Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ett protokoll för att utvärdera och kvantifiera retinala pigmenterade epitelpatologier i musmodeller av åldersrelaterad makuladegeneration

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Musmodeller kan vara användbara verktyg för att undersöka biologin hos retinalt pigmenterat epitel (RPE). Det har fastställts att möss kan utveckla en rad RPE-patologier. Här beskriver vi ett fenotypningsprotokoll för att belysa och kvantifiera RPE-patologier hos möss med hjälp av ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi.

Abstract

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en försvagande retinal sjukdom hos åldrande befolkningar. Det anses allmänt att dysfunktion av retinal pigmenterat epitel (RPE) är en viktig patobiologisk händelse vid AMD. För att förstå mekanismerna som leder till RPE-dysfunktion kan musmodeller användas av forskare. Det har fastställts av tidigare studier att möss kan utveckla RPE-patologier, av vilka några observeras i ögonen på individer som diagnostiserats med AMD. Här beskriver vi ett fenotypningsprotokoll för att bedöma RPE-patologier hos möss. Detta protokoll innefattar beredning och utvärdering av retinala tvärsnitt med hjälp av ljusmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi, liksom av RPE-plana fästen med konfokalmikroskopi. Vi beskriver de vanliga typerna av murina RPE-patologier som observeras av dessa tekniker och sätt att kvantifiera dem genom opartiska metoder för statistisk testning. Som bevis på konceptet använder vi detta RPE-fenotypningsprotokoll för att kvantifiera RPE-patologierna som observerats hos möss som överuttrycker transmembranprotein 135 (Tmem135) och åldrade vildtyp C57BL / 6J-möss. Huvudmålet med detta protokoll är att presentera standard RPE-fenotypningsmetoder med opartiska kvantitativa bedömningar för forskare som använder musmodeller av AMD.

Introduction

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en vanlig blindsjukdom som drabbar populationer över 55 år1. Många forskare tror att dysfunktion i retinalpigmenterat epitel (RPE) är en tidig och avgörande patobiologisk händelse i AMD2. RPE är ett monolager av polariserade celler som har till uppgift att upprätthålla homeostas hos närliggande fotoreceptorer och koroidala blodkärl3. En mängd olika modeller finns för att undersöka sjukdomsassocierade mekanismer inom RPE, inklusive cellodlingsmodeller 4,5 och möss 6,7,8. En ny rapport har beskrivit standardiserade protokoll och kvalitetskontrollkriterier för RPE-cellodlingsmodeller4, men ingen rapport har försökt standardisera fenotypningen av RPE i musmodeller. Faktum är att många publikationer om musmodeller av AMD saknar en fullständig beskrivning av RPE eller kvantifiering av RPE-patologierna i dem. Det övergripande målet med detta protokoll är att presentera standard RPE-fenotypningsmetoder med opartiska kvantitativa bedömningar för forskare som använder AMD-musmodeller.

Tidigare publikationer har noterat förekomsten av flera RPE-patologier hos möss genom tre avbildningstekniker. Till exempel tillåter ljusmikroskopi forskare att se den murina näthinnans grova morfologi (figur 1A) och upptäcka RPE-patologier som RPE-gallring, vakuolisering och migration. RPE-gallring i en AMD-musmodell exemplifieras av en avvikelse i RPE-höjden från deras respektive kontroller (figur 1B). RPE-vakuolisering kan delas in i två separata kategorier: mikrovakuolisering (figur 1C) och makrovakuolisering (figur 1D). RPE-mikrovakuolisering sammanfattas av närvaron av vakuoler i RPE som inte påverkar dess totala höjd, medan makrovakuolisering indikeras av närvaron av vakuoler som sticker ut i fotoreceptorernas yttre segment. RPE-migration kännetecknas av fokalaggregatet av pigment ovanför RPE-monolagret i ett retinalt tvärsnitt (figur 1E). Det bör noteras att migrerande RPE-celler i AMD-donatorögon uppvisar immunreaktivitet mot immuncellmarkörer, såsom kluster av differentiering 68 (CD68)9, och kan representera immunceller som uppslukar RPE-skräp eller RPE som genomgår transdifferentiering9. En annan bildteknik som kallas transmissionselektronmikroskopi kan tillåta forskare att visualisera ultrastrukturen hos RPE och dess basalmembran (figur 2A). Denna teknik kan identifiera den dominerande sub-RPE-avlagringen hos möss, känd som den basala laminära avlagringen (BLamD) (figur 2B)10. Slutligen kan konfokalmikroskopi avslöja RPE-cellernas struktur genom att avbilda RPE-plana fästen (figur 3A). Denna metod kan avslöja RPE-dysmorfi, avvikelsen från RPE från dess klassiska bikakeform (figur 3B). Det kan också detektera RPE-multinukleation, närvaron av tre eller flera kärnor i en RPE-cell (figur 3C). För en sammanfattning av de typer av RPE-patologier som finns i nuvarande AMD-musmodeller hänvisar vi forskare till dessa recensioner från litteraturen 6,7.

Forskare som studerar AMD bör vara medvetna om fördelarna och nackdelarna med att använda möss för att undersöka RPE-patologier före fenotypprotokollet. Möss är fördelaktiga på grund av deras relativt korta livslängd och kostnadseffektivitet, liksom deras genetiska och farmakologiska manipulerbarhet. Möss uppvisar också RPE-degenerativa förändringar, inklusive RPE-migration, dysmorfi och multinukleation, som observeras i AMD-donatorögon 11,12,13,14,15,16,17; Detta tyder på att liknande mekanismer kan ligga till grund för utvecklingen av dessa RPE-patologier hos möss och människor. Det finns dock viktiga skillnader som begränsar översättningsbarheten av musstudier till humant AMD. För det första har möss inte en makula, en anatomiskt distinkt region av den mänskliga näthinnan som är nödvändig för synskärpa som företrädesvis påverkas vid AMD. För det andra ses vissa RPE-patologier hos möss, som RPE-gallring och vakuolisering, vanligtvis inte i AMD-donatorögon18. För det tredje utvecklar möss inte drusen, ett kännetecken för AMD-patologi19. Drusen är lipid- och proteininnehållande avlagringar med mycket få basalmembranproteiner som bildas mellan RPE-basallamina och det inre kollagenskiktet i Bruchs membran (BrM)19. Drusen skiljer sig från BLamD, den vanliga sub-RPE-fyndigheten hos möss, både i deras sammansättning och anatomiska läge. BLamDs är ålders- och spänningsberoende extracellulära matrisberikade abnormiteter som bildas mellan RPE-basallamina i BrM och de basala invecklingarna i RPE20. Intressant nog har BLamDs en liknande proteinsammansättning och utseende hos både möss och människor 6,10,21. Nya arbeten tyder på att BLamDs kan verka i AMD: s patobiologi genom att påverka AMD: s progression till dess senare stadier18,22; Således kan dessa avlagringar representera sjuk RPE i musnäthinnan. Kunskap om dessa fördelar och begränsningar är avgörande för forskare som är intresserade av att översätta resultat från musstudier till AMD.

I detta protokoll diskuterar vi metoderna för att förbereda ögon för ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi för att visualisera RPE-patologier. Vi beskriver också hur man kvantifierar RPE-patologier på ett opartiskt sätt för statistisk testning. Som bevis på konceptet använder vi RPE-fenotypningsprotokollet för att undersöka de strukturella RPE-patologierna som observerats i transmembranprotein 135- (Tmem135) överuttryckande möss och åldrade vildtyp (WT) C57BL / 6J-möss. Sammanfattningsvis strävar vi efter att beskriva fenotypningsmetoden för att karakterisera RPE i AMD-musmodeller, eftersom det för närvarande inte finns några standardprotokoll tillgängliga. Forskare som är intresserade av att undersöka och kvantifiera patologier hos fotoreceptorerna eller choroid, som också påverkas i AMD-musmodeller, kanske inte tycker att detta protokoll är användbart för sina studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som involverar djurämnen har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Wisconsin-Madison och överensstämmer med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Utvärdering av mus RPE med ljusmikroskopi

  1. Gör en fixativ buffert som har en slutlig koncentration av 2% paraformaldehyd och 2% glutaraldehyd vid rumstemperatur (RT) i en glasflaska.
    OBS: Detta protokoll kräver högst 14 ml fixativ buffert per mus.
    VARNING: Paraformaldehyd och glutaraldehyd är farliga ämnen. Följ standardrutinerna när du arbetar med dessa ämnen.
  2. Förbered ett gravitationsmatarperfusionssystem på en absorberande underplatta för hjärtperfusion i en dragskåp (kompletterande figur 1A).
    1. Placera 40 ml fixeringsbuffert i sprutcylindern i perfusionssystemet (kompletterande figur 1B).
    2. Vrid ventilen tills den är parallell med slangledningen så att bufferten kan strömma genom slangledningen (kompletterande figur 1C). Spola linjen med buffert tills alla luftbubblor har tagits bort från linjen.
    3. Vrid ventilen tills den är vinkelrät mot slangledningen för att förhindra att bufferten rinner in i slangledningen (kompletterande figur 1D).
      OBS: Perfusionssystemet är nu klart för användning.
  3. Avliva musen genom att placera den i en koldioxidkammare (CO 2) och låt CO2 strömma in i kammaren med en flödeshastighet av 30% av kammarens volym per minut. När musen slutar andas, låt CO2 strömma in i kammaren i minst 1 min. Kontrollera att musen är död innan du går vidare till nästa steg.
    OBS: Eutanasi genom injektion av farmakologiska medel kan användas i detta protokoll som ett alternativ till CO2-inhalation .
  4. Utför hjärtperfusion på den avlivade musen.
    1. Överför musen till ett grunt fack nära perfusionssystemet med buken uppåt. Spraya buken med 70% etanol (EtOH).
    2. Gör fyra snitt för att exponera bukhålan (kompletterande figur 2A).
      1. Skapa ett 5 cm sämre snitt med böjd sax och pincett genom huden och bukväggen längst till vänster på musen som ligger direkt under bröstkorgen.
      2. Fortsätt att göra ett 3 cm medialt snitt genom musens hud och bukvägg som börjar på toppen av det sämre snittet.
      3. Gör ytterligare 5 cm sämre snitt i slutet av det mediala snittet genom huden och bukväggen längst till höger om musen direkt under bröstkorgen.
      4. Gör ytterligare ett 3 cm medialt snitt för att ta bort bukhudfliken med böjda pincett.
    3. Skär genom membranet och bröstbenet för att exponera hjärtat (kompletterande figur 2B).
      OBS: Var försiktig så att du inte nickar hjärtat, artärerna och venerna. Nicking dessa kommer att leda till en ineffektiv hjärtperfusion.
    4. Sätt in mätnålen i hjärtans vänstra kammare. Vrid ventilen tills den är parallell med slangledningen. Klipp det högra förmaket med en böjd sax så att blod och fixeringsmedel kan lämna hjärtat (kompletterande figur 2C).
    5. Låt 10 ml fixeringsbuffert tränga in i musen i minst 1-2 minuter, eller tills levern blir blek i färg och inget blod rinner ut ur höger förmak. När perfusionen är klar, vrid ventilen tills den är vinkelrät mot slangledningen för att stoppa buffertflödet.
  5. Enucleate ögonen från musen efter hjärtperfusion.
    1. Ta bort musen från det grunda facket och placera musen på den absorberande underplattan i ett dragskåp. Orientera musens huvud så att vänster öga vetter mot experimentet och höger öga är utom synhåll. Kommentera den överlägsna sidan av ögat med ett vävnadsmarkeringsfärgämne.
    2. Tryck försiktigt ner med tummen och pekfingret runt ögonhålan för att orsaka utskjutning av ögat från ögonhålan (kompletterande figur 3A).
    3. Ta böjd sax och håll den med bladet i 30° vinkel från ögonhålan. Fortsätt att klippa runt ögat med den böjda saxen i 30 ° vinkel (kompletterande figur 3B).
      OBS: Det är okej att skära överflödig vävnad från ögonhålan för att bevara ögonglobens integritet.
    4. Ta bort ögongloben från huvudet med böjda pincett och placera den på en absorberande underplatta. Nick hornhinnan med ett skalpellblad nummer 11 och placera ögat med böjda pincett i ett 2 ml mikrorör med 2 ml fixativ buffert. Märk 2 ml mikroröret med musidentifiering och "vänster" för att indikera vänster öga.
      OBS: Nicket i hornhinnan gör det möjligt för fixeringsmedlet att lätt tränga in i ögat för att bättre bevara det.
    5. Upprepa steg 1.5.1-1.5.4 för höger öga.
  6. Låt ögonen inkubera i fixeringsbuffert över natten på en skakapparat i ett rum på 4 °C (C) med en hastighet av 75 varv per minut (rpm).
  7. Byt ut fixeringsbufferten mot 2 ml 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS). Inkubera ögonen i 1x PBS i 10 minuter på en shaker vid RT och 75 rpm. Upprepa detta steg två gånger.
  8. Rengör och dissekera ögonen för att generera bakre segment.
    OBS: Det bakre segmentet är musögongloben med neural näthinna, RPE, choroid och sclera utan hornhinnan, iris och linsen.
    1. Placera ögat i en petriskål fylld med 1x PBS under ett dissekeringsmikroskop (kompletterande figur 4A).
    2. Lyft försiktigt bort fett och muskler från ögongloben med finspetsad pincett. Trimma försiktigt fettet och muskeln med mikrodissekerande sax i parallell riktning mot ögongloben tills ögongloben har en enhetlig blåaktig svart färg (kompletterande figur 4B).
      OBS: Skär inte vinkelrätt, eftersom detta skadar ögongloben. Om vävnadsmarkeringsfärgen lossnar under bearbetningen, kommentera omedelbart den överlägsna sidan av ögongloben.
    3. Placera pincett med fin spets på hornhinnans punkteringsplats. Skär runt hornhinnans omkrets, börja vid punkteringsstället, med mikrodissekerande sax, för att ta bort hornhinnan och iris från ögongloben (kompletterande figur 4C).
    4. Ta pincett med fin spets och ta försiktigt bort linsen från ögongloben för att ge det bakre segmentet (kompletterande figur 4D).
    5. Placera det bakre segmentet tillbaka i ett 2 ml mikrorör med 2 ml 1x PBS. Förvara det bakre segmentet i ett kylskåp på 4 °C.
      OBS: Bakre segment kan förbli i 1x PBS vid 4 ° C i många veckor innan vidare bearbetning.
  9. Upprepa steg 1.3-1.8 för att förbereda ögonen från andra möss i studien.
  10. Bearbeta och bädda in ett av de bakre segmenten från varje mus i paraffin för sektionering. Se till att den överlägsna sidan av det bakre segmentet är överst.
    OBS: Författarna förlitar sig på University of Wisconsin-Madison (UW) Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) laboratorium för att utföra dessa uppgifter. Här publiceras protokoll med en liknande paraffinbearbetnings- och inbäddningsmetod23,24.
  11. Trimma och sektionera varje paraffinblock för att erhålla en 5 μm tjock näthinnesektion som inkluderar synnervhuvudet, samt ytterligare fyra 5 μm tjocka näthinnesektioner som är 250 μm från varandra. Märk bilderna med musidentifiering och serienumret (dvs. 1, 2, 3, 4 eller 5). Lagra bilderna i en bildruta.
    OBS: Författarna förlitar sig på UW TRIP-laboratoriet för sina tjänster inom paraffinsektionering. Här publiceras protokoll med liknande paraffinsnittsmetod25,26.
  12. Färga objektglasen som innehåller näthinnesnitt med hematoxylin och eosin (H&E). Ett protokoll för H&E-färgning finns i kompletterande figur 5.
    OBS: Alla steg i H&E-färgningsproceduren måste slutföras i en dragskåp.
  13. Samla sydda bilder av H &E-färgade näthinnesektioner med en skalstång med hjälp av ett ljusmikroskop vid 20x förstoring.
  14. Kvantifiera RPE-tjockleken i näthinnebilderna som innehåller synnervhuvudet för varje prov.
    1. Ladda ner och öppna Fiji ImageJ-programmet. Dra alla sydda näthinnebilder som innehåller synnervhuvudet till Fiji ImageJ-aktivitetsfältet. Kontrollera att bildskalan är kalibrerad i μm och inte pixlar.
      OBS: Bildskalan finns i det övre vänstra hörnet av fönstret som innehåller en näthinnebild i Fiji ImageJ-programmet. Om skalan är inställd i pixlar, se bruksanvisningen för Fiji ImageJ-programmet för att konvertera pixlar till μm.
    2. Markera varje 300 μm intervall i varje bild från kanten av synnervhuvudet till slutet av näthinnan (ora serrata). Klicka på ikonen Straight i Fiji ImageJ-aktivitetsfältet. Klicka och dra en linje från kanten av synnervhuvudet mot ora serrata som är 300 μm lång. Klicka på penselverktyget i Fiji ImageJ-aktivitetsfältet och klicka på slutet av 300 μm-linjen för att markera den.
    3. Mät RPE-tjockleken vid varje markerat intervall. Klicka på ikonen Straight i Fiji ImageJ-aktivitetsfältet. Klicka och dra en linje från RPE:s överkant till nederkant (kompletterande bild 6). Klicka på Analysera > mäta i Fiji ImageJ-menyraden för att få RPE-tjockleken.
    4. Överför RPE-tjockleksmätningarna till ett kalkylblad och märk kolumnen som innehåller mätningar med musidentifiering. Märk en extra kolumn med "Märkt intervall" och ange avståndet bort från optiska nervvärden (dvs. 300, 600, 900, etc.)
      OBS: Det första uppmätta intervallet motsvarar 300 μm bort från synnerven, det andra uppmätta intervallet motsvarar 600 μm bort, och så vidare.
  15. Kvantifiera RPE-patologins incidens baserat på retinalbilderna för varje prov.
    1. Öppna Fiji ImageJ-programmet.
    2. Öppna Cell Counter-applikationen i Fiji ImageJ-programmet. Klicka på Plugins > Analysera > cellräknare i menyraden Fiji ImageJ. Dra en retinalbild till Fiji ImageJ-aktivitetsfältet och klicka på Initiera i fönstret Cell Counter .
    3. Räkna antalet RPE-patologier per retinal sektion med hjälp av Cell Counter-applikationen . Klicka på Typ 1 under Räknare och klicka sedan på alla mikrovakuoliseringshändelser i bilden. Klicka på Typ 2 under Räknare och klicka sedan på alla makrovakuoliseringshändelser i bilden. Klicka på Typ 3 under Räknare och klicka sedan på alla enskilda migreringshändelser i bilden.
    4. Överför numren på RPE-patologierna till ett kalkylblad. Märk raderna med antingen mikrovakuolisering, makrovakuolisering eller migrering och kolumnen med musidentifiering.
    5. Upprepa steg 1.15.2-1.15.4 för andra bilder av exemplet. Genomsnitt antalet RPE-patologier per prov och dela med fem för att beräkna incidensen för varje RPE-patologi för provet i kalkylbladet.
  16. Utför statistisk analys av RPE-tjocklekarna vid varje intervall och RPE-patologins incidens för att avgöra om det finns signifikanta skillnader mellan grupper i studien.

2. Utvärdering av mus RPE genom transmissionselektronmikroskopi

  1. Skär de andra bakre segmenten som efter steg 1,5-1,9 gav på mitten genom det överlägsna märket i två sektioner med ett rakblad. Anteckna den överlägsna sidan av de sektionerade bakre segmenten med vävnadsmarkeringsfärgämne. Separera de sektionerade bakre segmenten i nya 2 ml mikrorör innehållande 2 ml 1x PBS och musidentifiering.
    OBS: Musens bakre segment är för stort för att bearbeta i ett stycke och måste skäras i hälften för transmissionselektronmikroskopibehandling.
  2. Skölj vävnaderna med 2 ml 0,1 M cakodylatbuffert, pH 7,2. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur på bänkskivan. Upprepa detta steg två gånger till.
  3. Ersätt 0,1 M cakodylatbufferten med 2 ml 2% osmiumtetroxid (OsO4) utspädd i 0,1 M cakodylatbuffert. Inkubera i 1,5 h vid RT i dragskåpet.
    VARNING: OsO4 är ett giftigt ämne. Följ standardprocedurer när du arbetar med OsO4.
  4. Skölj vävnaderna med 2 ml 0,1 M cacodylatbuffert i 10 min vid RT i dragskåpet. Upprepa detta steg en gång.
  5. Dehydrera vävnaderna med graderade EtOH-utspädningar från 50% till 100% vid RT i dragskåpet. Ett protokoll för uttorkningsproceduren finns i kompletterande figur 7.
  6. Ta bort 100% EtOH från vävnaderna och tillsätt 2 ml propylenoxid till vävnaderna. Inkubera vid rumstemperatur i dragskåpet i 15 minuter. Ta bort propylenoxiden från vävnaderna och tillsätt 2 ml färsk propylenoxid till vävnaderna. Inkubera vid rumstemperatur i dragskåpet i 15 minuter.
    VARNING: Propylenoxid är ett giftigt ämne. Följ standardprocedurer när du arbetar med propylenoxid.
  7. Ta bort propylenoxid från vävnaderna och tillsätt 2 ml av en 1:1 blandning av propylenoxid och harts till vävnaderna. Lämna över natten under vakuum i dragskåpet på RT.
    VARNING: Harts är ett farligt ämne för människor. Följ laboratoriets standardrutiner när du arbetar med harts.
  8. Byt ut 1:1-blandningen av propylenoxid och harts från vävnader med 2 ml rent harts. Låt stå över natten under vakuum i dragskåpet på RT.
  9. Bädda in vävnaderna i harts. Lägg en etikett med musidentifiering i blyerts och en droppe harts i formen. Placera vävnaden på hartsdroppen. Fyll formen med harts och placera under vakuum i 1 timme vid RT i dragskåpet.
  10. Flytta etiketterna och proverna med finspetsad pincett, med den bakre sidan av den bakre ögonmusslan ovanpå. Låt formen stå över natten vid 65 °C i en ugn i dragskåpet.
  11. Ta bort formarna från ugnen. Låt formarna svalna till RT på bänkskivan. Ta bort blocken från formarna.
    OBS: Blocken är nu redo för trimning.
  12. Forma hartsblocken med ett rakblad för att bilda en trapets. Trimma hartsblocken med en mikrotom tills det optiska nervhuvudet är synligt. Fortsätt att använda en diamantkniv för att skära halvtunna sektioner från hartsblocken med en tjocklek av 0,5 μm.
    OBS: Här är ett publicerat protokoll om mikrotomsektionering27. Om så önskas kan 0,5 μm tjocka halvtunna sektioner från hartsblocken samlas upp och färgas för att utvärdera provets integritet.
  13. Skär en 70 nm tjock ultratunn sektion från varje trimmat block med en ultramikrotom. Samla en 70 nm tjock ultratunn sektion på ett 400-mesh tunnstångigt kopparnät. Placera rutnätet i en gallerförvaringslåda och märk platsen med musidentifiering.
    OBS: Här är ett publicerat protokoll om ultramikrotomsektionering28.
  14. Färga gallren med 2% uranylacetat i 5 min och sedan med 3,5% blycitratlösning i 5 min vid RT i dragskåpet.
    VARNING: Uranylacetat och blycitrat är farliga ämnen. Följ standardprocedurerna när du arbetar med dessa ämnen.
  15. Hämta bilder för varje prov med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop med en förstoring av 15 000x, där rutnätlinjerna i kopparnätet skär RPE och BrM.
    OBS: Det bör finnas minst 20 till 35 bilder per sektion och 40 till 70 bilder per prov.
  16. Kvantifiera BLamD-höjder i bilderna för proverna i studien.
    1. Öppna Fiji ImageJ-programmet. Dra alla bilder från exempelavsnittet till Fiji ImageJ-aktivitetsfältet. Kontrollera att bilderna är kalibrerade i μm och inte pixlar.
    2. Mät BLamD-höjden i bilderna. Klicka på ikonen Straight i Fiji ImageJ-aktivitetsfältet. Klicka och dra en linje från BrM:s elastiska lamina till toppen av den högsta avlagringen i bilden (kompletterande figur 8). Klicka på Analysera > mäta i menyraden i Fiji ImageJ för att hämta BLamD-höjden i bilden.
      OBS: Om det inte finns några BLamDs i bilden, rita sedan en linje från den elastiska lamina av BrM till den basala lamina av RPE.
    3. Överför BLamD-höjderna till ett kalkylblad och etikett med musidentifiering.
  17. Beräkna de kumulativa frekvenserna för BLamD-höjder per genotyp och medelvärden för BLamD-höjder per mus i kalkylbladet. Utför statistisk analys av medelvärdena av BLamD-höjder för att avgöra om det finns signifikanta skillnader mellan grupper i studien.

3. Utvärdering av mus RPE genom konfokalmikroskopi

  1. Samla ögon från mössen. Avliva mössen enligt proceduren som beskrivs i steg 1.3. Enucleate ögonen med steg 1.5. Placera ögonen med böjda pincett i ett 2 ml mikrorör med 2 ml 1x PBS och musidentifiering.
    OBS: Mörkanpassa inte mössen, eftersom interdigitaliseringen av fotoreceptorerna och RPE-apikala processer möjliggör bättre visualisering av RPE genom konfokalmikroskopi.
  2. Rengör och dissekera musögonen omedelbart för att generera musens bakre ögonmusslor.
    OBS: Den bakre ögonmusslan skiljer sig från det bakre segmentet eftersom den inte innehåller den neurala näthinnan.
    1. Överför ögat till en petriskål som innehåller 1x PBS under ett dissekeringsmikroskop (kompletterande figur 9A).
    2. Ta bort fett och muskler från ögongloben enligt beskrivningen i steg 1.8.2 (kompletterande figur 9B).
    3. Nick ögonglobens hornhinna med ett skalpellblad nummer 11. Ta bort hornhinnan och iris, enligt beskrivningen i steg 1.8.3 (kompletterande figur 9C).
    4. Dra ut linsen med pincett. Ta två finspetsade pincett och separera försiktigt neurala näthinnan från det bakre segmentet.
    5. Skär försiktigt av näthinnan vid synnervshuvudet för borttagning från den bakre ögonmusslan (kompletterande figur 9D).
    6. Placera den bakre ögonmusslan i ett nytt 2 ml mikrorör innehållande 500 μL 1x PBS med musidentifiering.
  3. Fixera de bakre ögonmusslorna med metanol (MeOH) (kompletterande figur 10).
    OBS: Steg 3.3 tar cirka 2 timmar och 40 minuter att slutföra.
    1. Tillsätt 500 μL MeOH till vävnader. Inkubera på en shaker vid 75 rpm i 5 min vid RT.
    2. Ta bort 500 μL lösning från vävnaderna och tillsätt 500 μL MeOH. Inkubera i 5 minuter på en shaker vid 75 rpm i 5 min vid rumstemperatur. Upprepa detta steg en gång till.
    3. Ta bort hela lösningen från vävnaderna och tillsätt 500 μL MeOH. Inkubera på en shaker vid 75 rpm i minst 2 timmar vid rumstemperatur.
      OBS: Som ett alternativ till steg 3.3.3 kan den bakre ögonmusslan inkuberas över natten i MeOH på en shaker vid 75 rpm i ett rum på 4 °C.
    4. Tillsätt 500 μL 1x PBS till vävnaderna. Inkubera på en shaker vid 75 rpm i 5 min vid RT.
    5. Ta bort 500 μL lösning från vävnaderna och tillsätt 500 μL 1x PBS. Inkubera på en shaker vid 75 rpm i 5 min vid rumstemperatur. Upprepa detta steg en gång till.
    6. Ta bort hela lösningen från vävnaderna och ersätt den med 500 μL 1x PBS.
      OBS: Vävnaderna fixeras helt av MeOH och kan förvaras i ett kylskåp på 4 °C i minst 1 månad.
  4. Utför immunofluorescensfärgning av de bakre ögonmusslorna för att visualisera snäva korsningar och kärnor i RPE (kompletterande figur 11).
    1. Ta bort 500 μL 1x PBS från proverna och tillsätt 100 μL utspätt 10% normalt åsneserum i 1x PBS-lösning. Inkubera på en shaker vid 75 rpm i 30 min vid rumstemperatur.
    2. Ta bort den utspädda 10 % normala åsneserumlösningen från proverna och tillsätt 100 μl av en 1:50 spädning av en polyklonal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1)-antikropp på kanin i 1x PBS. Överför proverna till ett rum på 4 °C och inkubera över natten i en skakapparat vid 75 varv/min.
    3. Ta bort antikroppsspädningen från proverna och tillsätt 2 ml 1x PBS. Inkubera på en shaker vid 75 rpm i 10 min vid RT. Upprepa detta steg ytterligare två gånger.
    4. Ta bort 1x PBS från prover. Tillsätt 100 μL av en 1:250 spädning av en åsna anti-kanin IgG-antikropp med en 488 fluoroforkonjugerad tagg och en 1:250 utspädning av 4',6-diamidin-2'-fenylindoldihydroklorid (DAPI) i 1x PBS till proverna. Täck proverna med aluminiumfolie och inkubera på en shaker vid 75 rpm i 2 timmar vid RT.
      OBS: Proverna måste vara helt täckta med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning.
    5. Ta bort antikropps- och DAPI-spädningarna från proverna. Tillsätt 2 ml 1x PBS till proverna, täck igen med aluminiumfolie och inkubera på en shaker vid 75 rpm i 10 min vid RT. Upprepa detta steg tre gånger till.
      OBS: De snäva korsningarna och kärnorna i RPE är nu helt märkta respektive färgade.
  5. Montera de bakre ögonmusslorna på mikroskopglas.
    1. Märk ett mikroskopglas med musidentifiering. Överför den bakre ögonmusslan på ett mikroskopglas under ett dissekerande mikroskop med den koroidala sidan nedåt. Tillsätt en droppe 1x PBS till den bakre ögonmusslan för att förhindra att den torkar ut (kompletterande figur 12).
    2. Skär den bakre ögonmusslan med ett skalpellblad nummer 11 på fyra ställen som ger fyra kvadranter som motsvarar kardinalriktningarna (dvs. norr, öst, syd och väst). Badda överskott 1x PBS med vävnad från omkretsen av den bakre ögonmusslan. Platta försiktigt till den bakre ögonmusslan med en kamelhårborste och finspetsad pincett (kompletterande figur 12).
      OBS: Den resulterande produkten är nu känd som en RPE platt montering.
    3. Lägg till en droppe monteringsmedium till det platta RPE-fästet och placera ett täckglas ovanpå det. Applicera genomskinligt nagellack för att försegla täckglaset och låt det torka i minst 30 minuter vid RT i en stängd låda. Placera rutschkanorna i en glidhållarlåda och förvara lådan i ett kylskåp på 4 °C.
      Var försiktig så att du inte introducerar bubblor på RPE-plattfästet. Platta RPE-monteringar kan avbildas inom en tidsram på 2 veckor.
  6. Hämta en bild av var och en av de fyra kvadranterna som omger synnerven i RPE-plattfästet på ett konfokalmikroskop vid 20x förstoring för varje prov. Ett exempel på en plattmonterad RPE-bild finns i kompletterande figur 13A.
    OBS: Det kan vara nödvändigt att utföra z-stack-avbildning av RPE-platta fästen där flera bilder tas och staplas för att kompensera för dimensionella skillnader i RPE-plattfästet.
  7. Spåra de snäva korsningarna mellan RPE-cellerna i varje platt RPE-avbild. Ett exempel på en spårad plattmonterad RPE-bild finns i kompletterande figur 13B.
    1. Öppna Fiji ImageJ-programmet. Dra en platt RPE-bild till Fiji ImageJ-aktivitetsfältet. Kontrollera att bilden är kalibrerad i mikrometer och inte pixlar.
    2. Dubbelklicka på ikonen Overlay Brush Tool i Fiji ImageJ-aktivitetsfältet för att ställa in penselbredden till 3, transparens till 0 och färg till röd. Klicka på knappen Stäng i fönstret Överläggspensel.
    3. Klicka på ikonen Overlay Brush Tool . Klicka och dra på de snäva korsningarna för alla RPE-celler som är helt i bilden.
      Om ett spårningsfel görs dubbelklickar du på ikonen Overlay Brush Tool och klickar på rutan Ångra i fönstret Overlay Brush Tool för att ta bort spårningsfelet från bilden.
    4. Klicka på rektangelikonen i Fiji ImageJ-aktivitetsfältet. Klicka på bilden och dra runt bildens omkrets. Klicka på Redigera > Rensa på Fiji ImageJ-menyraden om du vill behålla de kalkade linjerna och ta bort eventuella blå och gröna färger från bilden.
    5. Spara spårningsbilden på en lämplig plats med musidentifiering, kvadrantplats (dvs. norr, söder, öst eller väst) och en CP-suffixetikett.
      Spara inte RPE-spårningsbilden innan du har slutfört steg 3.7.4.
  8. Beräkna RPE-cellområdena för varje prov.
    1. Ange en plats där filerna ska sparas från RPE-områdesanalys genom att skapa en mapp på datorns skrivbordsskärm. Generera undermappar för varje RPE-spårningsbild och märk undermapparna med musidentifiering samt kvadrantplats (dvs. norr, söder, öst eller väst).
    2. Installera och öppna Cell Profiler-programmet29. Ladda ner projektfilen Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (kompletterande kodningsfil 1). Öppna filen Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj genom att klicka på Arkiv > Öppna projekt i programraden för Cellprofiler.
    3. Dra en RPE-spårningsbild till rutan Bild > Släpp filer och mappar här i programfönstret Cellprofiler.
    4. Ange mappens plats i programmet Cellprofiler som motsvarar RPE-spårningsbilden. Klicka på knappen Utmatningsinställningar längst ned till vänster i programfönstret Cellprofiler och ange platsen för mappen i textrutorna Standardinmatningsmapp och Standardutmatningsmapp .
    5. Klicka på knappen Analysera bilder längst ned till vänster i programfönstret Cellprofiler. När analysen är klar visas fönstret Analys slutförd på skärmen. Klicka på OK i fönstret Analys slutförd .
      Den här åtgärden genererar en csv-fil och jpeg-bild. CSV-filen innehåller områdena för RPE-cellerna i spårningsbilden. JPEG-bilden motsvarar RPE-spårningsbilden, där varje RPE-cell kommer att märkas med ett nummer (kompletterande figur 13C).
    6. Överför RPE-områdena från csv-filen till ett kalkylblad. Märk kalkylbladet med musidentifiering.
    7. Utför en kvalitetskontrollundersökning av data genom att bekräfta att varje RPE-område i csv-filen länkar till en fullständigt spårad RPE-cell i en jpeg-bild. Ta bort alla värden från kalkylbladet som inte motsvarar fullständigt spårade RPE-celler.
    8. Gå tillbaka till programmet Cellprofiler. Högerklicka på namnet på RPE-spårningsbilden i rutan Släpp filer och mappar här och välj Rensa listan för att ta bort bilden från programmet Cellprofiler.
    9. Upprepa steg 3.8.3-3.8.8 för att beräkna RPE-storlekarna för de återstående tre RPE-spårbilderna i provet.
  9. Kvantifiera medelvärdena för RPE-cellstorleken för varje prov i kalkylbladet.
  10. Kvantifiera RPE-celldensiteterna för varje prov i kalkylbladet. För att beräkna RPE-celldensiteten, dividera det totala antalet RPE-celler per kvadrant med den totala ytan av RPE-celler per kvadrant som detekterades av Cell Profiler-programmet. Bestäm medelvärdet av RPE-celldensiteterna från de fyra kvadranterna per prov.
  11. Kvantifiera antalet flerkärniga RPE-celler per platt RPE-montering för varje prov. Använd programmet Cell Counter i Fiji ImageJ-programmet, enligt beskrivningen i steg 1.15.1-1.15.3, för att räkna antalet RPE-celler med fler än tre kärnor i fyra kvadranter i provet.
  12. Utföra statistisk analys av RPE-cellens storlek och densitetsmedelvärden, samt antalet flerkärniga RPE-celler för att avgöra om det finns signifikanta skillnader mellan grupper i studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Slutförandet av RPE-fenotypningsprotokollet som beskrivs i denna artikel ger en kvantitativ analys av de strukturella RPE-avvikelser som vanligtvis observeras i musmodeller av AMD. För att bekräfta effektiviteten av detta protokoll använde vi det på möss som är kända för att visa RPE-patologier, inklusive transgena möss som överuttrycker WT Tmem135 som drivs av kycklingbeta-aktinpromotorn (Tmem135 TG)30 och åldrade C57BL / 6J-möss31,32. Syftet med dessa experiment är att visa representativa resultat som kan erhållas med de metoder som beskrivs i detta protokoll för forskare som är nya för musmodeller.

Vi följde metoderna i steg 1 i protokollet för att bearbeta och utvärdera ögon från WT- och Tmem135 TG-möss för att utvärdera RPE-patologier med hjälp av ljusmikroskopi. Vi fann att 4 månader gamla Tmem135 TG-möss har en signifikant minskning av RPE-tjockleken vid två uppmätta intervall i förhållande till åldersmatchad WT genom en ANOVA med post-hoc Tukey-test (figur 4). Dessa resultat indikerar att RPE är tunnare hos de 4 månader gamla Tmem135 TG-mössen än hos åldersmatchade WT-möss på 600 och 900 μm avstånd från synnerven.

Med hjälp av metoderna i steg 1 i protokollet beräknade vi dessutom förekomsten av RPE-patologier, inklusive mikrovakuolisering, makrovakuolisering och migration av tre 25 dagar gamla WT- och Tmem135 TG-möss (figur 5A). Den genomsnittliga frekvensen av RPE-mikrovakuoliseringspatologier per bild hos WT-möss var 0,67 ± 0,31 och hos Tmem135 TG-möss var 7,07 ± 0,61 (figur 5B). Det fanns ingen RPE-makrovakuolisering hos WT-möss, men det fanns i genomsnitt 5,33 ± 2,02 makrovakuoliseringshändelser i Tmem135 TG-möss (figur 5C). Slutligen var frekvensen av migrerande RPE-celler per bild noll hos WT-möss och 0,4 ± 0,35 hos Tmem135 TG-möss (figur 5D). Efter att ha utfört en elevs t-test var förekomsten av RPE-mikrovakuolisering och mikrovakuolisering signifikant annorlunda mellan WT- och Tmem135 TG-möss. Den högre incidensen av RPE-migrerande celler hos Tmem135 TG-möss var dock inte signifikant annorlunda jämfört med WT (p = 0,1161). Dessa data visar att RPE-mikrovakuolisering och makrovakuolisering, men inte migration, är signifikant högre hos 25 dagar gamla Tmem135 TG än WT-möss.

Efter metoderna i protokollet som ingår i steg 2 förberedde vi retinala sektioner från 2 månader gamla och 24 månader gamla WT C57BL / 6J-möss för transmissionselektronmikroskopi för att analysera närvaron och höjderna av BLamDs. Vi hittade BLamDs närvarande i 24 månader gamla WT-näthinnor som var särskilt frånvarande i 2 månader gamla WT-näthinnor (figur 6A). Vi presenterade höjderna av BLamDs i de 24 månader gamla WT-näthinnorna genom att beräkna och plotta de kumulativa frekvenserna av deras förekomst. Kumulativa frekvenser för BLamD-höjderna graferades mot avlagringningshöjd för att illustrera fördelningen av avlagringarnas höjder. Det finns en förskjutning till höger om linjen för de 24 månader gamla WT BLamD-höjderna jämfört med de 2 månader gamla WT BLamD-höjderna, vilket visar en ökning av insättningar hos 24 månader gamla WT-möss (figur 6B). Denna graf stöds av ett större genomsnitt av BLamD-höjder i 24 månader gamla WT-näthinnor (1,01 μm ± 0,43 μm) än 2 månader gamla WT-näthinnor (0,23 μm ± 0,017 μm), som var signifikant annorlunda av en elevs t-test (figur 6C). Sammanfattningsvis drar vi slutsatsen att 24 månader gamla WT-möss har stora BLamDs i näthinnans sub-RPE-utrymme jämfört med 2 månader gamla WT-möss.

Vi tillämpade metoderna för att förbereda ögon från 4 månader gamla WT- och Tmem135 TG-möss i steg 3 för att generera RPE-plana fästen för detektion och analys av RPE-dysmorfi och multinukleation. I detta protokoll definierade vi RPE-dysmorfi genom förändringar i RPE-cellstorlek och densitet i en AMD-musmodell i förhållande till deras kontroller. Vi fann att RPE i 4 månader gamla Tmem135 TG-möss är dysmorfa (figur 7A). RPE i Tmem135 TG-näthinnor är större (806,89 μm 2 ± 252,67 vs. 291,69 μm 2 ± 26,31) och mindre tät (0,0014 celler/μm 2 ± 0,00039 vs. 0,0033 celler/μm 2 ± 0,00024) än åldersmatchade WT-näthinnor (figur 7B,C). Dessutom fanns det fler flerkärniga RPE-celler i Tmem135 TG-näthinnorna jämfört med WT-kontroller (8,04 celler ± 5,54 vs. 0,33 celler ± 0,29) (figur 7D). Alla dessa parametrar nådde statistisk signifikans med en elevs t-test. Tillsammans har 4 månader gamla Tmem135 TG-möss fler dysmorfa och flerkärniga RPE-celler än 4 månader gamla WT-möss.

Figure 1
Figur 1: RPE-patologier detekterade med ljusmikroskopi. Representativa bilder av normal RPE i WT (A) och onormal RPE i Tmem135 TG-möss (B-E). RPE-patologierna som observerats hos Tmem135 TG-möss inkluderar RPE-gallring (B), makrovakuolisering (C), mikrovakuolisering (D) och migration (E). Varje patologi illustreras med en svart pil. Skalstapel = 100 μm. Förstoring = 20x. Förkortningar: RGC = retinalt gangliecellskikt, IPL = inre plexiformskikt, INL = inre kärnskikt, OPL = yttre plexiformskikt, ONL = yttre kärnskikt, IS = fotoreceptor inre segment, OS = fotoreceptor yttre segment, RPE = retinalt pigmenterat epitel, Cho = koroid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: RPE-patologier detekterade genom transmissionselektronmikroskopi. Representativa bilder av (A) RPE hos unga CFH-H/H och (B) 2-åriga CFH-H/H-möss som har rikliga basala laminära avlagringar (BLamDs). BLamDs spåras med gula prickar i bilden. Skalstång = 800 nm. Förstoring = 15 000x. Förkortningar: N = kärna, M = mitokondrion, P = pigmentgranulat, BI = basala inveckningar, EL = elastisk lamina, RPE = retinalt pigmenterat epitel, BrM = Bruchs membran, Cho = koroid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: RPE-patologier detekterade med konfokalmikroskopi. Representativa bilder av (A) normal RPE för 8 månader gammal WT och (B) onormal RPE för 8 månader gamla Tmem135 TG-möss som uppvisar RPE-dysmorfi. Den vita fyrkanten zoomas in (C) för att avbilda en flerkärnig RPE-cell med tre kärnor. Den gröna färgen är anti-ZO1-associerade RPE-snäva korsningar, och den blå färgen är DAPI-färgning av RPE-kärnor. Skalstapel = 50 μm. Förstoring = 20x. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: RPE-tjocklek hos 4 månader gamla vildtypsmöss (WT) och Tmem135 TG. (A) Representativa bilder av näthinnan från 4 månader gamla WT- och Tmem135 TG (TG)-möss. Förstoring = 20x. Skalstapel = 100 μm. (B) Linjediagram över RPE-tjockleksmätningar i 4 månader gamla WT (svart) och Tmem135 TG-möss (gröna) upp till 3 000 μm från synnerven. Siffror efter genotypen anger antalet möss som användes i denna studie. *p < 0,05, ANOVA med post-hoc Tukey-test. Alla data är medelvärde ± sd. Se figur 1-förklaringen för förkortningar av retinala lager. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: RPE-patologier hos 25 dagar gamla Tmem135 TG-möss. (A) Representativa bilder av RPE-mikrovakuolisering, makrovakuolisering och migration hos tre 25 dagar gamla Tmem135 TG (TG) möss. RPE-patologier markeras med svarta pilar i varje bild. Förstoring = 40x. Skalstapel = 20 μm. (B-D) Kvantifiering av RPE-mikro- och makrovakuolisering samt migrerande RPE-celler i 25 dagar gamla WT- och Tmem135 TG-möss. Siffror inom parentes anger antalet möss som användes i denna studie. *p < 0,05 och ****p < 0,0001, elevens t-prov. Alla data är medelvärde ± sd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Ultrastrukturell analys av BLamDs hos unga och åldrade WT-näthinnor . (A) Representativa elektronmikrografer av 2 månader gamla och 24 månader gamla WT RPE. Förstoring = 15 000x. Skalstång = 800 nm. Ett exempel på en basal laminär avsättning (BLamD) är diagrammad med en konsol. (B) Kumulativa frekvenser för BLamD-höjderna. (C) BLamD-höjdmedel. Siffror inom parentes anger det totala antalet möss per genotyp som användes i denna studie. **p < 0,01, elevens t-prov. Alla data är medelvärde ± sd. Se figur 2-förklaringen för förkortningar av näthinnelager. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Platta RPE-fästen avslöjar RPE-patologier hos Tmem135 TG-möss. (A) Representativa bilder av 4 månader gamla WT och Tmem135 TG (TG) RPE platta fästen med anti-ZO-1 i grönt och DAPI i blått. Förstoring = 20x. Skalstapel = 100 μm. (B) RPE-cellstorlek, (C) RPE-celldensitet och (D) RPE-multinukleation i 4 månader gamla WT- och Tmem135 TG-möss. Siffran inom parentes anger antalet möss som användes i studien. *p < 0,05, **p < 0,01 och ****p < 0,0001, elevens t-prov. Alla data är medelvärde ± sd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Schematisk bild av inställning och användning av hjärtperfusion. a) Perfusionssystem för gravitationsmatning. b) Sprutcylinder i perfusionssystemet för fixeringsbuffert. (C) Ventilen ska vridas tills den är parallell med slangledningen så att bufferten kan strömma genom slangledningen. (D) Ventilen ska vridas tills den är vinkelrät mot slangledningen för att hindra bufferten från att strömma in i slangledningen. Bild skapad i Biorender. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Schematisk bild av proceduren för hjärtperfusion av en mus. (A) Fyra snitt gjorda för att exponera bukhålan. (B) Skär genom membranet och bröstbenet för att exponera hjärtat. (C) Mätnål insatt i hjärtats vänstra kammare. Ventilen vrids tills den är parallell med slangledningen. Det högra atriumet skärs med böjd sax för att tillåta blod och fixativ att gå ut. Bild skapad i Biorender. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Schematisk bild av proceduren för att enukleera ögon från en mus. (A) Tryck försiktigt ner med tummen och pekfingret runt ögonhålan för att orsaka utskjutning av ögat från ögonhålan. (B) Ta böjda saxar och håll dem med bladet i 30° vinkel från ögonhålan. Fortsätt att klippa runt ögat med den böjda saxen i 30 ° vinkel. Färgade prickar representerar fingerplacering på musen eller böjd sax. Bild skapad i Biorender. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Bilder av musögondissektion för att ge musens bakre segment. (A) Ögat överfört till ett dissekerande mikroskop. (B) Fett och muskler avlägsnas från ögongloben. (C) Hornhinna och iris avlägsnas från ögongloben. (D) Lins avlägsnad från ögongloben. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Färgningsförfarande för hematoxylineosin (H&E). Schematisk bild av H&E-proceduren för att färga paraffininbäddade näthinnesektioner. Pilar indikerar överföring mellan steg. Tiden för varje steg anges i rött teckensnitt. Reagenser för färgning tillhandahålls i svart teckensnitt i glasfärgningsbehållare. Det bör finnas en glasfärgningsbehållare förberedd för varje reagens som ingår i ovanstående diagram. Alla steg måste slutföras i en dragskåp. När du lägger till ett täckglas på en bild, var försiktig så att du inte introducerar bubblor i bilden. Efter avslutad procedur kan bilder lagras i en bildruta. Bild skapad i Biorender. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6: Exempel på mätning av RPE-tjocklek. Den svarta pilen visar en röd linje från toppen till botten av RPE. Denna linje kan mätas för att bestämma tjockleken på RPE. Skalstapel = 100 μm. Förstoring = 20x. Det inramade området är utzoomat för enklare visning av RPE. Se figur 1-förklaringen för förkortningar av retinala lager. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 7: EtOH-uttorkningsprocedur för musens bakre segment för TEM-bearbetning. Bild skapad i Biorender. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 8: Exempel på BLamD-höjdmätning. Den röda linjen visar den största BLamD i den här bilden. Gula prickar avgränsar BLamDs i bilden. Denna röda linje kan mätas för att bestämma höjden på denna BLamD i den här bilden. Skalstång = 800 nm. Förstoring = 15 000x. Se figur 2-förklaringen för förkortningar av näthinnelager. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 9: Musögondissektion för platt RPE-montering. (A) Ögat överfört till en petriskål innehållande 1x PBS under ett dissekerande mikroskop. (B) Fett och muskler avlägsnas från ögongloben. (C) Hornhinna och iris avlägsnas från ögongloben. (D) Lins och näthinna avlägsnas från ögongloben. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 10: Metanol (MeOH) fixeringsprocedur för musens bakre ögonmusslor. Bild skapad i Biorender. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 11: Immunofluorescensprocedur för att märka täta korsningar och kärnor i RPE-celler. Diagram som visar steg i immunofluorescensteknik från detta protokoll. Observera att den här tekniken tar 2 dagar att slutföra. Alla steg inträffar vid RT och på en shaker med en hastighet av 75 rpm, om inte annat anges i diagrammet. Den primära (1°) antikroppen som användes i denna studie var kaninpolyklonalt anti-ZO1, och den sekundära (2º) antikroppen som användes i denna studie var 488 fluoroforkonjugerade åsne-antikanin IgG. När den sekundära antikroppen och DAPI har tillsatts proverna måste proverna förpackas i aluminiumfolie för att skydda mot fotoblekning av provet. Bild skapad i Biorender. Förkortningar: NDS = normalt åsneserum, Ab = antikropp. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 12: Bild av snitt för att ge fyra kvadranter av mus RPE platt montering. N = norr, E = öst, S = söder, W = väst. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 13: Exempel på slutpunkter för platt monteringsanalys av RPE. (A) RPE platt monteringsbild. (B) Bild av RPE-gränsspårning. (C) RPE Cell Profiler analyserad bild. Förstoring = 20x. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den här artikeln introducerade vi ett fenotypprotokoll för att bedöma de strukturella RPE-patologierna hos musmodeller. Vi beskrev de steg som krävs för att bearbeta ögonen för olika avbildningstekniker inklusive ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi, samt kvantifiering av typiska patologier observerade via dessa avbildningsmetoder. Vi bevisade effektiviteten av vårt RPE-fenotypningsprotokoll genom att undersöka Tmem135 TG och 24 månader gamla WT-möss, eftersom dessa möss visar RPE-patologier30,31,32. Detta protokoll kan tillämpas på alla genetiskt modifierade eller farmakologiskt behandlade möss som kan innehålla RPE-patologier såsom RPE-gallring, vakuolisering, migration och dysmorfi, liksom BLamDs 6,7. Även om RPE-patologierna som observerats i Tmem135 TG och 24 månader gamla WT-möss finns i andra AMD-musmodeller 7,30, är det viktigt för forskaren att bli bekant med AMD-musmodellen som valts för sina studier, eftersom åldern för debut och svårighetsgrad av RPE-patologierna i deras AMD-musmodell kan skilja sig från Tmem135 TG och 24 månader gamla WT-möss. Forskare kan behöva använda fler möss för sina studier än antalet möss som används för att producera de representativa resultaten som visas i denna artikel, om presentationen av RPE-patologier är variabel i deras respektive AMD-musmodell. Dessutom är många AMD-musmodeller för närvarande tillgängliga för AMD-forskare, men har inte fullständiga beskrivningar av deras RPE-patologier, vilket kan kräva att forskare utför preliminära studier för att få denna information.

Även om ändringar kan göras i hur musögon bearbetas för de olika avbildningsmetoderna, är det viktigt att upprätthålla den kvantitativa utvärderingen av strukturella RPE-avvikelser som beskrivs i protokollet. Till exempel förbereddes fem H &E-färgade näthinnesektioner för att räkna antalet RPE-mikrovakuoliseringar, makrovakuolisering och migrationshändelser, vilket gjorde det möjligt för forskare att utvärdera RPE-patologier på flera platser i musnäthinnan. Ett annat exempel är att använda ett 400-mesh tunnstångskopparelektronmikroskopinät för att bedöma de ultrastrukturella avvikelserna hos RPE. Elektronmikroskopinätet ger ett ramverk för att utvärdera ett näthinneprov systematiskt och opartiskt genom transmissionselektronmikrografi, samt erhålla 40 till 70 bilder per näthinnesektion för att undersöka närvaron av BLamDs. Detta kan inte uppnås med ett elektronmikroskopi-slitsnät, och vi föreslår att du inte använder dem med detta protokoll. Slutligen, att fånga 20x förstoringsbilder från de fyra kvadranterna i ett RPE-plattfäste gör det möjligt för forskare att undersöka stora områden av murin RPE för dysmorfi och multinukleation. Forskare är fria att utöka detta protokoll och undersöka ytterligare retinala sektioner för RPE-patologier i sina studier. Tillsammans tillåter dessa metoder forskare att samla in gott om data för att dra slutsatser om de strukturella RPE-patologierna som kan finnas i deras AMD-musmodeller.

Ett annat viktigt inslag i detta protokoll är konsistensen av RPE-fenotypningsmetoderna. Till exempel orienterades alla ögon som användes för ljus- och transmissionselektronmikroskopi av den överlägsna sidan av musens näthinna för sektionering. Det är viktigt att bibehålla musögats orientering under hela dess bearbetning för ljus- och transmissionselektronmikroskopi eftersom musögat har en topografisk fördelning av näthinneceller33,34. Musögats anatomiska orientering bibehölls inte för RPE-plattmonteringsberedning, eftersom överlägsen sämre topografiska förändringar av musens RPE-cell inte har observerats. Faktum är att RPE i den mänskliga näthinnan visar topografiska förändringar som strålar bort från det optiska nervhuvudet35, vilket tyder på att detta kan vara fallet för mus RPE. Slutligen bygger bildförvärvet som beskrivs i detta protokoll på den anatomiska positioneringen av synnerven. Inkludering av dessa metodologiska aspekter kommer att bidra till att reproducera resultat av RPE-patologier för forskare när de arbetar med sina AMD-musmodeller.

Forskare kan vilja lägga till fler analytiska funktioner till RPE-fenotypningsprotokollet. Några fenotypiska resultat som inte ingår i detta protokoll är undersökningen av BrM-tjocklek, RPE apikala mikrovilli och andra RPE ultrastrukturella komponenter. Dessa komponenter inkluderar mitokondrier, pigmentgranuler och andra organeller som fagosomer. Forskare kan bestämma storleken och antalet av dessa komponenter i elektronmikrograferna erhållna med detta protokoll med hjälp av Fiji ImageJ-programmet. I synnerhet kan mitokondriernas status vara ett viktigt fenotypiskt resultat att överväga, eftersom inriktning på mitokondrier i RPE är en viktig terapeutisk strategi för AMD36. Ett annat fenotypiskt resultat är ytterligare mätningar av RPE-dysmorfi på RPE-plana fästen. RPE-platta monteringsbilder som erhållits med protokollet kan undersökas för RPE-hexagonal form, antal närliggande RPE-celler och andra egenskaper med REShAPE-programmet (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Ett annat möjligt fenotypiskt resultat är om RPE-patologier uppträder i de centrala eller perifera områdena i musnäthinnan. Dessa ytterligare fenotypiska överväganden kommer att ytterligare stärka RPE-fenotypningsprotokollet som beskrivs i den här artikeln.

Det finns några begränsningar med detta RPE-fenotypprotokoll. En begränsning med denna metod är behovet av att offra möss för att skörda sina ögon för RPE-fenotypning. Som ett alternativ möjliggör nya framsteg inom spektral domänoptisk koherenstomografi (SD-OCT) avbildning kvantifiering av RPE-tjocklek och patologier hos levande möss37-39. Detta kan vara fördelaktigt för forskare som vill utföra longitudinella studier på sina AMD-musmodellkohorter. En annan begränsning med denna metod är bristen på funktionella RPE-bedömningar hos möss. Om forskare är intresserade av en funktionell bedömning av RPE hos möss rekommenderar vi att du utför elektroretinografi och mäter c-vågkomponenten, eftersom c-vågen indikerar RPE: s funktionella roll i fototransduktion40. En annan begränsning med denna metod är bristen på biokemiska mätningar av RPE-markörer hos möss. Om forskare vill undersöka nivåerna av RPE-markörer, såsom cellulärt retinaldehydbindande protein (CRABLP), retinalt pigmentepitelspecifikt 65 kDa-protein (RPE65), kalium inåt rektifierande kanalunderfamilj J-medlem 13 (KCNJ13) eller bestrofin 1 (BEST1), rekommenderar vi att skörda ögon för immunhistokemi, kvantitativ realtids-PCR eller western blot-analys.

Sammanfattningsvis kan detta RPE-fenotypningsprotokoll vara en viktig resurs för forskare som använder musmodeller som rekapitulerar patologiska aspekter av AMD. Detta protokoll tjänar också till att standardisera hur RPE utvärderas i AMD-musmodeller, vilket inte tidigare har beskrivits i litteraturen. Standardisering av RPE-fenotypning skulle vara avgörande för att översätta resultaten från möss till andra modeller av AMD, inklusive RPE-cellodlingsmodeller4 och högre organismmodeller inklusive icke-mänskliga primater. Det skulle också hjälpa till med vår förståelse av de patobiologiska mekanismerna bakom AMD-utveckling och potentiellt utveckla nya terapier för denna bländande sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna till detta protokoll har inga avslöjanden och intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna Satoshi Kinoshita och University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) för att förbereda våra vävnader för ljusmikroskopi. Denna kärna stöds av UW Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520) och Office of The Director-NIH (S10OD023526). Konfokalmikroskopi utfördes vid UW Biochemistry Optical Core, som etablerades med stöd från UW Department of Biochemistry Endowment. Detta arbete stöddes också av bidrag från National Eye Institute (R01EY022086 till A. Ikeda; R01EY031748 till C. Bowes Rickman; P30EY016665 till Institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper vid UW; P30EY005722 till Duke Eye Center; NIH T32EY027721 till M. Landowski; F32EY032766 till M. Landowski), Timothy William Trout ordförandeskap (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 193
Ett protokoll för att utvärdera och kvantifiera retinala pigmenterade epitelpatologier i musmodeller av åldersrelaterad makuladegeneration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter