Summary
マウスモデルは、網膜色素上皮(RPE)の生物学を調べるための有用なツールとなり得る。マウスは一連のRPE病理を発症する可能性があることが確立されています。ここでは、光、透過電子、および共焦点顕微鏡を使用してマウスのRPE病理を解明および定量化するための表現型プロトコルについて説明します。
Abstract
加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者における衰弱性網膜障害です。網膜色素上皮(RPE)の機能不全は、AMDの重要な病態学的事象であると広く信じられています。RPE機能障害につながるメカニズムを理解するために、研究者はマウスモデルを利用することができます。以前の研究により、マウスはRPEの病状を発症する可能性があり、その一部はAMDと診断された個人の目に観察されることが確立されています。ここでは、マウスのRPE病態を評価するための表現型プロトコールについて説明します。このプロトコルには、光学顕微鏡と透過型電子顕微鏡を使用した網膜断面の準備と評価、および共焦点顕微鏡によるRPEフラットマウントの標本の作成と評価が含まれます。これらの手法によって観察されるマウスRPEの病状の一般的なタイプと、統計的検定のための偏りのない方法を通じてそれらを定量化する方法について詳しく説明します。概念実証として、このRPE表現型プロトコルを使用して、膜貫通タンパク質135(Tmem135)を過剰発現するマウスおよび野生型C57BL/6Jの老化マウスで観察されたRPEの病状を定量化しました。このプロトコルの主な目的は、AMDのマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を伴う標準的なRPE表現型分析法を提示することです。
Introduction
加齢黄斑変性症(AMD)は、55歳以上の人々に影響を与える一般的な失明性疾患です1。多くの研究者は、網膜色素上皮(RPE)内の機能不全は、AMD2の早期かつ重要な病態学的事象であると考えています。RPEは、隣接する視受容体と脈絡膜血管の恒常性を維持する役割を負った偏光細胞の単層です3。RPE内の疾患関連メカニズムを調べるために、細胞培養モデル4、5、マウス6、7、8など、さまざまなモデルが存在します。最近の報告では、RPE細胞培養モデル4の標準化されたプロトコルと品質管理基準が記載されているが、マウスモデルにおけるRPEの表現型を標準化しようとした報告はない。実際、AMDのマウスモデルに関する多くの出版物には、RPEの完全な説明やRPEの病状の定量化が欠けています。このプロトコルの全体的な目標は、AMDマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を備えた標準的なRPE表現型分析法を提示することです。
以前の出版物は、3つの画像技術を通じてマウスにおけるいくつかのRPE病理の存在を指摘している。たとえば、光学顕微鏡法により、研究者はマウス網膜の肉眼的形態を観察し(図1A)、RPEの菲薄化、空胞化、移動などのRPEの病状を検出できます。AMDマウスモデルにおけるRPEの薄化は、それぞれのコントロールからのRPEの高さの偏差によって例示されます(図1B)。RPE空胞化は、微小液胞化(図1C)とマクロ液胞化(図1D)の2つのカテゴリーに分けることができます。RPE微小液胞化は、その全体の高さに影響を及ぼさないRPE内の液胞の存在によって要約されるが、マクロ液胞化は、光受容体の外側セグメントに突出する液胞の存在によって示される。RPEの移動は、網膜断面におけるRPE単層上の色素の焦点集合体によって区別されます(図1E)。AMDドナーの眼における遊走性RPE細胞は、分化クラスター68(CD68)9などの免疫細胞マーカーに対して免疫反応性を示し、RPE破片または分化形質転換を受けているRPEを巻き込む免疫細胞を表す可能性があることに注意する必要があります9。透過型電子顕微鏡と呼ばれる別のイメージング技術により、研究者はRPEとその基底膜の微細構造を視覚化することができます(図2A)。この手法により、基底層流沈着(BLamD)として知られるマウスの優勢なサブRPE沈着物を特定することができます(図2B)10。最後に、共焦点顕微鏡は、RPEフラットマウントのイメージングを通じてRPE細胞の構造を明らかにすることができます(図3A)。この方法により、RPE異形症、つまりRPEの古典的なハニカム形状からの偏差を明らかにすることができます(図3B)。また、RPE細胞内に3つ以上の核が存在するRPE多核化を検出することもできます(図3C)。現在のAMDマウスモデルに存在するRPE病理の種類の要約については、文献6,7からこれらのレビューを参照します。
AMDを研究している研究者は、表現型プロトコルの前にマウスを使用してRPEの病状を調査することの長所と短所を知っておく必要があります。マウスは、それらの比較的短い寿命および費用対効果、ならびにそれらの遺伝的および薬理学的操作性のために有利である。マウスはまた、RPE遊走、異形症、および多核形成を含むRPE変性変化を示し、AMDドナー眼で観察される11、12、13、14、15、16、17;これは、同様のメカニズムがマウスとヒトにおけるこれらのRPE病状の発症の根底にある可能性があることを示唆しています。ただし、マウス研究のヒトAMDへの翻訳可能性を制限する重要な違いがあります。第一に、マウスには、AMDで優先的に影響を受ける視力に必要な人間の網膜の解剖学的に異なる領域である黄斑がありません。第二に、RPEの菲薄化や空胞化など、マウスの一部のRPE病理は、通常、AMDドナーの目には見られません18。第三に、マウスはAMD病理の特徴であるドルーゼンを発症しません19。ドルーゼンは脂質およびタンパク質を含む沈着物であり、RPE基底膜とブルッフ膜(BrM)の内側コラーゲン層との間に形成される基底膜タンパク質はほとんどありません19。ドルーゼンは、マウスの一般的なサブRPE沈着物であるBLamDとは、その組成と解剖学的位置の両方が異なります。BLamDは、BrMのRPE基底膜とRPE20の基底折り畳みとの間に形成される、年齢およびストレス依存性の細胞外マトリックスに富む異常です。興味深いことに、BLamDはマウスとヒトの両方で同様のタンパク質組成と外観を持っています6、10、21。最近の研究は、BLamDがAMDの後期段階への進行に影響を与えることによってAMDの病態生物学において作用する可能性があることを示唆しています18,22;したがって、これらの沈着物は、マウス網膜における罹患RPEを表し得る。これらの利点と限界に関する知識は、マウス研究の結果をAMDに変換することに関心のある研究者にとって重要です。
このプロトコルでは、RPEの病状を視覚化するために、光、透過電子、および共焦点顕微鏡のために目を準備する方法について説明します。また、統計的検定のためにRPEの病状を偏りのない方法で定量化する方法についても説明します。概念実証として、RPE表現型プロトコルを利用して、膜貫通タンパク質135-(Tmem135)過剰発現マウスおよび老化野生型(WT)C57BL/6Jマウスで観察された構造的RPE病理を調査します。要約すると、現在利用可能な標準プロトコルがないため、AMDマウスモデルでRPEを特徴付けるための表現型決定方法論を説明することを目的としています。AMDマウスモデルでも影響を受ける光受容体または脈絡膜の病状の調査と定量化に関心のある研究者は、このプロトコルが研究に役立たない可能性があります。
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Protocol
動物を対象とするすべての手順は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物管理および使用委員会によって承認されており、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明に準拠しています。
1. 光学顕微鏡によるマウスRPEの評価
- ガラス瓶に室温(RT)で最終濃度が2%のパラホルムアルデヒドと2%のグルタルアルデヒドの固定液バッファーを作ります。
注:このプロトコルでは、マウスあたり最大14 mLの固定液バッファーが必要です。
注意: パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは有害物質です。これらの物質を取り扱うときは、標準的な操作手順に従ってください。 - ヒュームフード内の心臓灌流用の吸収性アンダーパッドに重力供給灌流システムを準備します(補足図1A)。
- 40 mLの固定バッファーを灌流システムのシリンジバレルに入れます(補足図1B)。
- バルブがチューブラインと平行になるまで回して、バッファーがチューブラインを流れるようにします(補足図1C)。すべての気泡がラインから除去されるまで、バッファーでラインをフラッシュします。
- バルブをチューブラインに垂直になるまで回して、バッファーがチューブラインに流れ込まないようにします(補足図1D)。
注意: これで、灌流システムを使用する準備が整いました。
- マウスを二酸化炭素(CO2)チャンバーに入れて安楽死させ、CO2をチャンバー容積の毎分の30%の流量でチャンバー内に流入させる。マウスが呼吸を停止したら、CO2をチャンバーに少なくとも1分間流します。次の手順に進む前に、マウスが不良であることを確認します。
注:薬理学的物質の注射による安楽死は、このプロトコルではCO2 吸入の代替として使用することができる。 - 安楽死させたマウスに心臓灌流を行う。
- マウスを灌流システムの近くの浅いトレイに移し、腹部を上に向けてください。腹部に70%エタノール(EtOH)をスプレーします。
- 腹腔を露出させるために4つの切開を行います(補足図2A)。
- 胸郭の真下にあるマウスの左端の皮膚と腹壁を通して湾曲したハサミと鉗子を使用して5 cmの劣った切り込みを作成します。
- 下切り傷の上部から始まるマウスの皮膚と腹壁を通して3 cmの内側の切り込みを入れます。
- 胸郭の真下のマウスの最も遠い右側の皮膚と腹壁を通る内側の切り込みの端にさらに5 cm下の切り込みを入れます。
- さらに3 cmの内側切開を行い、湾曲した鉗子で腹部の皮膚皮弁を取り除きます。
- 横隔膜と胸骨を切り裂いて心臓を露出させます(補足図2B)。
注意: 心臓、動脈、静脈に傷を付けないように注意してください。これらを刻むと、非効率的な心臓灌流につながります。 - ゲージ針を心臓の左心室に挿入します。チューブラインと平行になるまでバルブを回します。右心房を湾曲したハサミで切断し、血液と固定剤が心臓から出るようにします(補足図2C)。
- 10 mLの固定バッファーをマウスに少なくとも1〜2分間浸透させるか、肝臓の色が薄くなり、右心房から血液が流れなくなるまで待ちます。.灌流が完了したら、チューブラインに垂直になるまでバルブを回して、バッファーの流れを停止します。
- 心臓灌流後にマウスから眼を摘出する。
- 浅いトレイからマウスを取り外し、ドラフトの吸収性アンダーパッドにマウスを置きます。左目が実験者の方を向き、右目が見えなくなるようにマウスの頭を向けます。目の上側に組織マーキング染料で注釈を付けます。
- 親指と人差し指で眼窩の周りをそっと押し下げて、眼窩から目をはみ出させます(補足図3A)。
- 湾曲したはさみを取り、眼窩から30°の角度で刃でそれを保持します。湾曲したハサミで目の周りを30°の角度で切ります(補足図3B)。
注意: 眼球の完全性を維持するために、眼窩から余分な組織を切り取ってもかまいません。 - 湾曲した鉗子で頭から眼球を取り除き、吸収性のアンダーパッドの上に置きます。11番のメスの刃で角膜をニックし、湾曲した鉗子で2 mLの固定バッファーを含む2 mLのマイクロチューブに目を入れます。2 mLマイクロチューブにマウス識別用のラベルを付け、左目を示すために「左」を示します。
注:角膜の傷は、固定剤がそれをよりよく保存するために目に容易に浸透することを可能にします。 - 右目に対して手順1.5.1〜1.5.4を繰り返します。
- 固定バッファー中で、4°C(C)室のシェーカー上で毎分75回転(rpm)の速度で一晩インキュベートします。
- 固定液バッファーを2 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と交換します。1x PBSで、RTおよび75rpmのシェーカーで10分間目をインキュベートします。この手順を 2 回繰り返します。
- 目をきれいにして解剖し、後部セグメントを生成します。
注:後部セグメントは、角膜、虹彩、および水晶体のない神経網膜、RPE、脈絡膜、および強膜を備えたマウス眼球です。- 解剖顕微鏡下で1x PBSで満たされたペトリ皿に目を置きます(補足図4A)。
- 先端の細かい鉗子で脂肪や筋肉を眼球からそっと持ち上げます。眼球が均一な青みがかった黒色になるまで、マイクロ解剖ハサミで眼球と平行方向に脂肪と筋肉を慎重にトリミングします(補足図4B)。
注意: 眼球を損傷するため、垂直方向に切断しないでください。また、処理中に組織マーキング染料が剥がれた場合は、すぐに眼球の上側に注釈を付け直してください。 - 角膜穿刺部位に先端の細かい鉗子を置きます。角膜の周囲を切断し、穿刺部位から始めて、マイクロ解剖ハサミで、眼球から角膜と虹彩を除去します(補足図4C)。
- 先端の細かい鉗子を取り、眼球からレンズをそっと取り外して、後部セグメントを生成します(補足図4D)。
- 後部セグメントを2 mLの1x PBSを含む2 mLのマイクロチューブに戻します。後部セグメントは4°Cの冷蔵庫に保管してください。
注:後部セグメントは、さらに処理する前に、4°Cで1x PBSに何週間も留まる可能性があります。
- 手順1.3〜1.8を繰り返して、研究の他のマウスから目を準備します。
- 切片作成のために、各マウスの後方セグメントの1つをパラフィンに処理して埋め込みます。後部セグメントの上側が上にあることを確認してください。
注:著者は、これらのタスクを実行するためにウィスコンシン大学マディソン校(UW)の病理学におけるトランスレーショナルリサーチイニシアチブ(TRIP)ラボに依存しています。ここに公開されている、同様のパラフィン処理および埋め込み方法23、24を使用するプロトコルがある。 - 各パラフィンブロックをトリミングして切片化し、視神経乳頭を含む厚さ5 μmの網膜切片と、互いに250 μm離れた厚さ5 μmの網膜切片を4つ追加します。スライドにマウスIDとシリアル番号(1、2、3、4、または5)のラベルを付けます。スライドをスライド ボックスに格納します。
注:著者らは、パラフィン切片作成のサービスをUW TRIPラボに依存しています。ここに、同様のパラフィン切片法25、26を用いた公開されたプロトコルがある。 - 網膜切片を含むスライドをヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色します。H&E染色のプロトコルは、 補足図5に記載されています。
注:H&E染色手順のすべてのステップは、ドラフト内で完了する必要があります。 - H&E染色された網膜切片のステッチ画像をスケールバーで、光学顕微鏡を使用して20倍の倍率で収集します。
- 各サンプルの視神経乳頭を含む網膜画像におけるRPEの厚さを定量化します。
- Fiji ImageJプログラムをダウンロードして開きます。視神経乳頭を含むすべてのステッチ網膜画像をFiji ImageJタスクバーにドラッグします。画像スケールがピクセルではなくμmでキャリブレーションされていることを確認します。
注意: 画像スケールは、Fiji ImageJプログラムの網膜画像を含むウィンドウの左上隅にあります。スケールがピクセル単位で設定されている場合は、Fiji ImageJプログラムの取扱説明書を参照して、ピクセルをμmに変換してください。 - 視神経乳頭の端から網膜の端(鋸歯状突起)までの各画像に300μm間隔ごとにマークを付けます。フィジーImageJタスクバーの ストレート アイコンをクリックします。視神経乳頭の端から長さ300μmの鋸筋に向かって線をクリックしてドラッグします。Fiji ImageJタスクバーの ペイントブラシ ツールをクリックし、300 μmの線の端をクリックしてマークします。
- マークされた各間隔でRPEの厚さを測定します。フィジーImageJタスクバーの ストレート アイコンをクリックします。RPEの上から下に線をクリックしてドラッグします(補足図6)。Fiji ImageJメニューバーの [分析>測定 ]をクリックして、RPEの厚さを取得します。
- RPE厚さ測定値をスプレッドシートに転送し、測定値を含むカラムにマウス識別のラベルを付けます。追加の列に「マークされた間隔」のラベルを付け、視神経値からの距離(つまり、300、600、900など)を入力します。
注:最初の測定間隔は視神経から300μm離れており、2番目に測定された間隔は600μm離れています。
- Fiji ImageJプログラムをダウンロードして開きます。視神経乳頭を含むすべてのステッチ網膜画像をFiji ImageJタスクバーにドラッグします。画像スケールがピクセルではなくμmでキャリブレーションされていることを確認します。
- 各サンプルの網膜画像に基づいてRPE病理発生率を定量化します。
- フィジー ImageJ プログラムを開きます。
- Fiji ImageJプログラム内のセルカウンターアプリケーションを開きます。Fiji ImageJメニューバーの[プラグイン]>[セルカウンターの分析]>をクリックします。網膜画像をFiji ImageJタスクバーにドラッグし、セルカウンターウィンドウで初期化をクリックします。
- セルカウンターアプリケーションを使用して、網膜切片あたりのRPE病状の数を数えます。[カウンター]の下の[タイプ1]をクリックし、画像内のすべての微小液胞化イベントをクリックします。[カウンター]の下の[タイプ2]をクリックし、画像内のすべてのマクロ液胞化イベントをクリックします。[カウンター] の下の [Type 3] をクリックし、イメージ内のすべての個々の移行イベントをクリックします。
- RPE病理の番号をスプレッドシートに転送します。行に微小液胞化、マクロ液胞化、または移行のいずれかのラベルを付け、列にマウス識別のラベルを付けます。
- サンプルの他の画像に対して手順1.15.2-1.15.4を繰り返します。サンプルあたりのRPE病理の数を平均し、5で割って、スプレッドシート内のサンプルの各RPE病理の発生率を計算します。
- 各区間でのRPEの厚さとRPE病理発生率の統計分析を実行して、研究のグループ間に有意差があるかどうかを判断します。
2. 透過型電子顕微鏡によるマウスRPEの評価
- ステップ1.5〜1.9の後に得られた他の後部セグメントを、かみそりの刃で上マークを通して半分に2つのセクションにカットします。切片化された後部セグメントの上側に組織マーキング染料で再注釈を付けます。切片化された後部セグメントを、2 mLの1x PBSとマウス識別を含む新しい2 mLマイクロチューブに分離します。
注:マウスの後方セグメントは大きすぎて1つのピースで処理できないため、透過型電子顕微鏡処理のために半分にカットする必要があります。 - 2 mLの0.1 Mカコジル酸緩衝液、pH 7.2で組織をすすぎます。ベンチトップのRTで10分間インキュベートします。この手順をさらに 2 回繰り返します。
- 0.1 Mカコジル酸バッファーを、0.1 Mカコジル酸バッファーで希釈した2 mLの2%四酸化オスミウム(OsO4)と交換します。ドラフト内のRTで1.5時間インキュベートします。
注意: OsO4 は有毒物質です。OsO4を使用する場合は、標準の操作手順に従ってください。 - 組織を2 mLの0.1 Mカコジル酸バッファーで、ドラフト内のRTで10分間すすぎます。この手順を一度繰り返します。
- ドラフト内のRTで50%から100%の範囲の段階的なEtOH希釈で組織を脱水します。脱水手順のプロトコルは、 補足図7に記載されています。
- 組織から100%EtOHを除去し、組織に2 mLのプロピレンオキシドを加えます。ドラフト内のRTで15分間インキュベートします。組織からプロピレンオキシドを取り除き、2mLの新鮮なプロピレンオキシドを組織に加えます。ドラフト内のRTで15分間インキュベートします。
注意: プロピレンオキシドは有毒物質です。プロピレンオキシドを取り扱うときは、標準的な操作手順に従ってください。 - 組織からプロピレンオキシドを除去し、プロピレンオキシドと樹脂の1:1混合物2mLを組織に追加します。RTのドラフト内の真空下で一晩放置します。
注意: 樹脂は人体にとって危険な物質です。樹脂を取り扱う際は、ラボの標準操作手順に従ってください。 - 組織からのプロピレンオキシドと樹脂の1:1混合物を2mLの純粋な樹脂に置き換えます。RTのドラフト内の真空下で一晩放置します。
- 組織を樹脂に埋め込みます。マウス識別ラベルを鉛筆で、樹脂を一滴型に入れます。ティッシュをレジン滴の上に置きます。金型に樹脂を充填し、ドラフト内のRTで1時間真空下に置きます。
- ラベルと標本を細い先端の鉗子で再配置し、後眼窩セクションの後側を上にします。ドラフト内のオーブンで65°Cで一晩金型を放置します。
- 金型をオーブンから取り出します。金型を冷ましてベンチトップでRTします。型からブロックを取り外します。
注: これで、ブロックをトリミングする準備が整いました。 - 樹脂ブロックをかみそりの刃で形作り、台形にします。視神経乳頭が見えるまでミクロトームを使用して樹脂ブロックをトリミングします。ダイヤモンドナイフを使用して、厚さ0.5μmの樹脂ブロックから半薄切片を切り取ります。
注:ミクロトーム切片27に関する公開されたプロトコルは次のとおりです。必要に応じて、樹脂ブロックから厚さ0.5 μmの半薄切片を採取して染色し、サンプルの完全性を評価することができます。 - トリミングした各ブロックから厚さ70 nmの超薄切片をウルトラミクロトームで切り取ります。400メッシュの薄いバー銅グリッド上の厚さ70nmの超薄切片を収集します。グリッドをグリッド収納ボックスに入れ、マウス識別でスロットにラベルを付けます。
注:これは、ウルトラミクロトーム切片28に関する公開されたプロトコルです。 - グリッドを2%酢酸ウラニルで5分間染色し、次に3.5%クエン酸鉛溶液でドラフト内のRTで5分間染色します。
注意: 酢酸ウラニルとクエン酸鉛は有害物質です。これらの物質を取り扱うときは、標準的な操作手順に従ってください。 - 透過型電子顕微鏡を用いて、銅グリッドのグリッド線がRPEとBrMと交差する倍率15,000倍で各試料の画像を取得します。
注:セクションごとに少なくとも20〜35枚の画像、サンプルごとに40〜70枚の画像が必要です。 - 研究のサンプルの画像でBLamDの高さを定量化します。
- フィジー ImageJ プログラムを開きます。サンプルセクションからFiji ImageJタスクバーにすべての画像をドラッグします。画像がピクセルではなくμmでキャリブレーションされていることを確認します。
- 画像内のBLamDの高さを測定します。フィジーImageJタスクバーの ストレート アイコンをクリックします。BrMの弾性単層から画像内の最も高い堆積物の上部まで線をクリックしてドラッグします(補足図8)。Fiji ImageJ メニュー バーの [ 解析>計測 ] をクリックして、画像の BLamD の高さを取得します。
注:画像にBLamDがない場合は、BrMの弾性単層からRPEの基底層まで線を引きます。 - BLamDの高さをスプレッドシートに転送し、マウス識別でラベルを付けます。
- スプレッドシートで、遺伝子型ごとのBLamD身長の累積頻度とマウスあたりのBLamD身長の平均を計算します。BLamDの高さの平均について統計分析を実行して、研究のグループ間に有意差があるかどうかを判断します。
3. 共焦点顕微鏡によるマウスRPEの評価
- マウスから目を集める。ステップ1.3に記載した手順に従ってマウスを安楽死させる。手順1.5を使用して目を除核します。湾曲した鉗子を使用して、2 mLの1x PBSとマウス識別を含む2 mLマイクロチューブに目を入れます。
注:光受容体とRPE頂端プロセスの相互デジタル化により、共焦点顕微鏡によるRPEのより良い視覚化が可能になるため、マウスを暗順応させないでください。 - マウスの目をすぐにきれいにして解剖し、マウスの後眼窏を生成します。
注:後部アイカップは、神経網膜を含まないため、後部セグメントとは異なります。- 解剖顕微鏡下で1x PBSを含むシャーレに眼を移します(補足図9A)。
- ステップ1.8.2(補足図9B)で説明されているように、眼球から脂肪と筋肉を取り除きます。
- 11番のメスの刃で眼球の角膜をニックします。手順1.8.3(補足図9C)で詳しく説明されているように、角膜と虹彩を取り除きます。
- 先端の細かい鉗子でレンズを引き出します。先端の細かい鉗子を2つ取り、神経網膜を後部からそっと分離します。
- 後眼窯から取り外すために、視神経乳頭の神経網膜を注意深く切断します(補足図9D)。
- 後眼球を、マウス識別付きの500 μLの1x PBSを含む新しい2 mLマイクロチューブに入れます。
- 後部アイカップをメタノール(MeOH)で固定します(補足図10)。
注: 手順 3.3 の完了には約 2 時間 40 分かかります。- 500 μLのMeOHを組織に加えます。シェーカーで75 rpmでRTで5分間インキュベートします。
- 組織から500μLの溶液を取り除き、500μLのMeOHを加えます。シェーカー上で75 rpmで5分間、RTで5分間インキュベートします。 この手順をもう一度繰り返します。
- 組織から溶液全体を取り除き、500μLのMeOHを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで少なくとも2時間インキュベートします。
注意: ステップ3.3.3の代わりに、後部アイカップをMeOH中で4°Cの部屋で75rpmのシェーカーで一晩インキュベートすることができます。 - 500 μLの1x PBSを組織に加えます。シェーカーで75 rpmでRTで5分間インキュベートします。
- 組織から500 μLの溶液を取り除き、500 μLの1x PBSを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで5分間インキュベートします。 この手順をもう一度繰り返します。
- 組織から溶液全体を取り除き、500 μLの1x PBSと交換します。
注意: 組織はMeOHによって完全に固定されており、4°Cの冷蔵庫に少なくとも1か月間保管できます。
- 後眼珠の免疫蛍光染色を行い、RPEのタイトジャンクションと核を可視化します(補足図11)。
- サンプルから500 μLの1x PBSを取り除き、1x PBS溶液に希釈した10%正常ロバ血清100 μLを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで30分間インキュベートします。
- 希釈した10%正常ロバ血清溶液をサンプルから取り出し、1x PBSでウサギポリクローナル抗ゾヌラオクルーデンス-1(ZO-1)抗体の1:50希釈液を100 μL加えます。サンプルを4°Cの部屋に移し、75 rpmのシェーカーで一晩インキュベートします。
- サンプルから抗体希釈液を取り除き、2 mLの1x PBSを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで10分間インキュベートします。 この手順をさらに 2 回繰り返します。
- サンプルから1x PBSを取り除きます。488 蛍光色素標識タグを有するロバ抗ウサギ IgG 抗体の 1:250 希釈液と 1:250 希釈液の 4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) を 1x PBS でサンプルに加えます。サンプルをアルミホイルで覆い、シェーカー上で75 rpmでRTで2時間インキュベートします。
注意: 光退色を防ぐために、サンプルはアルミホイルで完全に覆う必要があります。 - サンプルから抗体およびDAPI希釈液を除去します。サンプルに2 mLの1x PBSを加え、アルミホイルで再び覆い、シェーカー上で75 rpmでRTで10分間インキュベートします。 この手順をさらに 3 回繰り返します。
注:RPEのタイトジャンクションと核は、それぞれ完全に標識され、染色されています。
- 後部アイカップを顕微鏡スライドに取り付けます。
- 顕微鏡スライドにマウス識別のラベルを付けます。後眼球を、脈絡膜側を下に向けて解剖顕微鏡下の顕微鏡スライドに移します。後眼球に1x PBSを1滴加えて、乾燥を防ぎます(補足図12)。
- 11番のメスの刃を使用して、基本的な方向(つまり、北、東、南、西)に対応する4つの象限を生成する4つのスポットで後眼窬を切断します。後部アイカップの周囲から組織で過剰な1xPBSを軽くたたきます。ラクダのヘアブラシと先端の細い鉗子で後眼碗をそっと平らにします(補足図12)。
注意: 結果として得られる製品は、現在RPEフラットマウントとして知られています。 - RPEフラットマウントに封入媒体を一滴加え、その上にカバーガラスを置きます。透明なマニキュアを塗ってカバーガラスを密封し、閉じた引き出しの中でRTで少なくとも30分間乾燥させます。スライドをスライドキャリアボックスに置き、ボックスを4°Cの冷蔵庫に保管します。
注意: RPEフラットマウントに気泡が入らないように注意してください。RPEフラットマウントは、2週間の時間枠内でイメージングできます。
- RPEフラットマウントの視神経を囲む4つの象限のそれぞれの画像を、各サンプルの20倍の倍率で共焦点顕微鏡で取得します。RPEフラットマウントイメージの例については、 補足図13Aを参照してください。
注意: RPEフラットマウントの寸法の違いを補正するために、複数の画像を撮影して積み重ねるRPEフラットマウントのzスタックイメージングを実行する必要がある場合があります。 - 各RPEフラットマウントイメージ内のRPEセルのタイトジャンクションをトレースします。トレースされたRPEフラットマウントイメージの例は、 補足図13Bにあります。
- フィジー ImageJ プログラムを開きます。RPE フラットマウントイメージをフィジー ImageJ タスクバーにドラッグします。画像がピクセル単位ではなくマイクロメートル単位でキャリブレーションされていることを確認します。
- Fiji ImageJタスクバーのオーバーレイブラシツールアイコンをダブルクリックして、ブラシ幅を3、透明度を0、色を赤に設定します。オーバーレイブラシツールウィンドウの閉じるボタンをクリックします。
- オーバーレイブラシツールアイコンをクリックします。完全に画像内にあるすべてのRPEセルのタイトジャンクションをクリックしてドラッグします。
注意: トレースミスが発生した場合は、オーバーレイブラシツールアイコンをダブルクリックし、[オーバーレイブラシツール]ウィンドウの[元に戻す]ボックスをクリックして、画像からトレースミスを削除します。 - Fiji ImageJ タスクバーの 長方形 アイコンをクリックします。画像をクリックして、画像の周囲をドラッグします。Fiji ImageJ メニュー バーの [ 編集>クリア ] をクリックして、トレースされた線を保持し、画像から青と緑の色を削除します。
- マウスの識別、象限の位置(つまり、北、南、東、または西)、およびCPサフィックスラベルを使用して、トレースイメージを適切な場所に保存します。
メモ: 手順 3.7.4 を完了する前に RPE トレースイメージを保存しないでください。
- 各サンプルのRPE細胞面積を計算します。
- RPEエリア分析からファイルを保存する場所を指定するには、パソコンのデスクトップ画面にフォルダを作成します。各RPEトレースイメージのサブフォルダを生成し、マウス識別と象限位置(北、南、東、または西)でサブフォルダにラベルを付けます。
- セルプロファイラプログラムをインストールして開きます29.Ikeda_RPE面積計算器.cpproj (補足コーディング ファイル 1) プロジェクト ファイルをダウンロードします。セルプロファイラーのプログラムメニューバーで >ファイルプロジェクトを開く をクリックして、Ikeda_RPE面積計算機.cpprojファイルを開きます。
- 1 つの RPE トレース イメージを Cell Profiler プログラム ウィンドウの [イメージ>ここにファイルとフォルダーをドロップ ] ボックスにドラッグします。
- フォルダの場所を、RPE トレースイメージに対応する Cell Profiler プログラムに入力します。Cell Profilerプログラムウィンドウの左下隅にある出力設定ボタンをクリックし、[デフォルトの入力フォルダー]テキストボックスと[デフォルトの出力フォルダー]テキストボックスにフォルダーの場所を入力します。
- セルプロファイラープログラムウィンドウの左下隅にある[画像の分析]ボタンをクリックします。分析が完了すると、画面に[分析完了]ウィンドウが表示されます。[分析の完了]ウィンドウの[OK]ボタンをクリックします。
注: この操作により、csv ファイルと jpeg 画像が生成されます。csv ファイルには、トレース イメージ内の RPE セルの領域が含まれます。jpeg画像はRPEトレース画像に対応し、各RPEセルには番号が付けられます(補足図13C)。 - RPE 領域を csv ファイルからスプレッドシートに転送します。スプレッドシートにマウス識別のラベルを付けます。
- csv ファイル内の各 RPE 領域が jpeg 画像内の完全にトレースされた RPE セルにリンクしていることを確認して、データの品質管理調査を実行します。完全にトレースされたRPEセルに対応しない値をスプレッドシートから削除します。
- セルプロファイラプログラムに戻ります。「 ファイルとフォルダをここにドロップ 」ボックスで RPE トレース・イメージ名を右クリックし 、「リストをクリア 」を選択して、Cell Profiler プログラムからイメージを削除します。
- 手順3.8.3〜3.8.8を繰り返して、サンプルの残りの3つのRPEトレース画像のRPEサイズを計算します。
- スプレッドシート内の各サンプルのRPEセルサイズ平均を定量化します。
- スプレッドシート内の各サンプルのRPE細胞密度を定量化します。RPEセル密度を計算するには、象限当たりのRPE細胞の総数を、セルプロファイラプログラムによって検出された象限当たりのRPE細胞の総面積で割る。サンプルあたり4つの象限からRPE細胞密度の平均を決定します。
- 各サンプルのRPEフラットマウントあたりの多核RPE細胞の数を定量化します。手順 1.15.1-1.15.3 で説明したように、Fiji ImageJ プログラム内の Cell Counter アプリケーションを使用して、サンプルの 4 つの象限で 3 つ以上の核を持つ RPE 細胞の数をカウントします。
- RPE細胞のサイズと密度の平均、および多核RPE細胞の数について統計分析を実行して、研究のグループ間に有意差があるかどうかを判断します。
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Representative Results
この記事に記載されているRPE表現型プロトコルの完成により、AMDのマウスモデルで一般的に観察される構造的RPE異常の定量的分析が可能になります。このプロトコルの有効性を確認するために、ニワトリベータアクチンプロモーター(Tmem135 TG)30によって駆動されるWT Tmem135を過剰発現するトランスジェニックマウスや、高齢のC57BL/6Jマウス31,32など、RPEの病状を示すことが知られているマウスで使用しました。これらの実験の目的は、このプロトコルに記載されている方法を使用して得られる代表的な結果を、マウスモデルに不慣れな研究者に示すことです。
プロトコルの ステップ1 の方法に従い、WTおよび Tmem135 TGマウスの眼を処理および評価し、光学顕微鏡を使用してRPEの病状を評価しました。生後4ヶ月の Tmem135 TGマウスでは、事後テューキー試験によるANOVAにより、年齢を一致させたWTと比較して、2つの測定間隔でRPEの厚さが有意に減少することが分かりました(図4)。これらの結果は、視神経から600μmおよび900μm離れた年齢を一致させたWTマウスよりも、4か月齢 のTmem135TG マウスでRPEが薄いことを示しています。
さらに、プロトコルの ステップ1 の方法を利用して、3匹の25日齢のWTおよび Tmem135 TGマウスの微小空胞化、大液胞化、および移動を含むRPE病状の発生率を計算しました(図5A)。WTマウスにおけるスライド当たりのRPE微小空胞化病変の平均頻度は0.67±0.31であり、 Tmem135 TGマウスにおける7.07 ± 0.61であった(図5B)。WTマウスではRPEマクロ液胞化はなかったが、 Tmem135 TGマウスでは平均5.33±2.02のマクロ液胞化イベントがあった(図5C)。最後に、スライド当たりの遊走性RPE細胞の割合は、WTマウスではゼロ、 Tmem135 TGマウスでは0.4 ± 0.35であった(図5D)。スチューデントt検定を実施した後、RPE微小液胞化および微小液胞化の発生率は、WTおよび Tmem135 TGマウスの間で有意に異なっていた。しかしながら、 Tmem135 TGマウスにおけるRPE遊走細胞の発生率の高さは、WTと比較して有意差はなかった(p = 0.1161)。このデータは、RPE微小液胞化およびマクロ液胞化は、移動ではなく、WTマウスよりも25日齢の Tmem135TG において有意に高いことを示している。
ステップ2に含まれるプロトコルの方法に従って、BLamDの存在と高さを分析するために、透過型電子顕微鏡観察用の2か月齢および24か月齢のWT C57BL / 6Jマウスの網膜切片を調製しました。生後24か月のWT網膜にはBLamDが存在するが、生後2か月のWT網膜には特に存在しないことがわかった(図6A)。生後24か月のWT網膜におけるBLamDの高さを、その発生の累積頻度を計算してプロットすることにより提示しました。BLamDの高さの累積頻度は、堆積高さの分布を説明するために堆積高さに対してグラフ化されました。生後2ヶ月のWT BLamDの高さと比較して、24ヶ月齢のWT BLamDの高さでは線の右側にシフトがあり、24ヶ月齢のWTマウスの沈着物の増加を示しています(図6B)。このグラフは、生後2ヶ月のWT網膜(1.01 μm±0.43 μm)のBLamD身長の平均が、生後2か月のWT網膜(0.23 μm±0.017 μm)よりも大きく、学生のt検定によって有意に異なっていたことによって裏付けられています(図6C)。要約すると、24か月齢のWTマウスは、2か月齢のWTマウスと比較して、網膜のサブRPE空間に大きなBLamDを持っていると結論付けています。
ステップ3で生後4ヶ月のWTおよびTmem135 TGマウスから眼を調製する方法を適用し、RPE異形および多核形成の検出および分析のためのRPEフラットマウントを作製した。このプロトコルでは、対照と比較したAMDマウスモデルにおけるRPE細胞のサイズと密度の変化によってRPE異形を定義しました。我々は、4ヶ月齢のTmem135 TGマウスにおけるRPEが異形性であることを見出した(図7A)。Tmem135 TG網膜のRPEは、年齢が一致したWT網膜よりも大きく(806.89 μm 2 ± 252.67 vs 291.69 μm 2 ± 26.31)、密度が低く(0.0014細胞/μm 2 ± 0.00039 vs. 0.0033細胞/μm 2 ± 0.00024)。さらに、WT対照と比較して、Tmem135 TG網膜にはより多くの多核RPE細胞がありました(8.04細胞±5.54対0.33細胞±0.29)(図7D)。これらのパラメータはすべて、学生のt検定で統計的有意性に達しました。一緒に、4ヶ月齢のTmem135 TGマウスは、4ヶ月齢のWTマウスよりも多くの異形性および多核RPE細胞を有する。
図1:光学顕微鏡で検出されたRPEの病状。 WT(A)における正常なRPEおよび Tmem135 TGマウスにおける異常なRPE(B-E)の代表的な画像。 Tmem135 TGマウスで観察されるRPE病理には、RPE菲薄化(B)、マクロ液胞化(C)、微小空胞化(D)、および遊走(E)が含まれる。各病理は黒い矢印で示されています。スケールバー = 100 μm. 倍率 = 20x.略語:RGC =網膜神経節細胞層、IPL =内網状層、INL =内顆粒層、OPL =外網状層、ONL =外顆粒層、IS =光受容体内部セグメント、OS =光受容体外側セグメント、RPE =網膜色素上皮、Cho=脈絡膜。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:透過型電子顕微鏡で検出されたRPE病理。基底層状沈着物(BLamD)が豊富なCFH-H/H幼齢マウスおよび(B)2歳CFH-H/Hマウスにおける(A)RPEの代表的な画像。BLamDは、画像内で黄色の点でトレースされています。スケールバー= 800 nm。倍率 = 15,000倍。略語:N =核、M =ミトコンドリア、P =色素顆粒、BI =基底折り畳み、EL =弾性薄板、RPE =網膜色素上皮、BrM =ブルッフ膜、チョ=脈絡膜。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:共焦点顕微鏡で検出されたRPE病理。 RPE異形を呈する8ヶ月齢のWTの(A)正常RPEおよび(B)8ヶ月齢 Tmem135 TGマウスの異常RPEの代表的な画像。白い四角形を拡大して(C)、3つの核を持つ多核RPE細胞を描いています。緑色は抗ZO1関連RPEタイトジャンクションであり、青色はRPE核のDAPI染色です。スケールバー = 50 μm。 倍率 = 20x. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:4ヶ月齢の野生型(WT)およびTmem135 TGマウスにおけるRPEの厚さ。 (A)4ヶ月齢のWTおよびTmem135 TG(TG)マウス由来の網膜の代表的な画像。倍率 = 20x。スケールバー = 100 μm。 (B)視神経から3,000μm離れた4ヶ月齢のWT(黒)およびTmem135 TGマウス(緑)におけるRPE厚さ測定の折れ線グラフ。遺伝子型の後の数字は、本研究で使用したマウスの数を示す。*p < 0.05、事後テューキー検定による分散分析。すべてのデータは平均±sdです。網膜層の略語については、図1の凡例を参照してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:25日齢のTmem135 TGマウスにおけるRPEの病態。 (A)25日齢のTmem135 TG(TG)マウス3匹におけるRPE微小液胞化、マクロ液胞化、および遊走の代表的な画像。RPE病理は、各画像で黒い矢印で強調表示されています。倍率 = 40x。スケールバー = 20 μm。 (B-D)25日齢のWTおよびTmem135 TGマウスにおけるRPEマイクロおよびマクロ液胞化ならびに遊走性RPE細胞の定量化。括弧内の数字は本試験で用いたマウスの数を示す。*p < 0.05 および ****p < 0.0001、スチューデントのt検定。すべてのデータは平均±sdです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:若年および高齢のWT網膜におけるBLamDの超微細構造解析 。 (A)生後2ヶ月および24ヶ月齢のWT RPEの代表的な電子顕微鏡写真。倍率 = 15,000倍。スケールバー= 800 nm。基底層流堆積物(BLamD)の例をブラケットで図解します。(B)BLamDの高さの累積周波数。(C)BLamDの高さの平均。括弧内の数字は、本研究で用いた遺伝子型当たりのマウスの総数を示す。**p < 0.01、スチューデントのt検定。すべてのデータは平均±sdです。網膜層の略語については、 図2 の凡例を参照してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:RPEフラットマウントは、Tmem135 TGマウスにおけるRPE病理を明らかにする。 (A)生後4ヶ月のWTおよびTmem135 TG(TG)RPEフラットマウントの代表的な画像で、抗ZO-1が緑色、DAPIが青色です。 倍率 = 20x。スケールバー = 100 μm。 (B)4ヶ月齢のWTおよびTmem135 TGマウスにおけるRPE細胞サイズ、(C)RPE細胞密度、および(D)RPE多核化。括弧内の数字は、本試験に用いたマウスの数を示す。*p < 0.05, **p < 0.01 および ****p < 0.0001, スチューデントの t 検定.すべてのデータは平均±sdです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:心臓灌流のセットアップと使用の概略図。 (A)重力供給灌流システム。(B)固定バッファー用の灌流システムのシリンジバレル。(C)バッファーがチューブラインを流れるように、チューブラインと平行になるまでバルブを回します。(D)バッファーがチューブラインに流れ込むのを防ぐために、チューブラインと垂直になるまでバルブを回します。バイオレンダーで作成された画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:マウスの心臓灌流の手順の概略図。 (A)腹腔を露出させるために作られた4つの切開。(B)横隔膜と胸骨を切断して心臓を露出させます。(C)心臓の左心室に挿入されたゲージ針。バルブは、チューブラインと平行になるまで回転します。右心房は湾曲したハサミで切断され、血液と固定液が出ます。バイオレンダーで作成された画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:マウスから眼を摘出する手順の概略図。 (A)親指と人差し指で眼窩の周りをそっと押し下げて、眼窩から眼がはみ出るようにします。(B)湾曲したハサミを取り、眼窩から30°の角度で刃で持ちます。湾曲したハサミで目の周りを30°の角度で切ります。色付きの点は、マウスまたは湾曲したはさみでの指の配置を表します。バイオレンダーで作成された画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:マウス後眼部を生成するためのマウス眼解剖の写真。 (A)眼を解剖顕微鏡に移した。(B)眼球から脂肪と筋肉を取り除く。(C)眼球から角膜と虹彩を除去します。(D)眼球からレンズを取り外した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:ヘマトキシリンエオジン(H&E)染色手順。 パラフィン包埋網膜切片を染色するためのH&E手順を示す概略図。矢印はステップ間の転送を示します。各ステップの時間は赤いフォントで示されています。染色用試薬は、ガラス染色容器内に黒色のフォントで提供されます。上の図に含まれている各試薬用に準備されたガラス染色容器があるはずです。すべてのステップはドラフト内で完了する必要があります。スライドにカバーガラスを追加するときは、スライドに気泡が入らないように注意してください。手順が完了したら、スライドをスライドボックスに保存できます。バイオレンダーで作成された画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:RPE厚さ測定の例。 黒い矢印は、RPE の上から下への赤い線を示しています。この線を測定して、RPEの厚さを決定することができます。スケールバー = 100 μm. 倍率 = 20x.ボックス化された領域は、RPE を見やすくするために縮小されています。網膜層の略語については、 図1 の凡例を参照してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図7:TEM処理のためのマウス後部セグメントのEtOH脱水手順。 バイオレンダーで作成された画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図8:BLamDの高さ測定の例。 赤い線は、この画像で最大のBLamDを示しています。黄色の点は、画像内の BLamD を示しています。この赤い線を測定すると、この画像のこのBLamDの高さを決定できます。スケールバー= 800 nm。倍率 = 15,000倍。網膜層の略語については、 図2 の凡例を参照してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図9:RPEフラットマウントのためのマウス目の解剖。 (A)解剖顕微鏡下で1x PBSを含むシャーレに眼を移した。(B)眼球から脂肪と筋肉を取り除く。(C)眼球から角膜と虹彩を除去します。(D)眼球から水晶体と網膜を摘出した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図10:マウス後部アイカップのメタノール(MeOH)固定手順。 バイオレンダーで作成された画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図11:RPE細胞のタイトジャンクションおよび核を標識するための免疫蛍光法。 このプロトコールからの免疫蛍光技術のステップを描写する図。この手法は、完了するまでに 2 日かかることに注意してください。すべてのステップは、図に特に明記されていない限り、RTおよび75rpmの速度のシェーカーで行われます。本試験で用いた一次(1°)抗体はウサギポリクローナル抗ZO1であり、本研究で用いた二次(2°)抗体は488個の蛍光色素結合ロバ抗ウサギIgGでした。二次抗体とDAPIをサンプルに添加したら、サンプルの光退色から保護するためにサンプルをアルミホイルで包む必要があります。バイオレンダーで作成された画像。略語:NDS =正常ロバ血清、Ab =抗体。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図12:マウスRPEフラットマウントの4象限を生成するためのカットの描写。 N =北、E =東、S =南、W =西。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図13:RPEフラットマウント分析エンドポイントの例。 (A) RPE フラット マウント イメージ。(B)RPE境界トレース画像。(C)RPEセルプロファイラ解析画像。倍率 = 20x. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:池田RPE面積計算機.cpproj このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、マウスモデルの構造的RPE病理を評価するための表現型プロトコールについて紹介しました。光、透過電子、共焦点顕微鏡など、さまざまなイメージング技術のために眼を処理するために必要な手順と、これらのイメージング方法で観察される典型的な病状の定量について説明しました。Tmem135 TGおよび24ヶ月齢のWTマウスはRPE病理30,31,32を示すため、RPE表現型プロトコルの有効性を証明した。このプロトコルは、BLamDs 6,7と同様に、RPEの菲薄化、空胞化、遊走、異形症などのRPE病理を有する可能性のある遺伝子組み換えまたは薬理学的に治療されたマウスに適用できます。Tmem135 TGおよび24ヶ月齢のWTマウスで観察されたRPE病理は他のAMDマウスモデルに存在するが7,30、AMDマウスモデルの発症年齢およびRPE病状の重症度はTmem135とは異なる可能性があるため、研究者は研究のために選択されたAMDマウスモデルに精通することが重要です TGおよび24ヶ月齢のWTマウス。研究者は、RPEの病状の提示がそれぞれのAMDマウスモデルで変動する場合、この記事で示されている代表的な結果を生成するために使用されるマウスの数よりも多くのマウスを研究に利用する必要があるかもしれません。さらに、多くのAMDマウスモデルは現在AMD研究者が利用できますが、RPEの病状の完全な説明がないため、研究者はこの情報を取得するために予備調査を行う必要がある場合があります。
さまざまなイメージング方法のためにマウスの目の処理方法を変更することができますが、プロトコルに記載されているように構造的RPE異常の定量的評価を維持することが重要です。例えば、RPE微小空胞化、マクロ液胞化、および遊走事象の数をカウントするために、5つのH&E染色網膜切片を調製し、研究者がマウス網膜の複数の場所でRPE病理を評価できるようにした。別の例は、400メッシュの薄い棒銅電子顕微鏡グリッドを使用して、RPEの微細構造異常を評価することです。電子顕微鏡グリッドは、透過型電子顕微鏡法によって網膜サンプルを体系的かつ偏りなく評価し、網膜切片ごとに40〜70枚の画像を取得してBLamDの存在を調べるためのフレームワークを提供します。これは電子顕微鏡スロットグリッドでは達成できないため、このプロトコルでは利用しないことをお勧めします。最後に、RPEフラットマウントの4つの象限から20倍の倍率の画像をキャプチャすることで、研究者はマウスRPEの広い領域を異形症と多核形成について調査することができます。研究者は、このプロトコルを自由に拡張し、研究においてRPEの病状について追加の網膜切片を調べることができます。これらの方法を組み合わせることで、研究者は十分なデータを収集して、AMDマウスモデルに存在する可能性のある構造的RPEの病状について結論を出すことができます。
このプロトコルのもう一つの重要な特徴は、RPE表現型解析法の一貫性です。例えば、光顕微鏡および透過型電子顕微鏡に使用されるすべての眼は、切片化のためにマウス網膜の上側によって配向された。マウス眼は網膜細胞のトポグラフィー分布を有するので、光および透過型電子顕微鏡のためのその処理を通してマウス眼の配向を維持することは重要である33、34。マウスRPE細胞の劣った地形変化よりも優れているため、RPEフラットマウント調製のためにマウス眼の解剖学的配向は維持されなかった。実際、ヒト網膜におけるRPEは、視神経乳頭35から離れて放射状に広がる地形的変化を示し、これがマウスRPEの場合であり得ることを示唆している。最後に、このプロトコルに記載されている画像取得は、視神経の解剖学的位置に依存しています。これらの方法論的側面を含めることで、研究者がAMDマウスモデルを扱う際にRPE病理の結果を再現するのに役立ちます。
研究者は、RPE表現型プロトコルにさらに分析機能を追加したいと思うかもしれません。このプロトコルには含まれていないいくつかの表現型の結果は、BrMの厚さ、RPE頂端微絨毛、およびその他のRPE超微細構造成分の検査です。これらの成分には、ミトコンドリア、色素顆粒、およびファゴソームのような他の細胞小器官が含まれます。研究者は、フィジーImageJプログラムを使用して、このプロトコルで得られた電子顕微鏡写真でこれらのコンポーネントのサイズと数を決定できます。特に、RPEでミトコンドリアを標的とすることはAMD36の重要な治療戦略であるため、ミトコンドリアの状態は考慮すべき重要な表現型の結果である可能性があります。別の表現型アウトカムは、RPEフラットマウント上のRPE異形症の追加測定である。プロトコルを用いて得られたRPEフラットマウント画像は、REShAPEプログラム(https://github.com/nih-nei/REShAPE)35を用いて、RPEの六角形形状、隣接RPEセル数、その他の特性を調べることができる。別の考えられる表現型の結果は、RPE病理がマウス網膜の中央領域または末梢領域で発生するかどうかです。これらの追加の表現型の考慮事項は、この記事で説明されているRPE表現型プロトコルをさらに強化します。
このRPE表現型プロトコルにはいくつかの制限があります。この方法の1つの制限は、RPE表現型のために目を得るためにマウスを犠牲にする必要があることです。別の方法として、スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー(SD-OCT)イメージングの新たな進歩により、生きているマウスにおけるRPEの厚さと病状の定量化が可能になります37〜39。これは、AMDマウスモデルコホートで縦断的研究を行いたい研究者にとって有利かもしれません。この方法の別の制限は、マウスにおける機能的RPE評価の欠如である。研究者がマウスのRPEの機能評価に関心がある場合は、c波が光伝達におけるRPEの機能的役割を示しているため、網膜電図検査を行い、c波成分を測定することをお勧めします40。この方法の別の制限は、マウスにおけるRPEマーカーの生化学的測定の欠如である。細胞レチンアルデヒド結合タンパク質(CRABLP)、網膜色素上皮特異的65 kDaタンパク質(RPE65)、カリウム内方整流チャネルサブファミリーJメンバー13(KCNJ13)、またはベストロフィン1(BEST1)などのRPEマーカーのレベルを調査したい場合は、免疫組織化学、定量的リアルタイムPCR、またはウェスタンブロット分析のために眼を採取することをお勧めします。
結論として、このRPE表現型プロトコルは、AMDの病理学的側面を再現するマウスモデルを使用する研究者にとって重要なリソースになる可能性があります。このプロトコルはまた、AMDマウスモデルにおいてRPEがどのように評価されるかを標準化する役割を果たすが、これは文献においてこれまで記載されていなかった。RPE表現型の標準化は、マウスの知見を、RPE細胞培養モデル4 や非ヒト霊長類を含む高等生物モデルを含むAMDの他のモデルに変換する上で重要です。また、AMD発症の根底にある病態生物学的メカニズムの理解や、この失明性疾患に対する新しい治療法の開発にも役立つでしょう。
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Disclosures
このプロトコルの著者には、開示や利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、木下聡とウィスコンシン大学(UW)の病理学研究所(TRIP)におけるトランスレーショナルリサーチイニシアチブが、光学顕微鏡用に組織を調製してくれたことに感謝したいと思います。このコアは、ウィスコンシン大学炭素がんセンターのUW病理学および検査医学部門(P30 CA014520)、およびNIH所長室(S10OD023526)によってサポートされています。共焦点顕微鏡は、UW生化学基金の支援を受けて設立されたUW生化学光学コアで実施されました。この研究は、国立眼科研究所からの助成金によっても支援されました(R01EY022086から池田敦;R01EY031748からC.ボウズリックマンへ。P30EY016665をUWの眼科および視覚科学科に。デュークアイセンターへのP30EY005722。NIH T32EY027721からM.ランドウスキーへ。F32EY032766からM.ランドウスキーへ)、ティモシーウィリアムトラウト会長(池田A)、FFBフリーファミリーAMDアワード(C.ボウズリックマン);失明を防ぐための研究(デュークアイセンター)からの無制限の助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 | PolyScientiifc R&D Company | S1619 | |
| 100 Capacity Slide Box | Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.) | ||
| 100% Ethanol | MDS Warehouse | 2292-CASE | Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol. |
| 1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks | Qosina | 11069 | |
| 1x Phosphate Buffer Solution (PBS) | Premade 1x PBS can be used in this protocol. | ||
| 2.0 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-283-LR | |
| 24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold | Electron Microscopy Sciences | 70165 | |
| 24 inch PVC Tubing with Luer Ends | Fisher Scientific | NC1376778 | |
| 400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| 95% Ethanol | MDS Warehouse | 2293-CASE | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) | VWR | 56616-031 | |
| Adjustable 237 ml Spray Bottle | VWR | 23609-182 | |
| Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Aluminum Foil | |||
| BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle | Sigma-Aldrich | Z192546 | |
| Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-5211 | Known as curved forceps in this protocol. |
| Camel Hair Brush | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 | |
| Carbon Dioxide Euthanasia Chamber | |||
| Carbon Dioxide Flow Meter | |||
| Carbon Dioxide Tank | |||
| Castaloy Prong Extension Clamps | Fisher Scientific | 05-769-7Q | |
| Cast-Iron L-shaped Base Support Stand | Fisher Scientific | 11-474-207 | |
| Cell Prolifer Program | Available to download: https://cellprofiler.org/releases | ||
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Colorfrost Microscope Slides Lavender | VWR | 10118-956 | |
| Computer | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| Distilled H20 | Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol. | ||
| Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 | Roboz Surgical Instrument | RS-4984 | Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing). |
| Electron Microscopy Grid Holder | Electron Microscopy Sciences | 71147-01 | |
| EPON 815 Resin | Electron Microscopy Sciences | 14910 | |
| Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye | Fisher Scientific | 22050460 | Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. |
| Epredia Mounting Media | Fisher Scientific | 22-110-610 | Use for mounting H&E slides. |
| Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source | Dolan-Jenner Industries | Mi-150 | Light source for dissecting microscope. |
| Fiji ImageJ Program | Available to download: https://imagej.net/downloads | ||
| Flexaframe Castaloy Hook Connector | Thermo Scientific | 14-666-18Q | |
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% | Electron Microscopy Sciences | 16537-05 | |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera | |||
| Laboratory Benchtop Shaker | Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room. | ||
| Laser Cryo Tag Labels | Electron Microscopy Sciences | 77564-05 | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Leica EM UC7Ultramicrotome | |||
| Leica Reichert Ultracut S Microtome | |||
| LifterSlips | Thermo Fisher Scientific | 22X22I24788001LS | Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE. |
| Mayer's Hematoxylin | VWR | 100504-406 | |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | Known as micro-dissecting scissors in protocol. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Mice | Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol. | ||
| Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | Known as curved scissors in this protocol. |
| Microsoft Excel | |||
| Microtube racks | |||
| Nikon A1RS Confocal Microscope | |||
| Normal Donkey Serum | SouthernBiotech | 0030-01 | |
| Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades | VWR | 21909-380 | |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Paraformaldehyde, 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Pencil | |||
| Petri Dish | VWR | 21909-380 | |
| Pipette Tips | |||
| Pipettes | |||
| Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody | Thermo Fisher Scientific | 402200 | |
| Propylene Oxide | Electron Microscopy Sciences | 20412 | |
| Razor Blade | VWR | 10040-386 | |
| Shallow Tray for Mouse Perfusions | |||
| Shandon Eosin Y Alcoholic | VWR | 89370-828 | |
| Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker | Staples | 642736 | |
| Slide Rack for Staining | Grainger | 49WF31 | |
| Squared Cover Glass Slips | Fisher Scientific | 12-541B | |
| Staining Dish with Cover | Grainger | 49WF30 | Need 15 for H&E staining procedure. |
| Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe | Thermo Scientific | S7510-50 | Use only the syringe barrel. |
| Timer | Fisher | 1464917 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| Vacuum Oven | |||
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Use for mounting RPE flat mounts. |
| Xylene | Fisher Scientific | 22050283 | |
| Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope | This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. | ||
| Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 |
References
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
- Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
- Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
- Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
- Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
- Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
- Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
- Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
- Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
- vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
- Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
- Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
- Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
- Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
- Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
- Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
- Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
- Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
- Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
- Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
- Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
- Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
- Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
- Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
- Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
- Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
- Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
- Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
