब्लीचिंग से बचाने के लिए नमूनों को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जाना चाहिए। बायोरेंडर में बनाई गई छवि। संक्षेप: एनडीएस = सामान्य गधा सीरम, एबी = एंटीबॉडी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 12: माउस आरपीई फ्लैट माउंट के चार चतुर्थांश उत्पन्न करने के लिए कटौती का चित्रण। N = उत्तर, E = पूर्व, S = दक्षिण, W = पश्चिम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 13: आरपीई फ्लैट माउंट विश्लेषण समापन बिंदु के उदाहरण। (ए) आरपीई फ्लैट माउंट छवि। (बी) आरपीई सीमा ट्रेस छवि। (सी) आरपीई सेल प्रोफाइलर ने छवि का विश्लेषण किया। आवर्धन = 20x. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: इकेदा आरपीई क्षेत्र कैलकुलेटर.cpproj कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस लेख में, हमने माउस मॉडल के संरचनात्मक आरपीई विकृति का आकलन करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल पेश किया। हमने प्रकाश, संचरण इलेक्ट्रॉन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सहित विभिन्न इमेजिंग तकनीकों के लिए आंखों को संसाधित करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन किया, साथ ही इन इमेजिंग विधियों के माध्यम से देखे गए विशिष्ट विकृति की मात्रा भी बताई। हमने Tmem135 TG और 24 महीने के WT चूहों की जांच करके हमारे आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता साबित की, क्योंकि ये चूहे RPE विकृति30,31,32 प्रदर्शित करते हैं। इस प्रोटोकॉल को किसी भी आनुवंशिक रूप से संशोधित या औषधीय रूप से इलाज किए गए माउस पर लागू किया जा सकता है जो आरपीई विकृति जैसे आरपीई पतलापन, रिक्तीकरण, प्रवासन और डिस्मॉर्फिया, साथ ही बीएलएएमडी 6,7 को परेशान कर सकता है। यद्यपि Tmem135 TG और 24 महीने के WT चूहों में देखी गई आरपीई विकृति अन्य AMD माउस मॉडल 7,30 में मौजूद हैं, शोधकर्ता के लिए अपने अध्ययन के लिए चुने गए AMD माउस मॉडल से परिचित होना महत्वपूर्ण है, क्योंकि उनके AMD माउस मॉडल के RPE विकृति की शुरुआत और गंभीरता की उम्र Tmem135 से भिन्न हो सकती है। टीजी और 24 महीने के डब्ल्यूटी चूहे। शोधकर्ताओं को इस लेख में दिखाए गए प्रतिनिधि परिणामों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या की तुलना में अपने अध्ययन के लिए अधिक चूहों का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है, यदि आरपीई विकृति की प्रस्तुति उनके संबंधित एएमडी माउस मॉडल में परिवर्तनशील है। इसके अलावा, कई एएमडी माउस मॉडल वर्तमान में एएमडी शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं, फिर भी उनके आरपीई विकृति का पूरा विवरण नहीं है, जिसके लिए शोधकर्ताओं को इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक अध्ययन करने की आवश्यकता हो सकती है।

यद्यपि विभिन्न इमेजिंग विधियों के लिए माउस आंखों को कैसे संसाधित किया जाता है, इसमें संशोधन किया जा सकता है, प्रोटोकॉल में वर्णित संरचनात्मक आरपीई असामान्यताओं के मात्रात्मक मूल्यांकन को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, आरपीई माइक्रोवैक्यूलाइजेशन, मैक्रोवैक्यूलाइजेशन और माइग्रेशन घटनाओं की संख्या को गिनने के लिए पांच एच एंड ई-दाग वाले रेटिना सेक्शन तैयार किए गए थे, जिससे शोधकर्ताओं को माउस रेटिना में कई स्थानों पर आरपीई विकृति का मूल्यांकन करने की अनुमति मिली। एक अन्य उदाहरण आरपीई की अल्ट्रास्ट्रक्चरल असामान्यताओं का आकलन करने के लिए 400-जाल पतली-बार तांबा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड का उपयोग कर रहा है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफी द्वारा व्यवस्थित और निष्पक्ष रूप से रेटिना नमूने का मूल्यांकन करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है, साथ ही बीएलएएमडी की उपस्थिति की जांच करने के लिए प्रति रेटिना अनुभाग 40 से 70 छवियां प्राप्त करता है। यह एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी-स्लॉट ग्रिड के साथ हासिल नहीं किया जा सकता है, और हम सुझाव देते हैं कि इस प्रोटोकॉल के साथ उनका उपयोग न करें। अंत में, आरपीई फ्लैट माउंट के चार क्वाड्रेंट्स से 20x आवर्धन छवियों को कैप्चर करने से शोधकर्ताओं को डिस्मॉर्फिया और मल्टीन्यूक्लियेशन के लिए मुराइन आरपीई के बड़े क्षेत्रों की जांच करने में सक्षम बनाता है। शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल पर विस्तार करने और अपने अध्ययन में आरपीई विकृति के लिए अतिरिक्त रेटिना वर्गों की जांच करने के लिए स्वतंत्र हैं। साथ में, ये विधियां शोधकर्ताओं को संरचनात्मक आरपीई विकृति के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए पर्याप्त डेटा इकट्ठा करने की अनुमति देती हैं जो उनके एएमडी माउस मॉडल में मौजूद हो सकती हैं।

इस प्रोटोकॉल की एक और प्रमुख विशेषता आरपीई फेनोटाइपिंग विधियों की स्थिरता है। उदाहरण के लिए, प्रकाश और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग की जाने वाली सभी आंखों को सेक्शनिंग के लिए माउस रेटिना के बेहतर पक्ष द्वारा केंद्रित किया गया था। प्रकाश और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए अपने प्रसंस्करण के दौरान माउस आंख के अभिविन्यास को बनाए रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि माउस आंख में रेटिना कोशिकाओं का स्थलाकृतिक वितरण33,34 है। आरपीई फ्लैट माउंट तैयारी के लिए माउस आंख के शारीरिक अभिविन्यास को बनाए नहीं रखा गया था, क्योंकि माउस आरपीई सेल के अवर स्थलाकृतिक परिवर्तनों से बेहतर नहीं देखा गया है। वास्तव में, मानव रेटिना में आरपीई स्थलाकृतिक परिवर्तन प्रदर्शित करता है जो ऑप्टिक तंत्रिका सिर35 से दूर विकीर्ण होता है, यह सुझाव देता है कि यह माउस आरपीई के लिए मामला हो सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित छवि अधिग्रहण ऑप्टिक तंत्रिका की शारीरिक स्थिति पर निर्भर करता है। इन पद्धतिगत पहलुओं को शामिल करने से शोधकर्ताओं के लिए आरपीई विकृति के परिणामों को पुन: पेश करने में मदद मिलेगी क्योंकि वे अपने एएमडी माउस मॉडल के साथ काम करते हैं।

शोधकर्ता आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल में अधिक विश्लेषणात्मक विशेषताओं को जोड़ने की इच्छा कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में चित्रित नहीं किए गए कुछ फेनोटाइपिक परिणाम बीआरएम मोटाई, आरपीई एपिकल माइक्रोविली और अन्य आरपीई अल्ट्रास्ट्रक्चरल घटकों की परीक्षा हैं। इन घटकों में माइटोकॉन्ड्रिया, वर्णक कणिकाएं और फागोसोम जैसे अन्य अंग शामिल हैं। शोधकर्ता फिजी इमेजजे कार्यक्रम का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में इन घटकों के आकार और संख्या को निर्धारित कर सकते हैं। विशेष रूप से, माइटोकॉन्ड्रिया की स्थिति पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक परिणाम हो सकता है, क्योंकि आरपीई में माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करना एएमडी36 के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय रणनीति है। एक अन्य फेनोटाइपिक परिणाम आरपीई फ्लैट माउंट पर आरपीई डिस्मोर्फिया के अतिरिक्त माप है। प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त आरपीई फ्लैट माउंट छवियों को आरपीई हेक्सागोनल आकार, पड़ोसी आरपीई कोशिकाओं की संख्या और आरईएसएचएपीई कार्यक्रम (https://github.com/nih-nei/REShAPE) 35 के साथ अन्य गुणों के लिए जांच की जा सकती है। एक और संभावित फेनोटाइपिक परिणाम यह है कि क्या आरपीई विकृति माउस रेटिना के केंद्रीय या परिधीय क्षेत्रों में होती है। ये अतिरिक्त फेनोटाइपिक विचार इस लेख में वर्णित आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल को और मजबूत करेंगे।

इस आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। इस विधि की एक सीमा आरपीई फेनोटाइपिंग के लिए अपनी आंखों को काटने के लिए चूहों का बलिदान करने की आवश्यकता है। एक विकल्प के रूप में, स्पेक्ट्रल डोमेन ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (एसडी-ओसीटी) इमेजिंग में नई प्रगति जीवित चूहों37-39 में आरपीई मोटाई और विकृति की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती है। यह उन शोधकर्ताओं के लिए फायदेमंद हो सकता है जो अपने एएमडी माउस मॉडल समूहों पर अनुदैर्ध्य अध्ययन करना चाहते हैं। इस विधि की एक और सीमा चूहों में कार्यात्मक आरपीई आकलन की कमी है। यदि शोधकर्ता चूहों में आरपीई के कार्यात्मक मूल्यांकन में रुचि रखते हैं, तो हम इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी करने और सी-वेव घटक को मापने की सलाह देते हैं, क्योंकि सी-वेव फोटोट्रांसडक्शन40 में आरपीई की कार्यात्मक भूमिका का संकेत है। इस विधि की एक और सीमा चूहों में आरपीई मार्करों के जैव रासायनिक माप की कमी है। यदि शोधकर्ता आरपीई मार्करों के स्तर की जांच करना चाहते हैं, जैसे कि सेलुलर रेटिनलडिहाइड-बाइंडिंग प्रोटीन (क्रैबलपी), रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम-विशिष्ट 65 केडीए प्रोटीन (आरपीई 65), पोटेशियम आंतरिक रूप से चैनल सबफैमिली जे सदस्य 13 (केसीएनजे 13), या बेसट्रोफिन 1 (बीईएसटी 1), तो हम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर, या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए आंखों की कटाई की सलाह देते हैं।

निष्कर्ष में, यह आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल एएमडी के पैथोलॉजिकल पहलुओं को पुनर्जीवित करने वाले माउस मॉडल का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन हो सकता है। यह प्रोटोकॉल मानकीकृत करने के लिए भी कार्य करता है कि एएमडी माउस मॉडल में आरपीई का मूल्यांकन कैसे किया जाता है, जिसे पहले साहित्य में वर्णित नहीं किया गया है। आरपीई फेनोटाइपिंग को मानकीकृत करना चूहों से एएमडी के अन्य मॉडलों में निष्कर्षों का अनुवाद करने में महत्वपूर्ण होगा, जिसमें आरपीई सेल कल्चर मॉडल4 और गैर-मानव प्राइमेट्स सहित उच्च जीव मॉडल शामिल हैं। यह एएमडी विकास के अंतर्निहित पैथोबायोलॉजिकल तंत्र की हमारी समझ में भी सहायता करेगा और संभावित रूप से इस अंधा बीमारी के लिए नए उपचार विकसित करेगा।

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Disclosures

इस प्रोटोकॉल के लेखकों के पास कोई प्रकटीकरण और हितों का टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए हमारे ऊतकों को तैयार करने के लिए पैथोलॉजी प्रयोगशाला (ट्रिप) में सतोशी किनोशिता और विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय (यूडब्ल्यू) ट्रांसलेशनल रिसर्च इनिशिएटिव्स को स्वीकार करना चाहते हैं। यह कोर यूडब्ल्यू डिपार्टमेंट ऑफ पैथोलॉजी एंड लेबोरेटरी मेडिसिन, विस्कॉन्सिन यूनिवर्सिटी कारबोन कैंसर सेंटर (पी 30 सीए 014520), और निदेशक-एनआईएच (एस 10 ओडी023526) के कार्यालय द्वारा समर्थित है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी यूडब्ल्यू बायोकैमिस्ट्री ऑप्टिकल कोर में किया गया था, जिसे यूडब्ल्यू डिपार्टमेंट ऑफ बायोकैमिस्ट्री एंडोमेंट के समर्थन से स्थापित किया गया था। इस काम को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (R01EY022086 से A. Ikeda) के अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था; आर 01ईवाई031748 सी बोवेज रिकमैन को; यूडब्ल्यू में ओप्थाल्मोलॉजी और विजुअल साइंसेज विभाग के लिए पी 30ईवाई016665; ड्यूक आई सेंटर के लिए पी 30ईवाई005722; एनआईएच टी 32ईवाई027721 से एम लैंडोव्स्की; लैंडोव्स्की, टिमोथी विलियम ट्राउट अध्यक्ष (ए इकेदा), एफएफबी फ्री फैमिली एएमडी अवार्ड (सी बोवेज रिकमैन); और अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान (ड्यूक आई सेंटर) से एक अप्रतिबंधित अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

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References

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Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

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