Artículo de método

Estudio de la diafonía entre células endoteliales adiposas y adipocitos en el tejido adiposo subcutáneo humano

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DOI:

10.3791/66608

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5 de abril de 2024

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1Leeds Institute of Cardiovascular and Metabolic Medicine, University of Leeds

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para aislar, cultivar y fenotipar células endoteliales microvasculares a partir de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVECs). Además, describimos un modelo experimental de diafonía entre hSATMVEC y adipocitos.

Resumen

Las células endoteliales microvasculares (MVEC, por sus siglas en inglés) tienen muchas funciones críticas, incluido el control del tono vascular, la regulación de la trombosis y la angiogénesis. La heterogeneidad significativa en el genotipo y fenotipo de las células endoteliales (CE) depende de su lecho vascular y del estado de la enfermedad del huésped. La capacidad de aislar las MVEC de los lechos vasculares específicos de los tejidos y de grupos individuales de pacientes ofrece la oportunidad de comparar directamente la función de las MVEC en diferentes estados de la enfermedad. Aquí, utilizando tejido adiposo subcutáneo (SAT) tomado en el momento de la inserción de dispositivos electrónicos implantables cardíacos (CIED), describimos un método para el aislamiento de una población pura de tejido adiposo subcutáneo humano funcional MVEC (hSATMVEC) y un modelo experimental de diafonía hSATMVEC-adipocitos.

Los hSATMVEC se aislaron después de la digestión enzimática del SAT por incubación con perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos anti-CD31 y paso a través de columnas magnéticas. Los hSATMVEC se cultivaron y se distribuyeron en placas recubiertas de gelatina. Los experimentos utilizaron células en los pasajes 2-4. Las células mantuvieron los rasgos clásicos de la morfología de la CE al menos hasta el pasaje 5. La evaluación por citometría de flujo mostró una pureza del 99,5% de hSATMVEC aislado, definido como CD31+/CD144+/CD45-. El tiempo de duplicación de la población de aproximadamente 57 h se aisló en hSATMVEC de los controles, y la proliferación activa se confirmó mediante un kit de imágenes de proliferación celular. La función aislada de hSATMVEC se evaluó utilizando su respuesta a la estimulación insulínica y el potencial formador de tubos angiogénicos. A continuación, establecimos un modelo de cocultivo de adipocitos subcutáneos hSATMVEC para estudiar la diafonía celular y demostramos un efecto posterior de hSATMVEC sobre la función de los adipocitos.

Los hSATMVEC se pueden aislar de los SAT tomados en el momento de la inserción de CIED y tienen una pureza suficiente para estudiar tanto el fenotipo experimental como la diafonía de adipocitos hSATMVEC.

Introducción

Las células endoteliales (CE) son células escamosas que recubren la superficie interna de la pared de los vasos sanguíneos como una monocapa. Tienen muchas funciones esenciales, como el control del tono vascular, la regulación de la trombosis, la modulación de la respuesta inflamatoria y la contribución a la angiogénesis1. Dada la importancia de las células endoteliales en la fisiología cardiometabólica, se utilizan con frecuencia de forma experimental para mejorar la comprensión de la fisiopatología y para examinar nuevos tratamientos farmacológicos para la enfermedad cardiometabólica.

Sin embargo, existe una enorme heterogeneidad en la morfología de las células endoteliales, su función, su expresión génica y su composición de antígenos en función del origen de su lecho vascular2. Mientras que las células endoteliales de las arterias grandes son las más adecuadas para los estudios de aterosclerosis, las células endoteliales de los vasos pequeños, conocidas como células endoteliales microvasculares (MVEC), son más adecuadas para los estudios de angiogénesis2. La comprensión de las bases moleculares de la heterogeneidad endotelial puede proporcionar información valiosa sobre las terapias específicas del lecho vascular. La función endotelial microvascular también difiere significativamente en numerosas enfermedades, como la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y las infecciones sistémicas 3,4. Por lo tanto, la capacidad de aislar células endoteliales de grupos definidos de pacientes permite la comparación directa de su función celular endotelial y la diafonía celular5.

En este artículo, describimos un método novedoso para aislar MVECs humanos de tejido adiposo subcutáneo (hSATMVEC) tomado en el momento de la inserción del dispositivo electrónico implantable cardíaco (CIED). Los hSATMVEC aislados después de la digestión enzimática del tejido adiposo subcutáneo (SAT) se cultivaron y se colocaron en placas recubiertas de gelatina. A continuación, describimos una serie de ensayos de fenotipado que se han aplicado con éxito a los hSATMVEC con el fin de validar su fenotipo y demostrar su uso en ensayos rutinarios de células endoteliales. Finalmente, describimos una aplicación de hSATMVECs en un modelo experimental de diafonía hSATMVECs-adipocitos.

Protocolo

Las muestras de tejido humano utilizadas en la técnica descrita se han tomado de pacientes sometidos a la inserción de CIEDs según la práctica clínica habitual en el Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Reino Unido). El protocolo del estudio, junto con el resto de la documentación, fue aprobado por el comité de ética local (11/YH/0291) antes de la inscripción de los participantes. El estudio se llevó a cabo de conformidad con los principios de la Declaración de Helsinki.

1. Población de pacientes

  1. Obtener tejido adiposo subcutáneo (SAT) fresco durante la implantación de CIED a partir de SAT que recubre el músculo pectoral mayor.
  2. Aísle las muestras de SAT en condiciones estériles y manipule las muestras de tejidos después de la recolección en una campana de flujo laminar bajo estrictas condiciones asépticas para evitar la contaminación bacteriana.

2. Aislamiento y cultivo de células endoteliales

NOTA: En la Figura 1 se muestra un esquema para el aislamiento hSATMVEC.

  1. Para el aislamiento de hSATMVEC, utilice un mínimo de 250 mg de tejido adiposo subcutáneo (SAT) fresco obtenido durante la implantación de CIED a partir de SAT que recubre el músculo pectoral mayor (ver Figura 1).
    NOTA: El uso de grandes cantidades de SAT fresco aumenta el rendimiento de hSATMVEC durante el aislamiento y tiene la mayor probabilidad de éxito en el aislamiento y el cultivo de hSATMVEC.
  2. Coloque inmediatamente el SAT en una solución de almacenamiento de tejidos de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) helada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml antes de transferirlo al laboratorio.
    NOTA: Para tener la mayor probabilidad de éxito en el aislamiento, el aislamiento de hSATMVEC debe realizarse lo antes posible. Sin embargo, el SAT puede almacenarse hasta 24 horas en hielo antes del aislamiento si es necesario.
  3. Prepare una solución de trabajo de colagenasa/dispasa de 1 mg/mL de la siguiente manera.
    1. En primer lugar, reconstituya 500 mg de polvo liofilizado de colagenasa/dispasa en 5 mL de agua estéril para formar una solución madre de colagenasa/dispasa con una concentración de 100 mg/mL.
    2. Para cada aislamiento de hSATMVEC, diluya 100 μL de solución madre de colagenasa/dispasa en 10 mL de solución fría de sal equilibrada de Hanks para obtener una solución de trabajo de 1 mg/mL.
  4. En una cabina de flujo laminar, use dos bisturíes para picar los tejidos en ~ 1 mm3 piezas en 500 μL de solución de colagenasa/dispasa de 1 mg/mL en la tapa de una placa de Petri, triture y transfiera a un tubo de centrífuga limpio de 50 mL.
  5. Lave la tapa de la placa de Petri con 4,5 ml de solución fresca de colagenasa/dispasa de 1 mg/ml y añádala al tubo de centrífuga de 50 ml. Dejar digerir durante 30 min a 37 °C en un rotador de tubos a 20 rpm. Detenga el proceso de digestión agregando 10 mL de medio de crecimiento EC completo MV.
  6. Triturar la mezcla digerida y pasarla por un tamiz de celdas de 70 μm. Enjuague el tamiz con 10 mL de tampón de solución salina y albúmina sérica bovina (PBS-BSA) tamponado con fosfato al 0,5%. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Repita este paso con otros 5 mL de PBS-BSA al 0,5%.
  7. Luego, elimine las células muertas con un kit de eliminación de células muertas. Para ello, incube el pellet de células en 200 μL de perlas de eliminación de células muertas (vórtice antes de su uso) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  8. Conecte una columna LS con un filtro de 30 μm al imán separador y coloque un tubo de centrífuga de 15 mL debajo. Lave la columna magnética una vez con 1 mL de tampón de unión para la eliminación de células muertas antes de agregar la suspensión de muestra/perla y deje que pase pasivamente bajo la gravedad.
  9. A continuación, lave la columna añadiendo 0,5 ml de tampón de unión y deje que pase pasivamente a través de la columna. Repita este lavado cuatro veces.
  10. Recoja el eluido como una fracción de célula viva, centrifugue las células a 300 x g a RT durante 10 minutos y, a continuación, lave y vuelva a suspender el pellet resultante en 400 μL de PBS-BSA al 0,5%.
  11. Añadir 20 μL de perlas magnéticas recubiertas de anti-CD31 a las células suspendidas e incubar durante 20 min a 4 °C. Después de la incubación, centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min en RT y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en 500 μL de PBS-BSA al 0,5%.
  12. Conecte una columna MS con un filtro de 30 μm al imán separador y coloque un tubo de centrífuga de 15 ml debajo. Imprime la columna con 500 μL de PBS-BSA al 0,5%. Repita este paso dos veces.
  13. Agregue la suspensión de células y microperlas y deje que pase bajo la gravedad. Lave la columna con 500 μL de PBS-BSA al 0,5% tres veces. El flujo a través del tubo de centrífuga debajo de la columna contiene la fracción CD31-.
  14. Para recoger la fracción CD31+ (es decir, la fracción que contiene hSATMVECs), retire la columna MS del imán separador y colóquela en un tubo de centrífuga nuevo de 15 mL. Agregue 1 mL de PBS-BSA al 0,5% y, con una acción suave, aplique el émbolo de columna para liberar los hSATMVEC capturados.
  15. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en 1 mL de medio de crecimiento EC completo MV y divida la solución de 1 mL de celda entre uno o dos pocillos (dependiendo del tamaño del pellet) de una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina al 2% (Paso 0).
    NOTA: No se preocupe si hay pocas células adherentes en los primeros días después del aislamiento.
  16. Cambie los medios cada 3 días. Cultivo de células a 37 °C con 5% de CO2. Una vez que las células aisladas alcanzan ~80% de confluencia (2-4 semanas), páselas a un solo pocillo de una placa de seis pocillos (pasaje 1).
    NOTA: Los pasajes subsiguientes pueden re-platear las células de un pocillo donante confluente a los pocillos receptores. Los experimentos se realizaron en células de la generación de paso 2-4 después de que las células hubieran demostrado una pureza del >99% mediante citometría de flujo (ver sección 3). Las células mantuvieron la morfología endotelial típica hasta al menos el pasaje 5.

3. Citometría de flujo

  1. Antes de la citometría de flujo, se deben revisar visualmente los hSATMVEC para asegurarse de que parecían confluentes y morfológicamente representativos. Realice una evaluación citométrica de flujo de hSATMVEC en el paso 2, utilizando celdas de un solo pocillo de una placa de 6 pocillos.
  2. Lave las células dos veces con PBS añadiendo bien 500 μL de PBS y aspirando cada vez. A continuación, añadir 300 μL/pocillo de solución tibia de tripsina/EDTA (0,25%). Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 min.
  3. Una vez desmontado, neutralizar la solución de tripsina/EDTA con 700 μL de medio de crecimiento EC completo MV y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  4. Centrifugar la suspensión de la célula a 400 x g durante 8 min en RT. Deseche el sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en un tampón MACS de 1 mL y divídalo entre dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetados como control sin tinción y muestra teñida (500 μL por pocillo).
  5. Añada 500 μL adicionales de tampón MACS a cada tubo de microcentrífuga, antes de volver a centrifugar a 400 x g durante 8 min a RT.
  6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 100 μL de tampón MACS para el control sin tinción y 100 μL de cóctel de tinción (Tabla suplementaria 1) para la muestra teñida. Teñir las células con CD45-FITC (el marcador panleucocitario), así como con CD144-PE y CD31-PerCP (que son expresados por las células endoteliales).
  7. Agitar brevemente las células suspendidas durante 5 s, luego incubar a 4 °C durante 10 min. A continuación, añada 1 mL de tampón MACS a cada tubo, centrifugue de nuevo a 400 x g durante 8 min en RT y deseche el sobrenadante.
  8. Por último, vuelva a suspender el pellet de la célula en 500 μL de tampón MACS y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque el tubo etiquetado en una caja de hielo cubierta lista para su análisis.
    NOTA: Todos los análisis de citometría de flujo incluidos se realizaron en un sistema de citómetro de flujo Beckman Coulter Cytoflex de 4 láseres (utilizando solo el láser de excitación de 488 nm).
  9. Configure la longitud de onda de emisión máxima y el filtro para cada fluoroccoma de la siguiente manera: CD45-FITC - emisión máxima 520 nm, filtro 525/50; CD144-PE - emisión máxima 578 nm, filtro 585/40; CD31-PerCP - emisión máxima 675 nm, filtro 655-730.
  10. Como se ilustra en la Figura 2, registre los datos de 10.000 células por muestra en una puerta singlete (P2). Compruebe que P1 rodea un grupo de células principal y que la mayoría de estas células se encuentran en la puerta singlete de P2. Asegúrese de que el control sin tinción tenga un mínimo de células CD45-CD144+CD31+ como porcentaje de singletes.
  11. Registre el porcentaje de singletes de células CD45-CD144+CD31+ en la muestra teñida.

4. Tiempo de duplicación de células endoteliales y proliferación celular (Figura 3)

  1. En los pasajes 2 y 3, cuente el número de hSATMVEC viables para cada muestra utilizando hemocitometría. Registre la fecha y la hora de cada recuento de células.
  2. Calcule el número de duplicaciones de población entre estos puntos de acuerdo con la ecuación: tiempo de duplicación = (duración x log(2))/(log (concentración final)-log (concentración inicial)).
    NOTA: Una calculadora en línea está disponible en https://doubling-time.com/compute.php.
  3. Evaluar la proliferación de hSATMVECs utilizando un kit de imágenes de proliferación celular disponible en el mercado. Siembre hSATMVECs a una densidad de 20.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos y déjelas toda la noche en medios de crecimiento de EC completos MV para que se recuperen.
  4. Al día siguiente, añadir 5-Ethinil-2'-desoxiuridina (EdU) a cada pocillo diluido en un medio de crecimiento EC completo MV a una concentración final de 10 μM. Incubar a 37 °C (5% CO2) durante 2 h.
  5. Retire los medios que contienen EdU y lave cada pocillo dos veces con PBS. Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 15 min en RT. Lave cada pocillo dos veces con PBS y agregue 500 μL de Triton X-100 al 0,5% en tampón de solución salina (TBS) tamponado por tris. Dejar incubar a RT durante 20 min.
    NOTA: Esto permeabiliza la membrana celular, permitiendo la entrada de azida marcada con Alexa fluor 488 en la célula.
  6. Prepare el cóctel de azida con Alexa fluor 488 marcado según las instrucciones del fabricante, dependiendo del número de pocillos (ver6). Lave cada pocillo dos veces con PBS antes de agregar 100 μL de cóctel de azida marcado con Alexa fluor 488 e incube durante 30 minutos a RT protegido de la luz.
    NOTA: El cóctel de azida con etiqueta Alexa fluor 488 reacciona con el EdU en una reacción de clic.
  7. Retire el cóctel de azida con etiqueta Alexa fluor 488 y lávelo dos veces con PBS. Añadir 500 μL de yoduro de propidio por pocillo e incubar durante 20 min a RT.
    NOTA: Este paso contratiñe los núcleos (tanto proliferantes como no proliferantes) de rojo.
    Retire el yoduro de propidio, lávese dos veces con PBS y deje cada pocillo en 500 μL de PBS para la obtención de imágenes.
  8. Visualice cada pozo en 4 campos de alta potencia con un aumento de 10x, con excitación/emisión de 495/519 nm para la azida de 488 nm (ver Figura 3C).
    NOTA: Las imágenes de las figuras se capturaron utilizando un sistema de análisis de células vivas con un aumento de 10x con un tiempo de exposición de 800 ms.
  9. Cuente el número de células en proliferación (verde) y exprese como porcentaje (%) del total de células dentro de cada campo de alta potencia (promedio de 4 regiones por pocillo).

5. Formación del tubo de células endoteliales

  1. Leave Matrigel (matriz de membrana basal; BMM) para descongelar durante la noche sobre hielo. Al día siguiente, con la placa en hielo, agregue 160 μL de BMM a cada pocillo de una placa de 24 pocillos según sea necesario. Incline la placa para obtener una cobertura completa de cada pocillo con BMM. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para que se asiente mientras prepara las celdas.
  2. Siembre hSATMVECs a 100.000 células (en 1 mL de medio) por pocillo. Pipetear en el lado del pocillo y tener cuidado de pipetear lentamente para evitar que la matriz se desprenda. Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h.
    NOTA: En este punto, la placa está lista para ser fotografiada. Los resultados y las figuras a continuación de las imágenes de fase en el sistema de análisis de células vivas con un aumento de 10x se utilizaron en 5 áreas de pozos diferentes (ver Figura 3D).
  3. Cuente el número de tubos enteros en cada campo de alta potencia y calcule un valor promedio para cada muestra.

6. Estimulación insulínica de hSATMVEC

  1. Cultivo hSATMVEC en una placa de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2. Una vez confluente, retire el medio de crecimiento de células endoteliales completo MV y lávese dos veces con PBS.
  2. Añadir 500 μL de medios de inanición sérica (medios de crecimiento de células endoteliales MV sin suplementos) a cada pocillo y dejar incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h. Durante este tiempo, prepare 500 μL de alícuotas de concentraciones crecientes de insulina (0-150 μM) preparadas en medios de inanición sérica.
  3. Después de pasar hambre de suero durante 4 h, retire los medios de los pocillos, agregue 1 ml de medios que contengan insulina (con concentraciones crecientes) a cada pocillo e incube durante 10 minutos a 37 °C con 5% de CO2.
  4. Lavar dos veces con PBS frío antes de añadir 100 μL de tampón de lisis de proteínas que contiene inhibidores de la proteasa y la fosfatasa para lisar las células en busca de proteínas. Cuantifique la proteína mediante el ensayo BCA.
    NOTA: En el experimento que se describe a continuación, se incubaron lisados celulares durante 30 minutos en un baño de hielo y se centrifugaron a 20.000 x g durante 15 minutos. Antes de la electroforesis, las muestras de proteínas se hirvieron para desnaturalizar las proteínas a 95 °C durante 5 min. Las proteínas se resolvieron en un gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. El análisis de inmunotransferencia se realizó de acuerdo con los protocolos estándar utilizando anticuerpos fosfoproteicos relevantes y anticuerpos proteicos totales (según las instrucciones del fabricante). Se utilizó un anticuerpo secundario Ig/HRP adecuado para detectar el anticuerpo primario (de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Los niveles de proteína se cuantificaron mediante densitometría basada en la intensidad de las bandas de cada muestra. ß-actina se utilizó como control de carga cuando fue apropiado.

7. Configuración del cocultivo de adipocitos hSATMVEC (Figura 4)

NOTA: En los resultados a continuación, se utilizaron preadipocitos subcutáneos blancos humanos disponibles comercialmente en el pasaje 2 de un solo donante caucásico masculino en todos los ensayos de adipocitos. Inicialmente, los preadipocitos se expandieron desde el vial suministrado por el proveedor (pasaje 0) a doce crioviales que contenían medios de congelación crio-SFM (pasaje 1).

  1. Cada placa de cocultivo de 24 pocillos requiere un criovial de preadipocitos (pasaje 1). Descongele rápidamente cada vial y placa en un matraz T75 que contenga 12-15 mL de medio PGM-2 tibio (que contenga 10% de FBS, 30 μg/mL de L-glutamina y 15 ng/mL de GA-1000 SingleQuots). Cambiar de medio cada 3 días hasta que el 90% confluya.
  2. Una vez confluente al 90%, lavar los preadipocitos subcutáneos blancos humanos con PBS y luego añadir 1 mL de solución de tripsina/EDTA (0,25%). Dejar actuar en RT durante 2 min y confirmar el desprendimiento con microscopía óptica. Agregue 23 mL de medio PGM-2 para neutralizar la tripsina/EDTA y haga una solución suspendida de preadipocitos de 24 mL.
  3. Coloque 1 mL de solución de preadipocitos blancos subcutáneos humanos en suspensión en cada pocillo de una placa complementaria de cocultivo de 24 pocillos y crezca hasta la confluencia (generalmente 2-3 días).
  4. Mientras crece hasta la confluencia, prepare los medios de diferenciación de preadipocitos (PDM). Para preparar PDM, haga un stock de PDM 2x agregando una mezcla patentada de insulina, dexametasona, indometacina e isobutil-metilxantina a los medios base de PGM. Diluya 2x PDM en una proporción de 1:1 con PGM para hacer 1x PDM.
  5. Una vez confluentes, diferencie los preadipocitos blancos subcutáneos humanos cambiando el medio a 1 mL de 1x medio PDM en cada pocillo (Día 0). Deje incubar los preadipocitos blancos subcutáneos humanos a 37 °C con 5% de CO2 durante 10 días (sin cambios de medio) para que se diferencien completamente. Monitorice la diferenciación mediante microscopía de fase luminosa (véase la figura 4B).
    NOTA: Los adipocitos diferenciados no se pueden pasar y se pueden usar para ensayos desde el día 10 hasta el día 12. La diferenciación de los adipocitos puede medirse mediante la amplificación del ARNm de leptina, adiponectina y PPAR-γ.
  6. En el día 6 de diferenciación, se siembran hSATMVECs a una densidad de 5 x 104 células por inserto en 500 μL de medios de crecimiento EC completos MV en insertos transpocillos (membrana de 0,4 μM). Coloque los insertos transwell en un pocillo con 500 μL de medio de crecimiento EC completo MV () y crezca hasta la confluencia a 37 °C en 5% de CO2.
  7. En el día 10, cuando los adipocitos estén completamente diferenciados, extraiga la mitad del medio PDM de cada pocillo y transfiera los insertos transpocillos que contienen hSATMVEC confluente en su propio medio (ECGM-MV) a cada pocillo (ver Figura 4A).
  8. Dejar las células en cocultivo durante 24 horas antes de retirar los insertos transpocillos y realizar ensayos que evalúen la función de los adipocitos.
    NOTA: En este momento, los adipocitos también se pueden lisar para el aislamiento de proteínas o ARN si es necesario.

8. Absorción de glucosa por adipocitos 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-desoxiglucosa (2-NBD)-glucosa

  1. Después de 24 h en cocultivo, retire los insertos celulares que contengan hSATMVEC. A continuación, añada 2-NBD-glucosa al medio en cada pocillo para lograr una concentración final de 20 μM. Proteger de la luz e incubar durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Lavar las células dos veces en PBS y fijar los adipocitos con 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min en RT. Lavar las células tres veces en PBS antes de dejar en 100 μL de PBS.
    NOTA: En este punto, los adipocitos están listos para ser fotografiados. En las figuras incluidas, se obtuvieron imágenes de fase y luz verde (excitación 440-480 nm/emisión 504-544 nm) en el sistema de análisis de células vivas con un aumento de 10x en cuatro campos de alta potencia (véase la Figura 4C).
  3. Cuantifique el nivel de absorción de glucosa cuantificando el porcentaje de verde del área total utilizando umbrales en ImageJ (o cualquier otro paquete de software similar).

Resultados

Pureza y fenotipo de hSATMVEC
El 99,5% de los hSATMVEC aislados de los pacientes control (es decir, aquellas personas sin antecedentes de enfermedad cardiometabólica) tenían un 99,5% de CD31+CD144+CD45- en la citometría de flujo (Figura 2). El hSATMVEC aislado tenía una morfología similar a un adoquín típica de las CE (Figura 3A). Los hSATMVEC tuvieron un tiempo medio de duplicación poblacional de 56,6 h ± 8,1 h (media ± SEM, n = 10) (Figura 3B), y la replicación activa del ADN en los hSATMVEC se confirmó utilizando un kit de imágenes de proliferación celular (Figura 3C).

hSATMVEC se comportó como MVECs en funcionamiento y formó tubos en Matrigel (Figura 3D). La expresión relativa de proteínas clave involucradas en la vía de señalización de insulina Akt-eNOS se muestra en la Figura 3E. Tanto los eNOs como los Akt demostraron aumentos en la fosforilación inducida por la insulina, representada como la relación entre la proteína fosforilada y la proteína total normalizada a ß-actina (Figura 3E).

cocultivo de adipocitos hSATMVEC
En la Figura 4A se puede ver un modelo ilustrativo del cocultivo de adipocitos hSATMVEC. A medida que los preadipocitos blancos subcutáneos humanos se diferencian, se notará el desarrollo de vacuolas lipídicas (Figura 4B), que se pueden cuantificar mediante la tinción de Oil Red O (Figura 4B).

En la Figura 4C se muestran imágenes ilustrativas de contraste de fase y fluorescencia (excitación 440-480 nm/emisión 504-544 nm) de adipocitos diferenciados después de 30 min de incubación con 20 μM de glucosa 2-NBD. La absorción de glucosa se puede cuantificar midiendo el área verde como porcentaje del área total de las células.

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Figura 1: Esquema que demuestra la recolección y el procesamiento de hSATMVEC Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Resultado típico del análisis de citometría de flujo de hSATMVECs cultivados. (A) Diagrama de dispersión del área de dispersión lateral (SSC-A) y el área de dispersión frontal (FSC-A) que muestra la compuerta (recuadro rojo) de hSATMVECs cultivados alrededor de una densidad de población celular específica. (B) Diagrama de dispersión de la anchura de dispersión directa (FSC-Width) y FSC-A que muestra la compuerta (recuadro rojo) de los hSATMVEC cultivados en torno a una densidad de población celular específica. (C) Histograma que muestra la fluorescencia de las células compuertas a CD45-FITC. (D) Diagrama de dispersión de la intensidad de fluorescencia de CD144-PE (eje x) y CD31-PerCP (eje y). (E) Histograma que muestra la fluorescencia de las células compuertas a CD144-PE. (F) Histograma que muestra la fluorescencia de las células cerradas a CD31-PerCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Fenotipo de hSATMVEC. (A) Imagen de microscopía óptica de hSATMVEC cerca de la confluencia que muestra una apariencia de adoquín. (B) Tiempo de duplicación de hSATMVEC - Microscopía óptica de HATEC tomada con 24 h de diferencia, lo que demuestra el grado de proliferación celular. (C) Proliferación de hSATMVEC. Microscopía de fluorescencia de hSATMVEC con yoduro de propidio y EdU/Alexa-fluor 488 de sujetos control. (D) Formación de tubos hSATMVEC a partir de sujetos de control (imágenes tomadas con un aumento de 4x). (E) Estimulación insulínica de los HATECs: muestra la expresión relativa de Akt fosforilada (serina 473) a Akt total (panel izquierdo) eNOS fosforilada (serina 1177) a eNOS total (panel derecho) a concentraciones crecientes de insulina con transferencias occidentales ilustrativas por debajo de estandarizadas a B-actina. Los datos se muestran como media ± SEM. Los tamaños de muestra se encuentran debajo de cada panel. Abreviaturas: 5-Ethinil-2'-desoxiuridina (EdU), células endoteliales microvasculares de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVEC), error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Cocultivo de adipocitos hSATMVEC. (A) Imagen esquemática del cocultivo de adipocitos hSATMVEC. (B) Diferenciación de adipocitos. El panel izquierdo muestra los preadipocitos en el día 0 y el panel derecho muestra los adipocitos diferenciados en el día 10 después de la adición de PDM. La figura inferior muestra la cantidad de lípidos almacenados en los adipocitos y preadipocitos teñidos con Oil Red O. (C) Ensayo de captación de glucosa. El panel izquierdo muestra las imágenes de fase de los adipocitos después del cocultivo y la incubación con 20 μM de glucosa 2-NBD durante 30 min. El panel de la derecha muestra imágenes verdes a partir de las cuales se puede cuantificar la absorción de glucosa (como % verde del área total). Los datos se muestran como medias ± SEM. Abreviaturas: Día 10 (D10), células endoteliales microvasculares de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVEC), medios de diferenciación preadipocitaria (PDM) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Cóctel de tinción para citometría de flujo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este estudio se describe una técnica de aislamiento de hSATMVEC tomada de SAT durante la implantación rutinaria de CIEDs. Demostramos que el hSATMVEC aislado tiene una alta pureza, expresa las proteínas transmembrana específicas de la CE CD144 y CD31, y no muestra una expresión significativa del leucocitario CD45. A continuación, demostramos que, de forma reproducible y fiable, los hSATMVEC aislados proliferan y pueden utilizarse experimentalmente para estudiar la maquinaria intracelular implicada en la señalización de la insulina y la angiogénesis. Además de poder cultivarlos de forma aislada, también se pueden utilizar en cocultivo para estudiar la diafonía entre hSATMVEC y adipocitos.

Las células endoteliales utilizadas en la investigación básica y traslacional suelen provenir de grandes vasos, como la aorta y la vena umbilical humana, o microvasculatura. Estas fuentes tienen sus propias limitacionesrespectivas 7,8; Las células endoteliales de grandes vasos son de difícil acceso (en el caso del tejido aórtico) o se derivan de tejido neonatal con una fisiología y exposición ambiental potencialmente diferentes9. El uso de células endoteliales aisladas de tejido tomado durante la implantación de CIED permite la investigación y experimentación de la fisiología celular dentro de grupos específicos de pacientes del mundo real. Los CIED se implantan para una variedad de indicaciones, incluso en pacientes con bradiarritmias, insuficiencia cardíaca y prevención primaria y secundaria de taquiarritmias ventriculares10. Estos pacientes suelen tener múltiples comorbilidades, como diabetes, obesidad y enfermedad de las arterias coronarias, que son uno de los principales focos mundiales de la investigación cardiovascular 11,12,13. Además, si bien los datos ilustrativos de este documento se refieren a pacientes control, hemos aplicado estas técnicas para aislar y estudiar SATMVEC de una variedad de pacientes, incluidos aquellos con insuficiencia cardíaca avanzada y/o diabetes mellitus tipo 2.

No es raro que nos encontremos con problemas con bajos rendimientos de hSATMVEC después de un intento de aislamiento celular. Este riesgo puede reducirse significativamente mediante el uso de un mayor volumen inicial de SAT para aislar hSATMVEC. Además, esto lo encontramos con mayor frecuencia en el SAT de personas con enfermedades cardiometabólicas y, en particular, con diabetes.

Una limitación de esta técnica es que el hSATMVEC aislado solo puede someterse a un número limitado de pasajes. En nuestra experiencia después del paso 5, independientemente del fenotipo del paciente, la proliferación de hSATMVEC se ralentiza significativamente. Además, los hSATMVEC aislados mediante esta técnica no proliferan bien cuando están demasiado escasamente poblados; por lo tanto, recomendamos no pasar hSATMVEC en una proporción superior a 1:6. como se menciona en la página 1. Hemos descongelado y reanimado con éxito hSATMVEC almacenado en nitrógeno líquido durante un máximo de 4 años y, según nuestra experiencia, la posibilidad de reanimación es mayor cuando se criopreserva a un número de paso más bajo (normalmente criopreservamos hSATMVEC en el paso 2).

El tejido tomado en el momento de la inserción del CIED está disponible libremente y puede extraerse sin detrimento para el paciente. Por lo tanto, una fuente de células endoteliales de fácil acceso y relativamente no invasiva de estos grupos de pacientes es de gran beneficio para realizar investigaciones específicas. Si bien las imágenes representativas de este trabajo se derivan de pacientes "control" (es decir, pacientes sin diagnóstico de insuficiencia cardíaca o diabetes, aunque con indicación de implante de CIED), hemos aislado, cultivado y cocultivado con éxito SATMVEC de pacientes con insuficiencia cardíaca, diabetes y una combinación de estas patologías. Además, estas técnicas también se pueden aplicar a otros lechos microvasculares, incluido el músculo esquelético, y actualmente estamos optimizando un modelo de diafonía MVEC-miocitos del músculo esquelético.

Los hSATMVEC pueden aislarse a partir de tejido humano tomado en el momento de la inserción de CIED y tienen una pureza suficiente para ser utilizados experimentalmente en el estudio de la disfunción microvascular y la diafonía entre células endoteliales y adipocitos en personas con y sin enfermedad cardiometabólica.

Divulgaciones

SS ha recibido apoyo no financiero, honorarios de los ponentes y honorarios de AstraZeneca. RC ha recibido honorarios de orador de Janssen Oncology. La OIB ha recibido honorarios de los ponentes de Novartis.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos al Departamento de Bioimagen de la Facultad de Ciencias Biológicas (Universidad de Leeds, Reino Unido) por el uso de la instalación de citometría de flujo, que contó con el apoyo de una subvención del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC BB/R000352/1). SS contó con el apoyo de una beca de formación en investigación clínica de la Fundación Británica del Corazón (FS/CRTF/20/24071). CL contó con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación Británica del Corazón (FS/19/59/34896). LDR contó con el apoyo de la beca Diabetes UK RD Lawrence Fellowship (16/0005382). RMC contó con el apoyo de una beca de investigación clínica intermedia de la Fundación Británica del Corazón (FS/12/80/29821). MTK es profesor de Investigación Cardiovascular y de la Diabetes de la Fundación Británica del Corazón (CH/13/1/30086) y tiene una beca del programa de la Fundación Británica del Corazón (RG/F/22/110076)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Incubadora de CO2 de 170 LGS Biotech170G-014
2-NBDG (2-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-desoxiglucosa)InvitrogenN13195
4% PARAFIX fijador histológico tamponadoVWR ChemicalsPRC/R/38/1
Akt (tAkt) Rabbit  1:1000Tecnología de señalización celular9272
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Naranja, 50/paqueteMedisave393230
Solución de albúmina sérica bovina, 7.5%MerckA8412-100ML
CD144 ( VE-Cadherin) Anticuerpo, antihumano, PE, REAfinityMiltenyi Biotec130-118-495
CD31 Anticuerpo, antihumano, PerCP-Vio 700, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-811
CD31 MicroBead Kit, humano, 1 kitMiltenyi Biotec130-091-935
CD45 Anticuerpo, antihumano, FITC, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-769
Extracción de células CentrífugaFNN0011Buffer Invitrogen
5804R Eppendorf5805000060
Click-iT EdU Kit de proliferación celular para imágenes, Alexa Fluor 488 coloranteInvitrogenC10337Kit de imágenes de proliferación celular
Colagenasa/Dispasa, 500 mgRoche/Merck11097113001
Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basalCorning 354230Membrana basal Matrix
Corning 100 mm TC-tratado con TC Plato de cultivoCorning 
Costar 24-pocillos Placas de pocillos múltiples transparentes tratadas con TC, envueltas individualmente,Corning estériles 3526
Costar 6-pocillos Placas transparentes de pocillos múltiples tratadas con TC, envueltas individualmente,Corning estériles 3516
CytoFLEX S – 4 Citómetro de flujo láserBeckman
Kit de eliminación de células muertasMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco′ s Solución salina tamponada con fosfatoMerckD8537-500ML
EASYstrainer Tamiz celular para tubos de 50 mL, 70 y micro; m mesh, azul, estéril, 50/pkGreiner Bio-One542070
Medio de crecimiento de células endoteliales MVPromoCellC-22020
Eppendorf Safe-Lock microtubos de ensayoMerckEP0030120094
solución de ácido etilendiaminotetraacéticoMerck E8008-100ML
Falcon 24 Pocillos Placa de soporte permeable de poliestireno celular tratado con TC, con tapa, Estéril, 1/Paquete, 50/CajaAppleton WoodsCF537
Falcon Soporte permeable para placa de 24 pocillos con 0.4 y micro; m Membrana de PET Transparente, Estéril, 1/Paquete, 48/CajaAppleton WoodsCF521
Medio de congelación Cryo-SFMPromoCellC-29912
Solución de gelatina, 2% en aguaMerckG1393-100ML
Gibco Antibiótico-Antimicótico (100x), 100mLFisher Scientific11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), sin rojo fenolFisher Scientific
Hanks′ Solución salina equilibradaMerckH6648-500ML
Células preadipocitarias subcutáneas humanasLonzaPT-5020
Incucyte ZOOMEssen BioScienceSistema de análisis de células vivas
Solución de insulina humanaMerckI9278-5ML
LS Columnas, 25/pkMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MACS Solución de almacenamiento de tejidosMiltenyi Biotec130-100-008
MACSmix Rotador de tubosMiltenyi Biotec130-090-753Rotador de tubos
MS Columnas, 25/pkMiltenyi Biotec130-042-201
NuPAGE 4– 12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOX
Separador OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109
PGM-2 Medio de crecimiento preadipocito-2 BulletKitLonzaPT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000Tecnología de señalización celular9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  1:1000Tecnologíade señalización celular4060
Filtros de pre-separación 30 µ m, 50/pkMiltenyi Biotec130-041-407
Yoduro de propidio (PI)/solución de tinción de RNasaTecnología de señalización celular4087
Separador QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Bisturí Desechable Estéril Estilo 10VWRI501
Tubo con tapón de rosca, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, con impresiónSarstetd62.554.502
Tubo con tapón de rosca, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, con impresiónSarstedt62.547.254
Tubo con tapón de rosca, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, con impresiónSarstetd62.547.254
Total eNOS Mouse 1:1000BD Biosciences
Triton X-100, BioUltra, para biología molecularMerck93443-500ML
β-Actina (C4) Ratón 1:5000Santa Cruz Biotechnology  SC-47778
de 43016712563029 610297

Referencias

  1. Bierhansl, L., et al. Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease. Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).
  2. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).
  3. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  4. Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction. Cells. 10 (9), 2315(2021).
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  6. Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf (2024).
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  8. Ades, E. W., et al. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99 (6), 683-690 (1992).
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  10. Brignole, M., et al. 213 ESC Guidelines on cardiac pacing and cardiac resynchronization therapy. Eur Heart J. 34 (29), 2281-2329 (2013).
  11. Greenspon, A. J., et al. Trends in permanent pacemaker implantation in the United States from 1993 to 2009: Increasing complexity of patients and procedures. J Am Coll Cardiol. 60 (16), 1540-1545 (2012).
  12. Prioritized Research Agenda for Prevention and Control of Noncommunicable Diseases. Mendis, S. A., Alwan, A. , World Health Organization. Geneva. (2011).
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