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Genetics

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Abstract

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine schwächende Netzhauterkrankung in alternden Bevölkerungen. Es wird allgemein angenommen, dass eine Dysfunktion des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein wichtiges pathobiologisches Ereignis bei AMD ist. Um die Mechanismen zu verstehen, die zu einer RPE-Dysfunktion führen, können Mausmodelle von Forschern verwendet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Mäuse RPE-Pathologien entwickeln können, von denen einige in den Augen von Personen beobachtet werden, bei denen AMD diagnostiziert wurde. Hier beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung von RPE-Pathologien in Mäusen. Dieses Protokoll umfasst die Präparation und Auswertung von Netzhautquerschnitten mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sowie von RPE-Flachfassungen mittels konfokaler Mikroskopie. Wir beschreiben detailliert die häufigsten Arten von murinen RPE-Pathologien, die mit diesen Techniken beobachtet werden, und Möglichkeiten, sie durch unvoreingenommene Methoden für statistische Tests zu quantifizieren. Als Proof-of-Concept verwenden wir dieses RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die RPE-Pathologien zu quantifizieren, die bei Mäusen mit Überexpression des Transmembranproteins 135 (Tmem135) und gealterten Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen beobachtet wurden. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Standardmethoden zur RPE-Phänotypisierung mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler zu präsentieren, die Mausmodelle der AMD verwenden.

Introduction

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erblindungskrankheit, die Menschen über 55 Jahre betrifft1. Viele Forscher glauben, dass eine Funktionsstörung innerhalb des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein frühes und entscheidendes pathobiologisches Ereignis bei AMD2 ist. Das RPE ist eine Monoschicht polarisierter Zellen, die die Aufgabe hat, die Homöostase benachbarter Photorezeptoren und Aderhautblutgefäße aufrechtzuerhalten3. Es gibt eine Vielzahl von Modellen, um krankheitsassoziierte Mechanismen innerhalb des RPE zu untersuchen, darunter die Zellkulturmodelle4,5 und Mäuse 6,7,8. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurden standardisierte Protokolle und Qualitätskontrollkriterien für RPE-Zellkulturmodellebeschrieben 4, jedoch wurde in keinem Bericht versucht, die Phänotypisierung des RPE in Mausmodellen zu standardisieren. Tatsächlich fehlt in vielen Veröffentlichungen zu Mausmodellen der AMD eine vollständige Beschreibung des RPE oder eine Quantifizierung der RPE-Pathologien in ihnen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Standard-RPE-Phänotypisierungsmethoden mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler mit AMD-Mausmodellen zu präsentieren.

Frühere Veröffentlichungen haben das Vorhandensein mehrerer RPE-Pathologien bei Mäusen durch drei bildgebende Verfahren festgestellt. Die Lichtmikroskopie ermöglicht es Forschern beispielsweise, die grobe Morphologie der murinen Netzhaut zu betrachten (Abbildung 1A) und RPE-Pathologien wie RPE-Verdünnung, Vakuolisierung und Migration zu erkennen. Die RPE-Ausdünnung in einem AMD-Mausmodell wird durch eine Abweichung der RPE-Höhe von den jeweiligen Kontrollen veranschaulicht (Abbildung 1B). Die RPE-Vakuolisierung kann in zwei separate Kategorien unterteilt werden: Mikrovakuolisierung (Abbildung 1C) und Makrovakuolisierung (Abbildung 1D). Die RPE-Mikrovakuolisierung wird durch das Vorhandensein von Vakuolen im RPE zusammengefasst, die seine Gesamthöhe nicht beeinflussen, während die Makrovakuolisierung durch das Vorhandensein von Vakuolen angezeigt wird, die in die äußeren Segmente der Photorezeptoren hineinragen. Die RPE-Migration wird durch das fokale Pigmentaggregat oberhalb der RPE-Monoschicht in einem Netzhautquerschnitt unterschieden (Abbildung 1E). Es sollte beachtet werden, dass migrierende RPE-Zellen in AMD-Spenderaugen Immunreaktivität gegenüber Immunzellmarkern wie dem Cluster of Differentiation 68 (CD68)9 aufweisen und Immunzellen darstellen könnten, die RPE-Trümmer verschlingen, oder RPE, die sich einerTransdifferenzierung unterziehen9. Ein weiteres bildgebendes Verfahren, die sogenannte Transmissionselektronenmikroskopie, kann es den Forschern ermöglichen, die Ultrastruktur des RPE und seiner Basalmembran sichtbar zu machen (Abbildung 2A). Mit dieser Technik kann die vorherrschende Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen identifiziert werden, die als basale laminare Ablagerung (BLamD) bekannt ist (Abbildung 2B)10. Schließlich kann die konfokale Mikroskopie die Struktur von RPE-Zellen durch die Abbildung von RPE-Flachhalterungen aufdecken (Abbildung 3A). Mit dieser Methode kann die RPE-Dysmorphie, die Abweichung des RPE von seiner klassischen Wabenform (Abbildung 3B), aufgedeckt werden. Es kann auch die RPE-Mehrkernbildung erkennen, d. h. das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen innerhalb einer RPE-Zelle (Abbildung 3C). Für eine Zusammenfassung der Arten von RPE-Pathologien, die in aktuellen AMD-Mausmodellen vorhanden sind, verweisen wir Forscher auf diese Übersichtsarbeiten aus der Literatur 6,7.

Forscher, die AMD untersuchen, sollten sich der Vor- und Nachteile der Verwendung von Mäusen zur Untersuchung von RPE-Pathologien vor dem Phänotypisierungsprotokoll bewusst sein. Mäuse zeichnen sich durch ihre relativ kurze Lebensdauer und Kosteneffizienz sowie ihre genetische und pharmakologische Manipulierbarkeit aus. Mäuse weisen auch degenerative RPE-Veränderungen auf, einschließlich RPE-Migration, Dysmorphie und Mehrkernbildung, die in AMD-Spenderaugen beobachtet werden 11,12,13,14,15,16,17; Dies deutet darauf hin, dass ähnliche Mechanismen der Entwicklung dieser RPE-Pathologien bei Mäusen und Menschen zugrunde liegen könnten. Es gibt jedoch wesentliche Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Mausstudien auf die menschliche AMD einschränken. Erstens haben Mäuse keine Makula, eine anatomisch unterschiedliche Region der menschlichen Netzhaut, die für die Sehschärfe notwendig ist und bei AMD bevorzugt betroffen ist. Zweitens werden einige RPE-Pathologien bei Mäusen, wie z. B. RPE-Verdünnung und Vakuolisierung, typischerweise nicht in AMD-Spenderaugen beobachtet18. Drittens entwickeln Mäuse keine Drusen, ein Kennzeichen der AMD-Pathologie19. Drusen sind lipid- und proteinhaltige Ablagerungen mit sehr wenigen Basalmembranproteinen, die sich zwischen der RPE-Basallamina und der inneren kollagenen Schicht der Bruchschen Membran (BrM) bilden19. Drusen unterscheiden sich sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer anatomischen Lage von BLamD, der häufigen Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen. BLamDs sind alters- und stressabhängige extrazelluläre Matrix-angereicherte Anomalien, die sich zwischen der RPE-Basallamina von BrM und den basalen Infoldings des RPE20 bilden. Interessanterweise haben BLamDs sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen eine ähnliche Proteinzusammensetzung und ein ähnliches Aussehen 6,10,21. Neuere Arbeiten deuten darauf hin, dass BLamDs in der Pathobiologie der AMD eine Rolle spielen können, indem sie das Fortschreiten der AMD in ihre späteren Stadien beeinflussen18,22; Daher können diese Ablagerungen erkranktes RPE in der Netzhaut der Maus darstellen. Das Wissen um diese Vorteile und Einschränkungen ist für Forscher, die daran interessiert sind, Ergebnisse aus Mausstudien auf AMD zu übertragen, von entscheidender Bedeutung.

In diesem Protokoll diskutieren wir die Methoden zur Vorbereitung der Augen auf Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie zur Visualisierung von RPE-Pathologien. Wir beschreiben auch, wie RPE-Pathologien für statistische Tests unvoreingenommen quantifiziert werden können. Als Proof-of-Concept verwenden wir das RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die strukturellen RPE-Pathologien zu untersuchen, die in transmembranprotein 135- (Tmem135) überexprimierenden Mäusen und gealterten Wildtyp (WT) C57BL/6J Mäusen beobachtet wurden. Zusammenfassend ist es unser Ziel, die Phänotypisierungsmethodik zur Charakterisierung des RPE in AMD-Mausmodellen zu beschreiben, da derzeit keine Standardprotokolle verfügbar sind. Forscher, die daran interessiert sind, Pathologien der Photorezeptoren oder der Aderhaut zu untersuchen und zu quantifizieren, die auch in AMD-Mausmodellen betroffen sind, finden dieses Protokoll möglicherweise nicht nützlich für ihre Studien.

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Protocol

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Wisconsin-Madison genehmigt und stehen in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.

1. Auswertung des RPE der Maus mittels Lichtmikroskopie

  1. Stellen Sie in einer Glasflasche einen Fixierpuffer mit einer Endkonzentration von 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd bei Raumtemperatur (RT) her.
    HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert höchstens 14 ml Fixierpuffer pro Maus.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd und Glutaraldehyd sind gefährliche Stoffe. Bitte befolgen Sie bei der Arbeit mit diesen Stoffen die Standardarbeitsanweisungen.
  2. Bereiten Sie ein Perfusionssystem mit Schwerkraftzufuhr auf einer saugfähigen Unterlage für die Herzperfusion in einem Abzug vor (ergänzende Abbildung 1A).
    1. Geben Sie 40 ml des Fixierpuffers in den Spritzenzylinder des Perfusionssystems (ergänzende Abbildung 1B).
    2. Drehen Sie das Ventil, bis es parallel zur Schlauchleitung ist, damit der Puffer durch die Schlauchleitung fließen kann (ergänzende Abbildung 1C). Spülen Sie die Leitung mit Puffer, bis alle Luftblasen von der Leitung entfernt sind.
    3. Drehen Sie das Ventil, bis es senkrecht zur Schlauchleitung steht, um zu verhindern, dass der Puffer in die Schlauchleitung fließt (ergänzende Abbildung 1D).
      Anmerkungen: Das Perfusionssystem ist jetzt einsatzbereit.
  3. Euthanasieren Sie die Maus, indem Sie sie in eine Kohlendioxid (CO 2) -Kammer legen und CO2 mit einer Durchflussrate von 30 % des Kammervolumens pro Minute in die Kammer fließen lassen. Sobald die Maus aufhört zu atmen, lassen Sie CO2 mindestens 1 Minute lang in die Kammer strömen. Vergewissern Sie sich, dass die Maus tot ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    HINWEIS: Euthanasie durch Injektion pharmakologischer Wirkstoffe kann in diesem Protokoll als Alternative zur CO2 - Inhalation verwendet werden.
  4. Führen Sie eine Herzdurchblutung an der euthanasierten Maus durch.
    1. Legen Sie die Maus mit dem Bauch nach oben in ein flaches Tablett in der Nähe des Perfusionssystems. Besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol (EtOH).
    2. Machen Sie vier Schnitte, um die Bauchhöhle freizulegen (ergänzende Abbildung 2A).
      1. Machen Sie mit einer gebogenen Schere und einer Pinzette einen 5 cm tieferen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke auf der äußersten linken Seite der Maus, die sich direkt unter dem Brustkorb befindet.
      2. Fahren Sie mit einem 3 cm langen medialen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke der Maus fort, der oben am unteren Schnitt beginnt.
      3. Machen Sie einen weiteren 5 cm unteren Schnitt am Ende des medialen Schnitts durch die Haut und Bauchdecke auf der äußersten rechten Seite der Maus direkt unter dem Brustkorb.
      4. Machen Sie einen weiteren 3 cm medialen Schnitt, um den Bauchhautlappen mit einer gebogenen Pinzette zu entfernen.
    3. Durchtrennen Sie das Zwerchfell und das Brustbein, um das Herz freizulegen (ergänzende Abbildung 2B).
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, das Herz, die Arterien und die Venen nicht einzuschneiden. Das Einschneiden dieser führt zu einer ineffizienten Herzdurchblutung.
    4. Führen Sie die Messnadel in die linke Herzkammer ein. Drehen Sie das Ventil, bis es parallel zur Schlauchleitung ist. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer gebogenen Schere durch, damit Blut und Fixiermittel aus dem Herzen austreten können (ergänzende Abbildung 2C).
    5. Lassen Sie 10 ml Fixierpuffer mindestens 1-2 Minuten lang in die Maus eindringen oder bis die Leber blass wird und kein Blut mehr aus dem rechten Vorhof fließt. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, drehen Sie das Ventil, bis es senkrecht zur Schlauchleitung steht, um den Durchfluss des Puffers zu stoppen.
  5. Entkernen Sie die Augen der Maus nach der Herzdurchblutung.
    1. Nehmen Sie die Maus aus der flachen Schale und legen Sie die Maus auf die saugfähige Unterlage in einem Abzug. Richten Sie den Kopf der Maus so aus, dass das linke Auge dem Experimentator zugewandt ist und das rechte Auge nicht sichtbar ist. Markieren Sie die obere Seite des Auges mit einem Gewebemarkierungsfarbstoff.
    2. Drücken Sie mit Daumen und Zeigefinger vorsichtig um die Augenhöhle nach unten, um eine Vorwölbung des Auges aus der Augenhöhle zu bewirken (ergänzende Abbildung 3A).
    3. Nehmen Sie eine gebogene Schere und halten Sie sie mit der Klinge in einem 30°-Winkel zur Augenhöhle. Schneiden Sie mit der gebogenen Schere in einem Winkel von 30° um das Auge herum (ergänzende Abbildung 3B).
      Anmerkungen: Es ist in Ordnung, überschüssiges Gewebe aus der Augenhöhle zu schneiden, um die Integrität des Augapfels zu erhalten.
    4. Entfernen Sie den Augapfel mit einer gebogenen Pinzette vom Kopf und legen Sie ihn auf eine saugfähige Unterlage. Schneiden Sie die Hornhaut mit einer Skalpellklinge Nummer 11 ein und legen Sie das Auge mit einer gebogenen Pinzette in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit 2 ml Fixierpuffer. Beschriften Sie das 2-ml-Mikroröhrchen mit der Mausidentifikation und "links", um das linke Auge anzuzeigen.
      Anmerkungen: Die Kerbe in der Hornhaut ermöglicht es dem Fixiermittel, leicht in das Auge einzudringen, um es besser zu erhalten.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.4 für das rechte Auge.
  6. Lassen Sie die Augen über Nacht in einem Schüttler in einem Raum bei 4 °C (C) bei einer Geschwindigkeit von 75 Umdrehungen pro Minute (U/min) in Fixierpuffer inkubieren.
  7. Ersetzen Sie den Fixierpuffer durch 2 ml 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS). Inkubieren Sie die Augen in 1x PBS für 10 min auf einem Shaker bei RT und 75 U/min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  8. Reinigen und sezieren Sie die Augen, um hintere Segmente zu erzeugen.
    HINWEIS: Das hintere Segment ist der Augapfel der Maus mit der neuralen Netzhaut, RPE, Aderhaut und Sklera ohne Hornhaut, Iris und Linse.
    1. Das Auge wird unter einem Präpariermikroskop in eine mit 1x PBS gefüllte Petrischale gelegt (ergänzende Abbildung 4A).
    2. Heben Sie Fett und Muskeln vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze vom Augapfel ab. Schneiden Sie das Fett und die Muskeln vorsichtig mit einer Mikropräparierschere in paralleler Richtung zum Augapfel ab, bis der Augapfel eine gleichmäßige bläulich-schwarze Farbe hat (ergänzende Abbildung 4B).
      Anmerkungen: Schneiden Sie nicht in senkrechter Richtung, da dies den Augapfel beschädigt. Wenn sich der Gewebemarkierungsfarbstoff während der Verarbeitung löst, beschriften Sie die obere Seite des Augapfels sofort.
    3. Setzen Sie eine Pinzette mit feiner Spitze an der Hornhautpunktionsstelle an. Schneiden Sie mit einer Mikropräparierschere um den Umfang der Hornhaut, beginnend an der Einstichstelle, um die Hornhaut und die Iris aus dem Augapfel zu entfernen (ergänzende Abbildung 4C).
    4. Nehmen Sie eine Pinzette mit feiner Spitze und entfernen Sie die Linse vorsichtig aus dem Augapfel, um den hinteren Augenabschnitt freizulegen (ergänzende Abbildung 4D).
    5. Legen Sie den hinteren Augenabschnitt wieder in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit 2 ml 1x PBS. Lagern Sie den hinteren Augenabschnitt im Kühlschrank bei 4 °C.
      HINWEIS: Hintere Segmente können vor der Weiterverarbeitung viele Wochen in 1x PBS bei 4 °C verbleiben.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.8, um die Augen anderer Mäuse in der Studie vorzubereiten.
  10. Verarbeiten und betten Sie eines der hinteren Segmente jeder Maus zum Schneiden in Paraffin ein. Stellen Sie sicher, dass die obere Seite des hinteren Augenabschnitts oben liegt.
    HINWEIS: Die Autoren verlassen sich bei der Durchführung dieser Aufgaben auf das Labor der University of Wisconsin-Madison (UW) Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP). Hier sind veröffentlichte Protokolle, die eine ähnliche Paraffinverarbeitungs- und Einbettungsmethode verwenden23,24.
  11. Kürzen und schneiden Sie jeden Paraffinblock, um einen 5 μm dicken Netzhautabschnitt zu erhalten, der den Sehnervenkopf umfasst, sowie vier weitere 5 μm dicke Netzhautabschnitte, die 250 μm voneinander entfernt sind. Beschriften Sie die Folien mit der Mauskennung und der Seriennummer des Seriennummernabschnitts (z. B. 1, 2, 3, 4 oder 5). Bewahren Sie die Objektträger in einem Objektträgerkasten auf.
    HINWEIS: Die Autoren verlassen sich auf das UW TRIP-Labor für ihre Dienste bei der Paraffinschnittierung. Hier sind veröffentlichte Protokolle, die eine ähnliche Paraffin-Schnittmethode verwenden25,26.
  12. Färben Sie die Objektträger, die Netzhautschnitte enthalten, mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Ein Protokoll der H&E-Färbung finden Sie in der ergänzenden Abbildung 5.
    Anmerkungen: Alle Schritte des H&E-Färbeverfahrens müssen in einem Abzug durchgeführt werden.
  13. Sammeln Sie zusammengesetzte Bilder von H&E-gefärbten Netzhautschnitten mit einem Maßstabsbalken unter Verwendung eines Lichtmikroskops bei 20-facher Vergrößerung.
  14. Quantifizieren Sie die RPE-Dicke in den Netzhautbildern, die den Sehnervenkopf für jede Probe enthalten.
    1. Laden Sie das Programm Fiji ImageJ herunter und öffnen Sie es. Ziehen Sie alle zusammengefügten Netzhautbilder, die den Sehnervenkopf enthalten, in die Fiji ImageJ-Taskleiste. Stellen Sie sicher, dass der Bildmaßstab in μm und nicht in Pixeln kalibriert ist.
      HINWEIS: Der Bildmaßstab befindet sich in der oberen linken Ecke des Fensters, das ein Netzhautbild im Programm Fiji ImageJ enthält. Wenn die Skalierung in Pixeln eingestellt ist, lesen Sie bitte die Bedienungsanleitung des Fiji ImageJ-Programms, um Pixel in μm umzuwandeln.
    2. Markieren Sie in jedem Bild alle 300 μm vom Rand des Sehnervenkopfes bis zum Ende der Netzhaut (Ora serrata). Klicken Sie auf das gerade Symbol in der Fiji ImageJ-Taskleiste. Klicken und ziehen Sie eine Linie vom Rand des Sehnervenkopfes in Richtung der Ora serrata, die 300 μm lang ist. Klicken Sie auf das Pinselwerkzeug in der Fiji ImageJ-Taskleiste und klicken Sie auf das Ende der 300-μm-Linie, um sie zu markieren.
    3. Messen Sie die RPE-Dicke in jedem markierten Intervall. Klicken Sie auf das gerade Symbol in der Fiji ImageJ-Taskleiste. Klicken Sie auf eine Linie, und ziehen Sie sie von oben nach unten (ergänzende Abbildung 6). Klicken Sie in der Menüleiste von Fiji ImageJ auf Analyze > Measure , um die RPE-Dicke zu erhalten.
    4. Übertragen Sie die RPE-Dickenmessungen in eine Tabelle und beschriften Sie die Spalte, die die Messwerte enthält, mit der Maus. Beschriften Sie eine zusätzliche Spalte mit "Markiertes Intervall" und geben Sie den Abstand zu den Sehnervenwerten ein (z. B. 300, 600, 900 usw.).
      HINWEIS: Das erste Messintervall entspricht einer Entfernung von 300 μm vom Sehnerv, das zweite Messintervall entspricht einer Entfernung von 600 μm usw.
  15. Quantifizieren Sie die Inzidenzraten der RPE-Pathologie auf der Grundlage der Netzhautbilder für jede Probe.
    1. Öffnen Sie das Programm Fiji ImageJ.
    2. Öffnen Sie die Anwendung Cell Counter im Programm Fiji ImageJ. Klicken Sie auf Plugins > Analyze > Cell Counter in der Menüleiste von Fiji ImageJ. Ziehen Sie ein Netzhautbild in die Fiji ImageJ-Taskleiste und klicken Sie im Fenster Cell Counter auf Initialisieren.
    3. Zählen Sie die Anzahl der RPE-Pathologien pro Netzhautabschnitt mit der Anwendung Cell Counter. Klicken Sie unter Zähler auf Typ 1 und dann auf alle Mikrovakuolisierungsereignisse im Bild. Klicken Sie unter Zähler auf Typ 2 und dann auf alle Makrovakuolisierungsereignisse im Bild. Klicken Sie unter Zähler auf Typ 3 und dann auf alle einzelnen Migrationsereignisse im Bild.
    4. Übertragen Sie die Nummern der RPE-Pathologien in eine Tabelle. Beschriften Sie die Zeilen entweder mit Mikrovakuolisierung, Makrovakuolisierung oder Migration und die Spalte mit Mausidentifikation.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.15.2 bis 1.15.4 für weitere Bilder des Beispiels. Ermitteln Sie den Durchschnitt der Anzahl der RPE-Pathologien pro Probe und teilen Sie ihn durch fünf, um die Inzidenzrate jeder RPE-Pathologie für die Probe in der Tabelle zu berechnen.
  16. Führen Sie statistische Analysen der RPE-Dicken in jedem Intervall und der Inzidenzraten der RPE-Pathologie durch, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in der Studie gibt.

2. Auswertung von Maus-RPE mittels Transmissionselektronenmikroskopie

  1. Schneiden Sie die anderen hinteren Segmente, die nach den Schritten 1,5-1,9 ergeben sind, mit einer Rasierklinge durch die obere Markierung in zwei Abschnitte. Markieren Sie die obere Seite der geschnittenen hinteren Segmente mit Gewebemarkierungsfarbstoff. Trennen Sie die geschnittenen hinteren Segmente in neue 2-ml-Mikroröhrchen, die 2 ml 1x PBS und Mausidentifikation enthalten.
    HINWEIS: Das hintere Maussegment ist zu groß, um es in einem Stück zu bearbeiten, und muss für die transmissionselektronenmikroskopische Verarbeitung in zwei Hälften geschnitten werden.
  2. Spülen Sie das Gewebe mit 2 ml 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,2. 10 Minuten bei RT auf dem Labortisch inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.
  3. Ersetzen Sie den 0,1 M Cacodylatpuffer durch 2 ml 2%iges Osmiumtetroxid (OsO4), verdünnt in 0,1 M Cacodylatpuffer. 1,5 h bei RT im Abzug inkubieren.
    ACHTUNG: OsO4 ist eine giftige Substanz. Bitte befolgen Sie die Standardarbeitsanweisungen, wenn Sie mit OsO4 arbeiten.
  4. Spülen Sie die Taschentücher mit 2 ml 0,1 M Cacodylatpuffer für 10 min bei RT im Abzug. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  5. Entwässern Sie das Gewebe mit abgestuften EtOH-Verdünnungen von 50 % bis 100 % bei RT im Abzug. Ein Protokoll für das Dehydratationsverfahren finden Sie in der ergänzenden Abbildung 7.
  6. Entfernen Sie 100% EtOH aus dem Gewebe und geben Sie 2 ml Propylenoxid in das Gewebe. Bei RT im Abzug 15 min inkubieren. Entfernen Sie das Propylenoxid aus den Taschentüchern und geben Sie 2 ml frisches Propylenoxid in die Taschentücher. Bei RT im Abzug 15 min inkubieren.
    ACHTUNG: Propylenoxid ist eine giftige Substanz. Bitte befolgen Sie die Standardarbeitsanweisungen, wenn Sie mit Propylenoxid arbeiten.
  7. Entfernen Sie Propylenoxid aus den Taschentüchern und geben Sie 2 ml einer 1:1-Mischung aus Propylenoxid und Harz in die Taschentücher. Über Nacht unter Vakuum im Abzug bei RT stehen lassen.
    VORSICHT: Harz ist eine gefährliche Substanz für den Menschen. Bitte befolgen Sie bei der Arbeit mit Kunstharz die Standardarbeitsanweisungen des Labors.
  8. Ersetzen Sie die 1:1-Mischung aus Propylenoxid und Harz aus Taschentüchern durch 2 ml reines Harz. Über Nacht unter Vakuum im Abzug bei RT belassen.
  9. Betten Sie das Gewebe in Harz ein. Legen Sie ein Etikett mit Mauskennzeichnung in Bleistift und einen Tropfen Harz in die Form. Positionieren Sie das Gewebe auf dem Harztropfen. Füllen Sie die Form mit Harz und stellen Sie sie für 1 h bei RT im Abzug unter Vakuum.
  10. Positionieren Sie die Etiketten und Proben mit einer Pinzette mit feiner Spitze, wobei die hintere Seite des hinteren Augenmuschelabschnitts oben liegt. Lassen Sie die Form über Nacht bei 65 °C in einem Ofen im Abzug stehen.
  11. Nehmen Sie die Formen aus dem Ofen. Lassen Sie die Formen auf dem Tischtisch auf RT abkühlen. Nehmen Sie die Blöcke aus den Formen.
    HINWEIS: Die Blöcke sind jetzt bereit zum Trimmen.
  12. Formen Sie die Harzblöcke mit einer Rasierklinge zu einem Trapez. Schneiden Sie die Harzblöcke mit einem Mikrotom ab, bis der Sehnervenkopf sichtbar ist. Fahren Sie mit einem Diamantmesser fort, um halbdünne Abschnitte mit einer Dicke von 0,5 μm aus den Harzblöcken zu schneiden.
    HINWEIS: Hier ist ein veröffentlichtes Protokoll zur Mikrotomschnittierung27. Falls gewünscht, können 0,5 μm dicke halbdünne Schnitte aus den Harzblöcken entnommen und gefärbt werden, um die Integrität der Probe zu bewerten.
  13. Schneiden Sie mit einem Ultramikrotom einen 70 nm dicken, ultradünnen Schnitt aus jedem beschnittenen Block aus. Sammeln Sie einen 70 nm dicken, ultradünnen Schnitt auf einem 400-maschigen Dünnstab-Kupfergitter. Legen Sie das Gitter in eine Gitteraufbewahrungsbox und beschriften Sie den Steckplatz mit der Mauskennung.
    HINWEIS: Hier ist ein veröffentlichtes Protokoll zur Ultramikrotom-Schnittung28.
  14. Färben Sie die Gitter 5 min lang mit 2%igem Uranylacetat und dann 5 min mit 3,5%iger Bleicitratlösung bei RT im Abzug.
    ACHTUNG: Uranylacetat und Bleicitrat sind gefährliche Stoffe. Bitte befolgen Sie bei der Arbeit mit diesen Stoffen die Standardarbeitsanweisungen.
  15. Mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei einer 15.000-fachen Vergrößerung erhalten Sie Bilder für jede Probe, bei der sich die Gitterlinien des Kupfergitters mit RPE und BrM schneiden.
    HINWEIS: Es sollten mindestens 20 bis 35 Bilder pro Abschnitt und 40 bis 70 Bilder pro Probe vorhanden sein.
  16. Quantifizieren Sie die BLamD-Höhen in den Bildern für die Proben in der Studie.
    1. Öffnen Sie das Programm Fiji ImageJ. Ziehen Sie alle Bilder aus dem Beispielabschnitt in die Fiji ImageJ-Taskleiste. Stellen Sie sicher, dass die Bilder in μm und nicht in Pixeln kalibriert sind.
    2. Messen Sie die BLamD-Höhe in den Bildern. Klicken Sie auf das gerade Symbol in der Fiji ImageJ-Taskleiste. Klicken Sie auf eine Linie, und ziehen Sie sie von der elastischen Schicht von BrM bis zur Oberseite der höchsten Ablagerung im Bild (ergänzende Abbildung 8). Klicken Sie in der Menüleiste von Fiji ImageJ auf Analysieren > Messen , um die BLamD-Höhe im Bild abzurufen.
      HINWEIS: Wenn im Bild keine BLamDs vorhanden sind, ziehen Sie eine Linie von der elastischen Lamina des BrM zur Basallamina des RPE.
    3. Übertragen Sie die BLamD-Höhen in eine Tabelle und beschriften Sie sie mit der Maus.
  17. Berechnen Sie die kumulativen Häufigkeiten der BLamD-Höhen pro Genotyp und die Durchschnittswerte der BLamD-Höhen pro Maus in der Tabelle. Führen Sie eine statistische Analyse der Durchschnittswerte der BLamD-Höhen durch, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in der Studie gibt.

3. Evaluierung des RPE der Maus mittels konfokaler Mikroskopie

  1. Sammle Augen von den Mäusen. Euthanasieren Sie die Mäuse gemäß dem in Schritt 1.3 beschriebenen Verfahren. Entkernen Sie die Augen mit Schritt 1.5. Legen Sie die Augen mit einer gebogenen Pinzette in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit 2 ml 1x PBS und Mausidentifikation.
    HINWEIS: Passen Sie die Mäuse nicht dunkel an, da die Interdigitalisierung der Photorezeptoren und der apikalen RPE-Fortsätze eine bessere Visualisierung des RPE durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.
  2. Reinigen und präparieren Sie die Mausaugen sofort, um die hinteren Augenmuscheln der Maus zu erzeugen.
    HINWEIS: Die hintere Augenmuschel unterscheidet sich vom hinteren Augenabschnitt, da sie die neuronale Netzhaut nicht enthält.
    1. Das Auge wird unter einem Präpariermikroskop in eine Petrischale mit 1x PBS überführt (ergänzende Abbildung 9A).
    2. Entfernen Sie Fett und Muskeln aus dem Augapfel, wie in Schritt 1.8.2 beschrieben (ergänzende Abbildung 9B).
    3. Schneiden Sie die Hornhaut des Augapfels mit einer Skalpellklinge mit der Nummer 11 ein. Entfernen Sie die Hornhaut und die Iris, wie in Schritt 1.8.3 beschrieben (ergänzende Abbildung 9C).
    4. Ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette mit feiner Spitze heraus. Nehmen Sie zwei Pinzetten mit feiner Spitze und trennen Sie vorsichtig die Neuralnetzhaut vom hinteren Segment.
    5. Schneiden Sie vorsichtig die Neuralnetzhaut am Sehnervenkopf durch, um sie aus der hinteren Augenmuschel zu entfernen (ergänzende Abbildung 9D).
    6. Setzen Sie die hintere Augenmuschel in ein neues 2-ml-Mikroröhrchen ein, das 500 μl 1x PBS mit Mausidentifikation enthält.
  3. Fixieren Sie die hinteren Augenmuscheln mit Methanol (MeOH) (ergänzende Abbildung 10).
    HINWEIS: Schritt 3.3 dauert ca. 2 h und 40 min.
    1. Geben Sie 500 μl MeOH in das Gewebe. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren.
    2. Entfernen Sie die 500 μl der Lösung aus dem Gewebe und fügen Sie 500 μl MeOH hinzu. 5 min auf einem Shaker bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
    3. Entfernen Sie die gesamte Lösung aus dem Gewebe und fügen Sie 500 μl MeOH hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für mindestens 2 h bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Alternativ zu Schritt 3.3.3 kann die hintere Augenmuschel über Nacht in MeOH auf einem Shaker bei 75 U/min in einem 4 °C-Raum inkubiert werden.
    4. Geben Sie 500 μl 1x PBS in das Gewebe. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren.
    5. Entfernen Sie die 500 μl der Lösung aus dem Gewebe und fügen Sie 500 μl 1x PBS hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
    6. Entfernen Sie die gesamte Lösung aus dem Gewebe und ersetzen Sie sie durch 500 μl 1x PBS.
      HINWEIS: Die Taschentücher werden durch das MeOH vollständig fixiert und können mindestens 1 Monat im 4 °C Kühlschrank aufbewahrt werden.
  4. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung der hinteren Augenmuscheln durch, um Tight Junctions und Kerne des RPE sichtbar zu machen (ergänzende Abbildung 11).
    1. Entfernen Sie die 500 μl 1x PBS aus den Proben und fügen Sie 100 μl verdünntes 10%iges normales Eselsserum in 1x PBS-Lösung hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 30 min bei RT inkubieren.
    2. Entfernen Sie die verdünnte 10%ige normale Eselsserumlösung aus den Proben und fügen Sie 100 μl einer 1:50-Verdünnung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen Zonula Occludens-1 (ZO-1) in 1x PBS hinzu. Die Proben werden in einen 4 °C-Raum überführt und über Nacht auf einem Schüttler bei 75 U/min inkubiert.
    3. Entfernen Sie die Antikörperverdünnung aus den Proben und fügen Sie 2 ml 1x PBS hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 10 min bei RT inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.
    4. Entfernen Sie das 1x PBS aus den Proben. Den Proben werden 100 μl einer 1:250-Verdünnung eines Esel-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers mit einem 488-Fluorophor-konjugierten Tag und einer 1:250-Verdünnung von 4',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) in 1x PBS zugegeben. Decken Sie die Proben mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie auf einem Schüttler bei 75 U/min für 2 h bei RT.
      Anmerkungen: Die Proben müssen vollständig mit Aluminiumfolie bedeckt sein, um ein Ausbleichen zu verhindern.
    5. Entfernen Sie die Antikörper- und DAPI-Verdünnungen aus den Proben. Geben Sie 2 ml 1x PBS zu den Proben, bedecken Sie sie wieder mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie auf einem Schüttler bei 75 U/min für 10 Minuten bei RT. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal.
      HINWEIS: Die Tight Junctions und Kerne des RPE sind nun vollständig markiert bzw. gefärbt.
  5. Montieren Sie die hinteren Augenmuscheln auf Objektträgern.
    1. Beschriften Sie einen Objektträger mit einer Mauskennung. Übertragen Sie die hintere Augenmuschel mit der Aderhautseite nach unten auf einen Objektträger unter einem Präpariermikroskop. Geben Sie einen Tropfen 1x PBS in die hintere Augenmuschel, um ein Austrocknen zu verhindern (ergänzende Abbildung 12).
    2. Schneiden Sie die hintere Augenmuschel mit einer Skalpellklinge mit der Nummer 11 an vier Stellen ab, die vier Quadranten ergeben, die den Himmelsrichtungen entsprechen (d. h. Norden, Osten, Süden und Westen). Tupfen Sie überschüssiges PBS mit Gewebe vom Umfang der hinteren Augenmuschel ab. Glätten Sie die hintere Augenmuschel vorsichtig mit einer Kamelhaarbürste und einer Pinzette mit feiner Spitze (ergänzende Abbildung 12).
      HINWEIS: Das resultierende Produkt wird jetzt als RPE-Flachhalterung bezeichnet.
    3. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium in die RPE-Flachhalterung und legen Sie ein Deckglas darauf. Tragen Sie klaren Fingernagellack auf, um das Deckglas zu versiegeln, und lassen Sie es mindestens 30 Minuten bei RT in einer geschlossenen Schublade trocknen. Legen Sie die Objektträger in eine Objektträgerbox und bewahren Sie die Box im 4 °C warmen Kühlschrank auf.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass keine Blasen auf die flache RPE-Halterung gelangen. RPE-Flachmontierungen können innerhalb eines Zeitrahmens von 2 Wochen abgebildet werden.
  6. Erhalten Sie ein Bild von jedem der vier Quadranten, die den Sehnerv des RPE-Flachbajonetts umgeben, auf einem konfokalen Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung für jede Probe. Ein Beispiel für ein RPE-Flatmount-Bild finden Sie in der ergänzenden Abbildung 13A.
    HINWEIS: Es kann erforderlich sein, eine Z-Stapel-Bildgebung der flachen RPE-Halterungen durchzuführen, bei der mehrere Bilder aufgenommen und gestapelt werden, um Maßunterschiede der flachen RPE-Halterung auszugleichen.
  7. Zeichnen Sie die Tight Junctions der RPE-Zellen in jedem RPE-Flatmount-Bild nach. Ein Beispiel für ein nachgezeichnetes RPE-Flatmount-Bild finden Sie in der ergänzenden Abbildung 13B.
    1. Öffnen Sie das Programm Fiji ImageJ. Ziehen Sie ein RPE-Flatmount-Image in die Fiji ImageJ-Taskleiste. Stellen Sie sicher, dass das Bild in Mikrometern und nicht in Pixeln kalibriert ist.
    2. Doppelklicken Sie auf das Symbol des Overlay-Pinselwerkzeugs in der Fiji ImageJ-Taskleiste, um die Pinselbreite auf 3, die Transparenz auf 0 und die Farbe auf Rot festzulegen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schließen" im Fenster "Überlagerungspinsel-Werkzeug".
    3. Klicken Sie auf das Symbol für das Überlagerungspinsel-Werkzeug . Klicken und ziehen Sie auf die Tight Junctions aller RPE-Zellen, die sich vollständig im Bild befinden.
      HINWEIS: Falls ein Nachzeichnungsfehler gemacht wird, doppelklicken Sie auf das Symbol des Überlagerungspinselwerkzeugs und klicken Sie im Fenster des Überlagerungspinselwerkzeugs auf das Feld Rückgängig, um den Nachzeichnungsfehler aus dem Bild zu entfernen.
    4. Klicken Sie auf das Rechtecksymbol in der Taskleiste von Fiji ImageJ. Klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie es um den Rand des Bildes. Klicken Sie in der Menüleiste von Fiji ImageJ auf Bearbeiten > Löschen , um die nachgezeichneten Linien beizubehalten und alle blauen und grünen Farben aus dem Bild zu entfernen.
    5. Speichern Sie das Trace-Bild an einem geeigneten Ort mit Mausidentifikation, Quadrantenposition (d. h. Norden, Süden, Osten oder Westen) und einer CP-Suffixbezeichnung.
      HINWEIS: Speichern Sie das RPE-Ablaufverfolgungsbild nicht, bevor Sie Schritt 3.7.4 abgeschlossen haben.
  8. Berechnen Sie die RPE-Zellflächen für jede Stichprobe.
    1. Legen Sie einen Speicherort für die Dateien aus der RPE-Bereichsanalyse fest, indem Sie einen Ordner auf dem Desktopbildschirm des Computers erstellen. Generieren Sie Unterordner für jedes RPE-Trace-Image und beschriften Sie die Unterordner mit der Mausidentifikation sowie der Quadrantenposition (d. h. Norden, Süden, Osten oder Westen).
    2. Installieren und öffnen Sie das Cell Profiler-Programm29. Laden Sie die Projektdatei Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1) herunter. Öffnen Sie die Datei Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj, indem Sie in der Menüleiste des Cell Profiler-Programms auf Datei > Projekt öffnen klicken.
    3. Ziehen Sie ein RPE-Trace-Bild in das Feld Image > Drop Files and Folders Here im Programmfenster Cell Profiler.
    4. Geben Sie den Speicherort des Ordners in das Cell Profiler-Programm ein, der dem RPE-Trace-Image entspricht. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgabeeinstellungen in der unteren linken Ecke des Cell Profiler-Programmfensters und geben Sie den Speicherort des Ordners in die Textfelder Standardeingabeordner und Standardausgabeordner ein.
    5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bilder analysieren in der unteren linken Ecke des Cell Profiler-Programmfensters. Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, wird auf dem Bildschirm das Fenster Analyse abgeschlossen angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK im Fenster Analyse abgeschlossen .
      HINWEIS: Diese Aktion generiert eine CSV-Datei und ein JPEG-Bild. Die CSV-Datei enthält die Bereiche für die RPE-Zellen innerhalb des Trace-Bildes. Das JPEG-Bild entspricht dem RPE-Trace-Bild, bei dem jede RPE-Zelle mit einer Zahl beschriftet ist (ergänzende Abbildung 13C).
    6. Übertragen Sie die RPE-Bereiche aus der CSV-Datei in eine Tabelle. Beschriften Sie die Tabelle mit der Mauskennung.
    7. Führen Sie eine Qualitätskontrolle der Daten durch, indem Sie bestätigen, dass jeder RPE-Bereich in der CSV-Datei mit einer vollständig nachgezeichneten RPE-Zelle in einem JPEG-Bild verknüpft ist. Entfernen Sie alle Werte aus der Tabelle, die nicht den vollständig verfolgten RPE-Zellen entsprechen.
    8. Kehren Sie zum Cell Profiler-Programm zurück. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Namen des RPE-Ablaufverfolgungsbilds im Feld Dateien und Ordner hier ablegen, und wählen Sie Liste löschen aus, um das Bild aus dem Cell Profiler-Programm zu entfernen.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 3.8.3 bis 3.8.8, um die RPE-Größen für die verbleibenden drei RPE-Trace-Bilder der Probe zu berechnen.
  9. Quantifizieren Sie die RPE-Zellengrößendurchschnitte für jede Stichprobe in der Tabelle.
  10. Quantifizieren Sie die RPE-Zelldichten für jede Probe in der Tabelle. Um die RPE-Zelldichte zu berechnen, dividieren Sie die Gesamtzahl der RPE-Zellen pro Quadrant durch die Gesamtfläche der RPE-Zellen pro Quadrant, die vom Cell Profiler-Programm erkannt wurde. Bestimmen Sie den Durchschnitt der RPE-Zelldichten aus den vier Quadranten pro Probe.
  11. Quantifizieren Sie die Anzahl der mehrkernigen RPE-Zellen pro RPE-Flachhalterung für jede Probe. Verwenden Sie die Anwendung Cell Counter im Programm Fiji ImageJ, wie in den Schritten 1.15.1 bis 1.15.3 beschrieben, um die Anzahl der RPE-Zellen mit mehr als drei Kernen in vier Quadranten der Probe zu zählen.
  12. Führen Sie statistische Analysen der durchschnittlichen RPE-Zellgröße und -dichte sowie der Anzahl der mehrkernigen RPE-Zellen durch, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in der Studie gibt.

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Representative Results

Die Vervollständigung des in diesem Artikel beschriebenen RPE-Phänotypisierungsprotokolls bietet eine quantitative Analyse der strukturellen RPE-Anomalien, die häufig in Mausmodellen der AMD beobachtet werden. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu bestätigen, verwendeten wir es bei Mäusen, von denen bekannt ist, dass sie RPE-Pathologien aufweisen, einschließlich transgener Mäuse, die WT Tmem135 überexprimieren, angetrieben durch den Huhn-Beta-Aktin-Promotor (Tmem135 TG)30, und gealterte C57BL/6J-Mäuse31,32. Ziel dieser Experimente ist es, Forschern, die neu in Mausmodellen sind, repräsentative Ergebnisse zu zeigen, die mit den in diesem Protokoll beschriebenen Methoden erzielt werden könnten.

Wir hielten uns an die Methoden in Schritt 1 des Protokolls zur Verarbeitung und Auswertung von Augen von WT- und Tmem135 TG-Mäusen, um RPE-Pathologien mittels Lichtmikroskopie zu bewerten. Wir fanden heraus, dass 4 Monate alte Tmem135 TG-Mäuse in zwei gemessenen Intervallen eine signifikante Verringerung der RPE-Dicke im Vergleich zu altersangepasster WT durch eine ANOVA mit Post-hoc-Tukey-Test aufwiesen (Abbildung 4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das RPE in den 4 Monate alten Tmem135 TG-Mäusen dünner ist als in altersgleichen WT-Mäusen in 600 und 900 μm Entfernung vom Sehnerv.

Darüber hinaus berechneten wir mit den Methoden von Schritt 1 des Protokolls die Inzidenz von RPE-Pathologien, einschließlich Mikrovakuolisierung, Makrovakuolisierung und Migration von drei 25 Tage alten WT- und Tmem135 TG-Mäusen (Abbildung 5A). Die durchschnittliche Häufigkeit von RPE-Mikrovakuolisierungspathologien pro Objektträger betrug bei WT-Mäusen 0,67 ± 0,31 und bei Tmem135-TG-Mäusen 7,07 ± 0,61 (Abbildung 5B). Es gab keine RPE-Makrovakuolisierung in WT-Mäusen, aber es gab im Durchschnitt 5,33 ± 2,02 Makrovakuolisierungsereignisse in Tmem135 TG-Mäusen (Abbildung 5C). Schließlich waren die Raten der migrierenden RPE-Zellen pro Objektträger bei WT-Mäusen null und bei Tmem135-TG-Mäusen 0,4 ± 0,35 (Abbildung 5D). Nach der Durchführung eines studentischen t-Tests unterschied sich die Inzidenz von RPE-Mikrovakuolisierung und Mikrovakuolisierung signifikant zwischen WT- und Tmem135-TG-Mäusen . Die höhere Inzidenz von RPE-Migrationszellen in Tmem135 TG-Mäusen unterschied sich jedoch nicht signifikant von WT (p = 0,1161). Diese Daten zeigen, dass die RPE-Mikrovakuolisierung und Makrovakuolisierung, aber nicht die Migration, bei 25 Tage alten Tmem135 TG signifikant höher ist als bei WT-Mäusen.

In Anlehnung an die Methoden des Protokolls, die in Schritt 2 enthalten sind, präparierten wir Netzhautschnitte von 2 Monate alten und 24 Monate alten WT C57BL/6J-Mäusen für die Transmissionselektronenmikroskopie, um das Vorhandensein und die Höhe von BLamDs zu analysieren. Wir fanden BLamDs in 24 Monate alten WT-Netzhäuten, die in 2 Monate alten WT-Netzhäuten nicht vorhanden waren (Abbildung 6A). Wir stellten die Höhen der BLamDs in der 24 Monate alten WT-Netzhaut dar, indem wir die kumulativen Häufigkeiten ihres Auftretens berechneten und auftrugen. Die kumulativen Häufigkeiten der BLamD-Höhen wurden mit der Ablagerungshöhe verglichen, um die Verteilung der Ablagerungshöhen zu veranschaulichen. Es gibt eine Verschiebung nach rechts der Linie für die 24 Monate alten WT BLamD-Höhen im Vergleich zu den 2 Monate alten WT BLamD-Höhen, was eine Zunahme der Ablagerungen bei 24 Monate alten WT-Mäusen zeigt (Abbildung 6B). Diese Grafik wird durch einen größeren Durchschnitt der BLamD-Höhen in 24 Monate alten WT-Netzhaut (1,01 μm ± 0,43 μm) unterstützt als in 2 Monate alten WT-Netzhaut (0,23 μm ± 0,017 μm), die sich durch den t-Test eines Studenten signifikant unterschieden (Abbildung 6C). Zusammenfassend schlussfolgern wir, dass 24 Monate alte WT-Mäuse im Vergleich zu 2 Monate alten WT-Mäusen große BLamDs im Sub-RPE-Raum ihrer Netzhaut aufweisen.

Wir wandten die Methoden zur Präparation von Augen von 4 Monate alten WT- und Tmem135 TG-Mäusen in Schritt 3 an, um flache RPE-Halterungen für die Detektion und Analyse von RPE-Dysmorphie und Multinukleation zu generieren. In diesem Protokoll definierten wir die RPE-Dysmorphie durch Änderungen der RPE-Zellgröße und -dichte in einem AMD-Mausmodell relativ zu ihren Kontrollen. Wir fanden heraus, dass das RPE in 4 Monate alten Tmem135 TG-Mäusen dysmorph ist (Abbildung 7A). Die RPE in Tmem135 TG-Netzhäuten sind größer (806,89 μm 2 ± 252,67 vs. 291,69 μm 2 ± 26,31) und weniger dicht (0,0014 Zellen/μm 2 ± 0,00039 vs. 0,0033 Zellen/μm 2 ± 0,00024) als altersangepasste WT-Netzhäute (Abbildung 7B,C). Darüber hinaus befanden sich in der Netzhaut von Tmem135 TG mehr mehrkernige RPE-Zellen im Vergleich zu WT-Kontrollen (8,04 Zellen ± 5,54 vs. 0,33 Zellen ± 0,29) (Abbildung 7D). Alle diese Parameter erreichten eine statistische Signifikanz mit einem studentischen t-Test. Zusammen haben 4 Monate alte Tmem135 TG-Mäuse mehr dysmorphe und mehrkernige RPE-Zellen als 4 Monate alte WT-Mäuse.

Figure 1
Abbildung 1: Lichtmikroskopisch nachgewiesene RPE-Pathologien. Repräsentative Bilder von normalem RPE in WT (A) und abnormalem RPE in Tmem135 TG Mäusen (B-E). Zu den RPE-Pathologien, die bei Tmem135 TG-Mäusen beobachtet wurden, gehören RPE-Ausdünnung (B), Makrovakuolisierung (C), Mikrovakuolisierung (D) und Migration (E). Jede Pathologie wird durch einen schwarzen Pfeil dargestellt. Maßstabsbalken = 100 μm. Vergrößerung = 20x. Abkürzungen: RGC = retinale Ganglienzellschicht, IPL = innere plexiforme Schicht, INL = innere Kernschicht, OPL = äußere plexiforme Schicht, ONL = äußere Kernschicht, IS = Photorezeptor-Innensegmente, OS = Photorezeptor-Außensegmente, RPE = retinales pigmentiertes Epithel, Cho = Aderhaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: RPE-Pathologien, die mittels Transmissionselektronenmikroskopie nachgewiesen wurden. Repräsentative Bilder von (A) RPE in jungen CFH-H/H- und (B) 2-jährigen CFH-H/H-Mäusen, die reichlich basale laminare Ablagerungen (BLamDs) aufweisen. BLamDs werden mit gelben Punkten im Bild nachgezeichnet. Maßstabsbalken = 800 nm. Vergrößerung = 15.000x. Abkürzungen: N = Zellkern, M = Mitochondrium, P = Pigmentgranulat, BI = basale Faltungen, EL = elastische Lamina, RPE = retinales pigmentiertes Epithel, BrM = Bruchsche Membran, Cho = Aderhaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: RPE-Pathologien, die durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen wurden. Repräsentative Bilder von (A) normalem RPE von 8 Monate alten WT und (B) abnormalem RPE von 8 Monate alten Tmem135 TG-Mäusen, die RPE-Dysmorphie aufweisen. Das weiße Quadrat wird vergrößert (C), um eine mehrkernige RPE-Zelle mit drei Kernen darzustellen. Die grüne Farbe steht für Anti-ZO1-assoziierte RPE-Tight Junctions und die blaue Farbe für die DAPI-Färbung von RPE-Kernen. Maßstabsbalken = 50 μm. Vergrößerung = 20x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: RPE-Dicke in 4 Monate alten Wildtyp- (WT) und Tmem135 TG-Mäusen. (A) Repräsentative Bilder der Netzhaut von 4 Monate alten WT- und Tmem135 TG (TG)-Mäusen. Vergrößerung = 20x. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Liniendiagramme der RPE-Dickenmessungen in 4 Monate alten WT (schwarz) und Tmem135 TG Mäusen (grün) bis zu 3.000 μm vom Sehnerv entfernt. Die Zahlen nach dem Genotyp geben die Anzahl der in dieser Studie verwendeten Mäuse an. *p < 0,05, ANOVA mit Post-hoc-Tukey-Test. Alle Daten sind Mittelwert ± sd. In Abbildung 1 finden Sie die Abkürzungen der Netzhautschichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: RPE-Pathologien in 25 Tage alten Tmem135 TG-Mäusen. (A) Repräsentative Bilder der RPE-Mikrovakuolisierung, Makrovakuolisierung und Migration in drei 25 Tage alten Tmem135 TG (TG) Mäusen. RPE-Pathologien werden in jedem Bild durch schwarze Pfeile hervorgehoben. Vergrößerung = 40x. Maßstabsbalken = 20 μm. (B-D) Quantifizierung von RPE-Mikro- und Makrovakuolisierungs- sowie migratorischen RPE-Zellen in 25 Tage alten WT- und Tmem135 TG-Mäusen. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Mäuse an, die in dieser Studie verwendet wurden. *P < 0,05 und ****P < 0,0001, T-Test des Schülers. Alle Daten sind ± sd. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Ultrastrukturelle Analyse von BLamDs in jungen und älteren WT-Netzhäuten . (A) Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen von 2 Monate alten und 24 Monate alten WT RPE. Vergrößerung = 15.000x. Maßstabsbalken = 800 nm. Ein Beispiel für eine basale laminare Ablagerung (BLamD) ist mit einer Klammer dargestellt. (B) Kumulative Frequenzen der BLamD-Höhen. (C) BLamD-Höhendurchschnitt. Die Zahlen in Klammern geben die Gesamtzahl der Mäuse pro Genotyp an, die in dieser Studie verwendet wurden. **P < 0,01, T-Test des Schülers. Alle Daten sind Mittelwert ± sd. In Abbildung 2 finden Sie die Abkürzungen der Netzhautschichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: RPE-Flatmounts zeigen RPE-Pathologien in Tmem135 TG-Mäusen. (A) Repräsentative Bilder von 4 Monate alten WT und Tmem135 TG (TG) RPE-Flachmontierungen mit Anti-ZO-1 in Grün und DAPI in Blau. Vergrößerung = 20x. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) RPE-Zellgröße, (C) RPE-Zelldichte und (D) RPE-Mehrkernbildung in 4 Monate alten WT- und Tmem135 TG-Mäusen. Die Zahl in Klammern gibt die Anzahl der Mäuse an, die in der Studie verwendet wurden. *P < 0,05, **P < 0,01 und ****P < 0,0001, Schüler-T-Test. Alle Daten sind ± sd. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus und der Anwendung der Herzperfusion. (A) Perfusionssystem mit Schwerkraftzufuhr. (B) Spritzenzylinder des Perfusionssystems für Fixierpuffer. (C) Das Ventil muss gedreht werden, bis es parallel zur Schlauchleitung ist, damit der Puffer durch die Schlauchleitung fließen kann. (D) Das Ventil muss gedreht werden, bis es senkrecht zur Schlauchleitung steht, um zu verhindern, dass der Puffer in die Schlauchleitung fließt. In Biorender erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzend Abbildung 2: Schematische Darstellung des Verfahrens bei der Herzdurchblutung einer Maus. (A) Vier Schnitte, um die Bauchhöhle freizulegen. (B) Schnitt durch das Zwerchfell und das Brustbein, um das Herz freizulegen. (C) Messnadel, die in die linke Herzkammer eingeführt wird. Das Ventil wird so lange gedreht, bis es parallel zur Schlauchleitung ist. Der rechte Vorhof wird mit einer gebogenen Schere geschnitten, damit Blut und Fixiermittel austreten können. In Biorender erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Schematische Darstellung des Verfahrens zur Enukleation von Augen einer Maus. (A) Drücken Sie mit Daumen und Zeigefinger vorsichtig nach unten um die Augenhöhle, um ein Vorstehen des Auges aus der Augenhöhle zu verursachen. (B) Nehmen Sie eine gebogene Schere und halten Sie sie mit der Klinge in einem Winkel von 30° zur Augenhöhle. Schneiden Sie mit der gebogenen Schere in einem 30°-Winkel um das Auge herum. Farbige Punkte stellen die Platzierung der Finger auf der Maus oder der gebogenen Schere dar. In Biorender erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Bilder der Sektion des Mausauges, um den hinteren Augenabschnitt der Maus zu erhalten. (A) Das Auge wird in ein Präpariermikroskop übertragen. (B) Fett und Muskeln, die aus dem Augapfel entfernt werden. (C) Hornhaut und Iris aus dem Augapfel entfernt. (D) Linse aus dem Augapfel entfernt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbeverfahren. Schematische Darstellung des H&E-Verfahrens zur Färbung von in Paraffin eingebetteten Netzhautschnitten. Pfeile zeigen die Übertragung zwischen den Schritten an. Die Uhrzeit der einzelnen Schritte wird in roter Schrift angegeben. Reagenzien für die Färbung werden in schwarzer Schrift in Glasfärbebehältern bereitgestellt. Für jedes Reagenz, das im obigen Diagramm enthalten ist, sollte ein Glasfärbebehälter vorbereitet werden. Alle Schritte müssen in einem Abzug durchgeführt werden. Achten Sie beim Hinzufügen eines Deckglases zu einer Folie darauf, dass keine Blasen auf die Folie gelangen. Nach Abschluss des Verfahrens können Objektträger in einer Objektträgerbox aufbewahrt werden. In Biorender erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Beispiel für eine RPE-Dickenmessung. Der schwarze Pfeil zeigt eine rote Linie von oben nach unten am RPE. Diese Linie kann gemessen werden, um die Dicke des RPE zu bestimmen. Maßstabsbalken = 100 μm. Vergrößerung = 20x. Der eingerahmte Bereich wird verkleinert, um die RPE besser anzeigen zu können. In Abbildung 1 finden Sie die Abkürzungen der Netzhautschichten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: EtOH-Dehydratisierungsverfahren der hinteren Maussegmente für die TEM-Verarbeitung. In Biorender erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Beispiel für eine BLamD-Höhenmessung. Die rote Linie zeigt den größten BLamD in diesem Bild. Gelbe Punkte markieren BLamDs im Bild. Diese rote Linie kann gemessen werden, um die Höhe dieses BLamD in diesem Bild zu bestimmen. Maßstabsbalken = 800 nm. Vergrößerung = 15.000x. In Abbildung 2 finden Sie die Abkürzungen der Netzhautschichten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Präparation des Mausauges für RPE Flat Mount. (A) Das Auge wird unter einem Präpariermikroskop in eine Petrischale mit 1x PBS übertragen. (B) Fett und Muskeln, die aus dem Augapfel entfernt werden. (C) Hornhaut und Iris aus dem Augapfel entfernt. (D) Linse und Netzhaut aus dem Augapfel entfernt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 10: Methanol (MeOH)-Fixationsverfahren an den hinteren Augenmuscheln der Maus. In Biorender erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 11: Immunfluoreszenzverfahren zur Markierung von Tight Junctions und Zellkernen von RPE-Zellen. Diagramm, das die Schritte der Immunfluoreszenztechnik aus diesem Protokoll darstellt. Beachten Sie, dass diese Technik 2 Tage in Anspruch nimmt. Alle Schritte erfolgen bei RT und auf einem Shaker mit einer Drehzahl von 75 U/min, sofern im Diagramm nicht ausdrücklich vermerkt. Der primäre (1°) Antikörper, der in dieser Studie verwendet wurde, war polyklonaler Kaninchen-Anti-ZO1, und der sekundäre (2º)-Antikörper, der in dieser Studie verwendet wurde, war 488 Fluorophor-konjugierte Esel-Anti-Kaninchen-IgG. Sobald der Sekundärantikörper und DAPI den Proben zugesetzt wurden, müssen die Proben in Aluminiumfolie eingewickelt werden, um sie vor Photobleichung der Probe zu schützen. In Biorender erstelltes Bild. Abkürzungen: NDS = normales Eselsserum, Ab = Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 12: Darstellung von Schnitten, um vier Quadranten der Maus-RPE-Flachmontage zu erhalten. N = Norden, E = Osten, S = Süden, W = Westen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 13: Beispiele für RPE-Endpunkte für die Flat-Mount-Analyse. (A) RPE-Flatmount-Bild. (B) Bild der RPE-Grenze. (C) RPE Cell Profiler analysiertes Bild. Vergrößerung = 20x. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

In diesem Artikel haben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung der strukturellen RPE-Pathologien von Mausmodellen vorgestellt. Wir beschrieben die Schritte, die für die Verarbeitung der Augen für verschiedene bildgebende Verfahren wie Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie erforderlich sind, sowie die Quantifizierung typischer Pathologien, die mit diesen bildgebenden Verfahren beobachtet werden. Wir haben die Wirksamkeit unseres RPE-Phänotypisierungsprotokolls durch die Untersuchung von Tmem135 TG und 24 Monate alten WT-Mäusen nachgewiesen, da diese Mäuse RPE-Pathologien aufweisen30,31,32. Dieses Protokoll kann auf jede genetisch veränderte oder pharmakologisch behandelte Maus angewendet werden, die RPE-Pathologien wie RPE-Ausdünnung, Vakuolisierung, Migration und Dysmorphie sowie BLamDs 6,7 aufweisen kann. Obwohl die RPE-Pathologien, die in Tmem135 TG und 24 Monate alten WT-Mäusen beobachtet wurden, auch in anderen AMD-Mausmodellen vorhanden sind 7,30, ist es für den Forscher wichtig, sich mit dem für seine Studien ausgewählten AMD-Mausmodell vertraut zu machen, da das Alter des Auftretens und der Schweregrad der RPE-Pathologien seines AMD-Mausmodells vom Tmem135 abweichen können TG und 24 Monate alte WT-Mäuse. Forscher müssen möglicherweise mehr Mäuse für ihre Studien verwenden, als die Anzahl der Mäuse verwendet wurde, um die in diesem Artikel gezeigten repräsentativen Ergebnisse zu erzielen, wenn die Darstellung von RPE-Pathologien in ihrem jeweiligen AMD-Mausmodell variabel ist. Darüber hinaus stehen AMD-Forschern derzeit viele AMD-Mausmodelle zur Verfügung, haben jedoch keine vollständigen Beschreibungen ihrer RPE-Pathologien, was möglicherweise erfordert, dass Forscher Vorstudien durchführen, um diese Informationen zu erhalten.

Obwohl die Art und Weise, wie Mausaugen für die verschiedenen bildgebenden Verfahren verarbeitet werden, geändert werden kann, ist es von entscheidender Bedeutung, die quantitative Bewertung struktureller RPE-Anomalien, wie im Protokoll beschrieben, beizubehalten. So wurden beispielsweise fünf H&E-gefärbte Netzhautschnitte angefertigt, um die Anzahl der RPE-Mikrovakuolisierung, Makrovakuolisierung und Migrationsereignisse zu zählen, was es den Forschern ermöglichte, RPE-Pathologien an mehreren Stellen in der Netzhaut der Maus zu bewerten. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung eines 400-Mesh-Dünnstab-Kupfer-Elektronenmikroskopie-Gitters zur Beurteilung der ultrastrukturellen Anomalien des RPE. Das elektronenmikroskopische Gitter bietet einen Rahmen, um eine Netzhautprobe systematisch und unvoreingenommen durch Transmissionselektronenmikroskopie zu bewerten und 40 bis 70 Bilder pro Netzhautschnitt zu erhalten, um das Vorhandensein von BLamDs zu untersuchen. Dies kann mit einem elektronenmikroskopischen Schlitzgitter nicht erreicht werden, und wir empfehlen, sie nicht mit diesem Protokoll zu verwenden. Schließlich ermöglicht die Aufnahme von Bildern mit 20-facher Vergrößerung aus den vier Quadranten einer flachen RPE-Montierung den Forschern, große Bereiche von murinem RPE auf Dysmorphie und Mehrkernbildung zu untersuchen. Den Forschern steht es frei, dieses Protokoll zu erweitern und in ihren Studien zusätzliche Netzhautschnitte auf RPE-Pathologien zu untersuchen. Zusammen ermöglichen diese Methoden den Forschern, umfangreiche Daten zu sammeln, um Rückschlüsse auf die strukturellen RPE-Pathologien zu ziehen, die in ihren AMD-Mausmodellen vorhanden sein könnten.

Ein weiteres wichtiges Merkmal dieses Protokolls ist die Konsistenz der RPE-Phänotypisierungsmethoden. So wurden beispielsweise alle Augen, die für die Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie verwendet wurden, für die Schnitte an der oberen Seite der Mausnetzhaut orientiert. Für die Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie ist es wichtig, die Orientierung des Mausauges während der gesamten Verarbeitung beizubehalten, da das Mausauge eine topographische Verteilung der Netzhautzellen aufweist33,34. Die anatomische Orientierung des Mausauges wurde für die RPE-Flat-Mount-Präparation nicht beibehalten, da keine topographischen Veränderungen der RPE-Zelle der Maus beobachtet wurden. Tatsächlich zeigt das RPE in der menschlichen Netzhaut topographische Veränderungen, die vom Sehnervenkopf35 wegstrahlen, was darauf hindeutet, dass dies bei RPE der Maus der Fall sein könnte. Schließlich beruht die in diesem Protokoll beschriebene Bildaufnahme auf der anatomischen Positionierung des Sehnervs. Die Einbeziehung dieser methodischen Aspekte wird dazu beitragen, die Ergebnisse von RPE-Pathologien für Forscher bei der Arbeit mit ihren AMD-Mausmodellen zu reproduzieren.

Forscher möchten dem RPE-Phänotypisierungsprotokoll möglicherweise weitere analytische Merkmale hinzufügen. Einige phänotypische Ergebnisse, die in diesem Protokoll nicht enthalten sind, sind die Untersuchung der BrM-Dicke, der apikalen RPE-Mikrovilli und anderer ultrastruktureller RPE-Komponenten. Zu diesen Komponenten gehören Mitochondrien, Pigmentgranula und andere Organellen wie Phagosomen. Die Größe und Anzahl dieser Komponenten können die Forscher in den elektronenmikroskopischen Aufnahmen, die mit diesem Protokoll aufgenommen wurden, mit dem Programm Fiji ImageJ bestimmen. Insbesondere der Status der Mitochondrien könnte ein wichtiger phänotypischer Endpunkt sein, den es zu berücksichtigen gilt, da das Targeting von Mitochondrien im RPE eine wichtige therapeutische Strategie für AMD36 ist. Ein weiteres phänotypisches Ergebnis sind zusätzliche Messungen der RPE-Dysmorphie an RPE-Flachhalterungen. Mit dem REShAPE-Programm (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35 können mit dem REShAPE-Programm ()35 die hexagonale Form von RPE, die Anzahl benachbarter RPE-Zellen und andere Eigenschaften untersucht werden. Ein weiteres mögliches phänotypisches Ergebnis ist, ob RPE-Pathologien in den zentralen oder peripheren Bereichen der Netzhaut der Maus auftreten. Diese zusätzlichen phänotypischen Überlegungen werden das in diesem Artikel beschriebene RPE-Phänotypisierungsprotokoll weiter stärken.

Es gibt einige Einschränkungen dieses RPE-Phänotypisierungsprotokolls. Eine Einschränkung dieser Methode ist die Notwendigkeit, Mäuse zu opfern, um ihre Augen für die RPE-Phänotypisierung zu ernten. Als Alternative ermöglichen neue Fortschritte in der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich die Quantifizierung der RPE-Dicke und der Pathologien in lebenden Mäusen37-39. Dies kann für Forscher von Vorteil sein, die Längsschnittstudien an ihren AMD-Mausmodellkohorten durchführen möchten. Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist das Fehlen funktioneller RPE-Beurteilungen in Mäusen. Wenn Forscher an einer funktionellen Beurteilung des RPE bei Mäusen interessiert sind, empfehlen wir die Durchführung einer Elektroretinographie und die Messung der c-Wellen-Komponente, da die c-Welle auf die funktionelle Rolle des RPE bei der Phototransduktion hinweist40. Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist das Fehlen biochemischer Messungen von RPE-Markern in Mäusen. Wenn Forscher die Konzentrationen von RPE-Markern untersuchen möchten, wie z. B. das zelluläre Retinaldehyd-bindende Protein (CRABLP), das retinale Pigmentepithel-spezifische 65-kDa-Protein (RPE65), das Kalium-Inwärts-Rektifikationskanal-Untermitglied J-Mitglied 13 (KCNJ13) oder Bestrophin 1 (BEST1), empfehlen wir die Entnahme von Augen für die Immunhistochemie, die quantitative Echtzeit-PCR oder die Western-Blot-Analyse.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses RPE-Phänotypisierungsprotokoll eine wichtige Ressource für Forscher sein kann, die Mausmodelle verwenden, die pathologische Aspekte der AMD rekapitulieren. Dieses Protokoll dient auch dazu, die Bewertung des RPE in AMD-Mausmodellen zu standardisieren, was bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde. Die Standardisierung der RPE-Phänotypisierung wäre entscheidend für die Übertragung der Ergebnisse von Mäusen auf andere AMD-Modelle, einschließlich RPE-Zellkulturmodelle4 und höhere Organismenmodelle, einschließlich nichtmenschlicher Primaten. Es würde auch dazu beitragen, die pathobiologischen Mechanismen zu verstehen, die der AMD-Entwicklung zugrunde liegen, und möglicherweise neue Therapien für diese erblindende Krankheit zu entwickeln.

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Disclosures

Die Autoren dieses Protokolls haben keine Offenlegungen und Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Satoshi Kinoshita und dem Translational Research Initiatives in Pathology Laboratory (TRIP) der University of Wisconsin (UW) für die Vorbereitung unseres Gewebes auf die Lichtmikroskopie. Dieser Kern wird von der Abteilung für Pathologie und Labormedizin der UW, dem Carbone Cancer Center der University of Wisconsin (P30 CA014520) und dem Büro des Direktors-NIH (S10OD023526) unterstützt. Die konfokale Mikroskopie wurde am UW Biochemistry Optical Core durchgeführt, der mit Unterstützung des UW Department of Biochemistry Endowment eingerichtet wurde. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse des National Eye Institute (R01EY022086 an A. Ikeda; R01EY031748 an C. Bowes Rickman; P30EY016665 an die Abteilung für Augenheilkunde und Sehwissenschaften der UW; P30EY005722 zum Duke Eye Center; NIH T32EY027721 an M. Landowski; F32EY032766 an M. Landowski), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); und ein uneingeschränkter Zuschuss von der Forschung zur Verhinderung von Blindheit (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

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References

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