Name: Electron Cryotomography de las células bacterianas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprende criotomografía electrónica para visualizar la ultraestructura celular bacteriana con resolución macromolecular. Este método utiliza congelación por inmersión y alta presión para obtener imágenes 3D de alta calidad.

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Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 y P01 GM066521 a GJJ, así como el Instituto Médico Howard Hughes, del Instituto Beckman en el Caltech, y regalos a Caltech de la Gordon and Betty Moore Foundation y el Instituto Agouron. MSL es apoyado por el NIH subvención 2R37-A1041239-06A1 a Pamela S. Björkman. Leica Microsystems Inc. amabilidad de siempre de contenido de vídeo de la colección cryosection. Los resultados representante de Treponema primitia fueron recogidos y tratados por Gavin E. Murphy, y publicado en Microbiología Molecular, con el título &quot;ultraestructuras Novela de Treponema primitia y sus implicaciones para la movilidad&quot;. (Murphy, G. et al., Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

Se demuestra en este artículo de vídeo de cómo hacer ECT de las células bacterianas. Limitado por el espacio y el tiempo, que sólo muestran el protocolo general. Más detalles se pueden encontrar en los periódicos, información en línea o de otra índole proporcionada por los fabricantes de los equipos y desarrolladores de software y de los grupos de investigación de la TEC. Dependiendo de las especies bacterianas estudiadas, el equipo utilizado y el interés estructural de las células, el protocolo y los parámetros experimentales deben ser probados y optimizados.

<table><tbody><tr><td>Polilisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>solución al 0,1%</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución coloidal de oro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Papel de filtro Nr 1</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, PM 39000</td></tr><tr><td>Plancheta de latón con cúpula</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelador de alta presión Bal-Tec HPm 010</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Criomicrotomo ultrasónico UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trinchado criogénico de diamante 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionizador de línea estática II</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transportador criogénico CX100</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estación de carga MSH</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Ti E/B</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Personalizado</td></tr><tr><td>Portamuestras para microscopía criogénica</td><td>FEI</td><td></td><td>Personalizado</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Con UltraCam de Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electron cryotomography de las células bacterianas

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Aunque mucho se sabe sobre el metabolismo básico de las células bacterianas, muchas de las preguntas fundamentales siguen sin respuesta es sorprendente, como por ejemplo la forma en que generan y mantienen las formas específicas de la célula, establecer la polaridad, segregar sus genomas, y se dividen. A fin de comprender estos fenómenos, tecnologías de la imagen es necesario que la brecha entre la resolución de la microscopía de fluorescencia de luz y de mayor resolución de métodos como la cristalografía de rayos X y espectroscopía de RMN. Electron cryotomography (ECT) es una tecnología emergente que hace precisamente esto, lo que permite la ultraestructura de las células para ser visualizados en un estado casi nativo, en tres dimensiones (3D), con &quot;macromoleculares&quot; resolución (~ 4 Nm). 1, 2 A ECT, las células son expuestas en un vítreo, &quot;congelado-hidratado&quot; estado en un microscopio electrónico de transmisión de crio (cryoTEM) a baja temperatura (&lt;180 ° C). Para delgado las células (hasta ~ 500 nm de espesor 3), las células intactas son de inmersión congelados dentro de los medios de comunicación a través de las redes de EM en criógenos tales como etano o etano / propano mezclas. Más gruesa y las células biofilms también se pueden leer en un estado vítreo, en primer lugar &quot;de alta presión cero&quot;, y luego, &quot;crio-corte&quot; de ellos. Una serie de imágenes de proyección en dos dimensiones continuación, se recogen a través de la muestra, ya que se inclina progresivamente a lo largo de uno o dos ejes. Una reconstrucción en tres dimensiones, o &quot;tomografía&quot;, entonces se puede calcular a partir de las imágenes. Mientras que la TEC requiere instrumentación cara, en los últimos años, se ha utilizado en algunos laboratorios para revelar las estructuras de varios apéndices externos, las estructuras de los sobres de células diferentes, las posiciones y las estructuras de los filamentos del citoesqueleto, y los lugares y las arquitecturas macromoleculares de gran conjuntos, tales como motores flagelares, compartimentos interiores y arreglos de los quimiorreceptores. 1, 2 En este artículo de vídeo que muestran cómo las células de la imagen con la TEC, incluyendo los procesos de preparación de muestras, la recopilación de datos, la reconstrucción de tomografía, y la interpretación de los resultados a través de la segmentación y en algunos casos la correlación con microscopía de luz.

Se ilustra aquí el uso de electrones cryotomography (TEC) para estudiar la ultraestructura de las células bacterianas en casi nativo estados, a &quot;macromoleculares&quot; (~ 4 nm) de resolución.

Electron Cryotomography de las células bacterianas

Si bien ya se sabe mucho sobre el metabolismo básico de las células bacterianas, aún quedan muchas preguntas fundamentales sorprendentemente sin respuesta, inclusive para...

En este video, se generan imágenes 3D de células bacterianas en estados casi nativos a resolución molecular mediante tomografía crioelectrónica. Esto se logra primero mediante la congelación por inmersión de células intactas, o alternativamente mediante congelación a alta presión y seccionado criogénico de los pellet celulares. Se adquiere una serie de M imágenes de proyección y se utilizan para generar una reconstrucción 3D, o Tom Graham, que se segmenta y analiza posteriormente mediante métodos computacionales.Hola, soy Grant Jensen de la División de Biología del Caltech, y esta es Sonya Chen, quien ha organizado nuestra presentación. Hoy les mostraremos cómo realizar la tomografía crioelectrónica de células bacterianas. Normalmente, un solo individuo realizaría todo el procedimiento, pero dado que nuestros protocolos se han desarrollado mediante experiencias compartidas, incluiremos a todas las personas que actualmente trabajan en el laboratorio.Además de Sonya y yo en el video, verá a Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky y Jen. Otros miembros del laboratorio produjeron las capturas de pantalla de la computadora y ayudaron a preparar el protocolo escrito que acompaña, incluyendo a Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova y Dylan Morris. Ariana comenzará mostrándoles cómo congelamos por inmersión células bacterianas.Para células bacterianas delgadas, una suspensión de células intactas se congela rápidamente sobre una rejilla de microscopía electrónica (EM). Aquí se demuestra el procedimiento utilizando un congelador automático comercial: primero examine los cultivos bacterianos para asegurarse de que estén libres de contaminantes y en una confluencia o concentración adecuada. Someta la rejilla EM recubierta con carbono a una descarga eléctrica durante dos a cuatro minutos. A continuación, mezcle 100 microlitros de solución de oro coloidal con 25 microlitros de una solución de BSA al 5 %.Centrifugue la mezcla a 18.000 G durante 15 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado de oro. En 20 microlitros de solución celular, coloque la rejilla de ME en el Vitra bot al 100 % de humedad.Luego, aplique cuatro microlitros de la mezcla celular a la rejilla de microscopía electrónica (EM) con descarga luminiscente. La rejilla se seca automáticamente por ambos lados con papel filtro para eliminar el exceso de líquido, y luego se sumerge rápidamente en una mezcla líquida de etano y propano enfriada con nitrógeno líquido. Retire cuidadosamente la rejilla de la mezcla de etano y propano y transfiera rápidamente a una caja de almacenamiento de rejillas mantenida bajo nitrógeno líquido. Para células más gruesas, la congelación a alta presión evita la cristalización del hielo.El corte por criomicrotomía posterior hace que las muestras sean lo suficientemente delgadas para el microscopio electrónico. Para comenzar el análisis por imagen, centrifugue 15 mililitros de células a 1000 RPM durante tres minutos. Tras la centrifugación, retire el sobrenadante y mezcle 0,5 mililitros del sedimento celular restante con 0,5 mililitros de crioprotector al 20% de dextrina.Luego, centrifugue nuevamente a 13.000 RPM durante 15 segundos. Una vez que las células hayan formado el sedimento, retire el sobrenadante y aspire con pipeta 0,1 mililitros de la pasta del sedimento en una punta de micro pipeta sellada por calor, que ya contiene 0,2 mililitros de crioprotector de dextrina al 20 %. Centrifugue la mezcla en la punta de micro pipeta a 13.000 RPM durante 30 segundos.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Se observa un precipitado compacto de cinco a 10 microlitros en la punta sellada. Transfiera la pasta a una de las semiesferas de una plancha abovedada de latón recubierta de teflón ya montada en el brazo del portamuestras del congelador de alta presión, luego séllela con su contraparte plana de latón.Luego, inserte inmediatamente el conjunto del brazo en el congelador de alta presión previamente activado. A una presión de 2100 bar, la unidad combinada de plancha de latón que contiene las células se enfría rápidamente mediante un chorro de nitrógeno líquido a alta presión. Después de que las células hayan sido enfriadas, retire rápidamente el conjunto del brazo y sumérjalo de inmediato en un baño de nitrógeno líquido para evitar que la plancheta se caliente.A continuación, transfiera la plaqueta a un portamuestras tipo mordaza para microtomo criogénico, previamente enfriado y montado firmemente en la cámara del microtomo criogénico, para exponer la cúpula bien congelada de células y proceder al corte. Las dos plaquetas de latón se separan cuidadosamente bajo nitrógeno líquido. Una cúpula de células perfectamente congelada tendrá un aspecto vítreo y estará libre de grietas y fisuras por nucleación de hielo.Utilizando el microtomo criogénico, moldee la región del domo externo a menos de 0,2 milímetros cuadrados empleando la herramienta de diamante para recorte, con una velocidad de corte rápida, manteniendo una profundidad de aproximadamente 200 micrómetros y utilizando un aerosol antiestático dirigido hacia la cuchilla en ángulo bajo y las rejillas de soporte de cobre. En proximidad cercana, avance cuidadosamente el cuchillo de diamante hacia la cara pulida del bloque utilizando una velocidad de corte de aproximadamente 0,4 milímetros por segundo y una ventana de corte estrecha. Comience a seccionar láminas de 50 a 350 nanómetros de grosor.Maniobre un aplicador fino de rímel para enganchar las primeras secciones, deslizándolas fuera del filo en bajo ángulo del cuchillo de diamante y para sostener y guiar las cintas de secciones a través del soporte de malla de cobre. Una vez cargada la malla, utilice una sonda de plata pulida refrigerada para presionar firmemente las cintas. Almacene las mallas en las cajas para mallas dentro de un contenedor seco refrigerado con nitrógeno líquido hasta que el microscopio esté listo.Las células bacterianas en la rejilla pueden visualizarse mediante un microscopio óptico criogénico. Aquí se utilizará un microscopio invertido Nikon personalizado, TIB, con una platina criogénica FEI modificada. Cargue las rejillas en cartuchos en la estación criogénica y sujételas con los anillos de sujeción de cobre; luego coloque el cartucho en un tubo con nitrógeno líquido para su transferencia.Cargue hasta dos cartuchos en la etapa criogénica preenfriada y mueva la rejilla a la ventana de visualización. Luego, baje la lente condensadora y enfoque la lente objetivo sobre la rejilla. Localice las células y tome imágenes.Para el estudio correlativo de microscopía ligera y electrónica. La cuadrícula se escanea alrededor de la zona de las células para localizarlas posteriormente en microscopía electrónica. Después de obtener las imágenes de la cuadrícula, coloque el cartucho de nuevo en el tubo y mantenga el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté listo para ser analizado en microscopía electrónica para obtener una tomografía tridimensional (TOM) de la célula bacteriana.Se toma una serie de imágenes de proyección mientras la muestra se inclina progresivamente a lo largo de uno o dos ejes en el microscopio electrónico criogénico; aquí, el procedimiento se demuestra utilizando Legend con un microscopio electrónico criogénico TF30 Polar. Cargue hasta seis cartuchos en un portador de selección múltiple en la estación criogénica. Luego, conéctelo al TF30 Polar. Seleccione un cartucho e insértelo en la columna del microscopio electrónico. Inicie Legend en el software cliente del ordenador del microscopio electrónico.Introduzca las condiciones de la imagen para la leyenda en la sesión. Seleccione los objetivos en las imágenes comenzando por el aumento más bajo y envíelos al siguiente paso con aumento más alto. Luego, coloque todos los objetivos en cola para la recopilación de series de inclinación y envíelos todos al paso final de tomografía.Adquiera una serie de imágenes. La muestra se inclinará progresivamente a lo largo de uno o dos ejes en el microscopio electrónico criogénico. Una vez finalizado el experimento, descargue la serie de inclinación completada en una estación de trabajo local para su reconstrucción.Los tomogramas de las células bacterianas se calculan utilizando software especializado. El programa Raptor se utiliza para reconstruir automáticamente los tomogramas y e tomo puede usarse para hacerlo de forma semiautomática. Inspeccione las series de inclinación utilizando el visor 3D mod de IMOD y descarte aquellas que, debido a errores de seguimiento u otros, probablemente no produzcan resultados adecuados.Un raptor de tomografía adecuado se ejecuta de forma distribuida en las máquinas Linux del laboratorio utilizando la configuración básica. Se tarda de 20 minutos a dos horas, dependiendo del tamaño del archivo, en generar la tomografía. Cuando Raptor falla o un investigador desea asegurarse de que la reconstrucción sea óptima, se puede utilizar EMO para alinear cuidadosamente las imágenes manualmente.Siga los pasos de cada pestaña en la interfaz gráfica de usuario de e tomo para reconstruir el Tom Graham a partir de la serie de inclinación. Utilizamos una base de datos interna basada en web para organizar, almacenar, buscar y distribuir los datos tomográficos. La página principal de navegación presenta una imagen en miniatura y una película destacada similar a YouTube.Por cada Tomo Graham. Después de obtener los Tomo Grahams, se pueden segmentar características individuales para ayudar a visualizar sus formas. En 3D, la segmentación es el proceso de asignar cada vóxel de la imagen tridimensional a una región o material particular.Aquí se utiliza un software de espejo para generar un modelo de superficie en el que cada región se muestra con un color diferente y se visualiza en películas y animaciones 3D del tomograma. Se pueden realizar gráficos para resumir proyectos e ilustrar hallazgos en gráficos 3D. Representación. Software como Amira o Kymera pueden utilizarse para renderizar los fotogramas individuales de la película y del anuncio comercial.Se puede utilizar software de edición de video, como Adobe Premiere, para editar el video comercial. Maya se utiliza para generar la animación. Puede tomar las superficies de Amira, crear fotogramas clave y renderizarlas en un video.Aquí se muestra una serie representativa de inclinación de datos de células completas para el *Spiro Treponema Promesa*, seguida por una vista capa por capa del tomograma reconstruido. La segmentación de la célula de *T. Promesa* distingue su membrana externa, membrana interna y estructuras superficiales, incluyendo cuencos superficiales y arco de gancho superficial. Las bacterias poseen flagelos y motor ulnar, cono periplásmico y pili.Este modelo mecánico muestra cómo nada la espiroqueta Treponema Promesa y cómo un cilindro interno o núcleo está encerrado por una vaina externa. Las flagelas se mueven como rodillos de pintura entre el cilindro interno y la vaina externa. A medida que las flagelas giran, el cilindro interno gira en sentido contrario dentro de la vaina externa.En un entorno no viscoso, la célula gira inútilmente, pero en entornos viscosos como aquellos en los que se encuentra T Promesa en la naturaleza, las fibras externas u otros objetos resisten la rotación de la vaina externa, acelerando la rotación del cilindro interno y proporcionando materiales contra los que la célula puede empujar mientras se perfora hacia adelante. Aquí se muestran células reales de T promeus observadas mediante un microscopio óptico. Acabamos de mostrarle cómo realizar tomografía crioelectrónica de células bacterianas.Por supuesto, somos conscientes de que este tipo de trabajo requiere inversiones importantes. Los microscopios electrónicos criogénicos y los microscopios de fluorescencia son sofisticados y costosos, y además deben citarse adecuadamente. Por ejemplo, el cimiento de esta sala es una losa de hormigón aislada mecánicamente, de varios pies de espesor, que descansa sobre un terreno especialmente compactado.El sistema de aire acondicionado también está diseñado a medida, con conductos grandes y curvas suaves para mantener una temperatura constante sin corrientes de aire ni turbulencias. Las cortinas que observa se colocan para reducir el ruido acústico. Y finalmente, verificamos que esta habitación esté libre de campos electromagnéticos interferentes.Aunque las operaciones que le hemos mostrado en el microscopio ahora son en gran parte automatizadas, con frecuencia surgen problemas que requieren un diagnóstico experto. No obstante, esperamos que ver este video le haya ayudado a valorar los procedimientos y la instrumentación implicados en este tipo de trabajo. Gracias por su atención.

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Investigación

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Biología

Fuente: Chetrit, D., et al. Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de Legionella pneumophila Dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020)El video describe cómo preparar muestras de Legionella pneumophila para tomografía crioelectrónica combinando cultivo bacteriano, marcado de nanopartículas de oro y técnicas de vitrificación. El proceso preserva las estructuras celulares nativas y permite obtener...

Preparación de Legionella pneumophila para tomografía electrónica criogénica

Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.

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Se presenta un protocolo de cómo recoger y electrones proceso de crio-tomografías de toda la mitocondria. La técnica ofrece una detallada comprensión de la estructura, función y organización de grandes complejos de proteínas de membrana en membranas biológicas nativas.

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Se presenta un protocolo sobre cómo utilizar la crio-tomografía electrónica de alto rendimiento para determinar alta resolución en las estructuras in situ de máquinas moleculares. El protocolo permite que grandes cantidades de datos a procesar, evita los cuellos de botella comunes y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, lo que permite al usuario centrarse en cuestiones biológicas importantes.

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Este protocolo describe cómo visualizar la compactación de ADN transitoria en cianobacterias. Cultivo sincrónico, monitoreo por microscopía de fluorescencia, congelación rápida y alta tomography del cryo-electrón de voltaje se utilizan. Se presenta un protocolo para estas metodologías, y se discuten avances y futuras aplicaciones.

Visualización de compactación del ADN en cianobacterias por Tomography del Cryo-electrón de alta tensión

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

Presentamos un protocolo para la preparación de láminas de especímenes biológicos congelados por inmersión mediante micromecanizado de haz de iones crioenfocado para estudios estructurales de alta resolución de macromoléculas in situ con tomografía crio-electrónica. El protocolo presentado proporciona pautas para la preparación de láminas de alta calidad con alta reproducibilidad para la caracterización estructural de macromoléculas dentro de las Saccharomyces cerevisiae.

Preparación y micromecanizado Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Crio-Tomografía Electrónica

El objetivo de este protocolo es dirigir la adhesión y el crecimiento celular a áreas específicas de rejillas para criomicroscopía electrónica. Esto se logra mediante la aplicación de una capa antiincrustante que se ablaciona en patrones especificados por el usuario seguido de la deposición de proteínas de matriz extracelular en las áreas modeladas antes de la siembra celular.

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

El presente protocolo describe la adquisición remota de datos por criotomografía electrónica de alta resolución utilizando Tomo5 y el posterior procesamiento de datos y el promedio de subtomografías utilizando emClarity. La apoferritina se utiliza como ejemplo para ilustrar procesos detallados paso a paso para lograr una estructura crio-ET a una resolución de 2,86 Å.

Recopilación remota de datos por tomografía crioelectrónica y promedio de subtomografía

La tomografía crio-STEM proporciona un medio para visualizar orgánulos de células intactas sin incrustación, seccionamiento u otras preparaciones invasivas. La resolución 3D obtenida se encuentra actualmente en el rango de unos pocos nanómetros, con un campo de visión de varios micrómetros y un espesor accesible del orden de 1 μm.

Visualización de orgánulos in situ mediante tomografía crio-STEM

Este protocolo estandariza la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para tejidos gruesos integrando la congelación a alta presión (HPF) con el método waffle, el levantamiento por haz de iones de foco criogénico (crio-FIB) y la adquisición paralela simétrica en dosis, produciendo láminas uniformemente finas y muestras vitrificadas para análisis in situ reproducibles en el hipocampo del ratón.

Flujo de trabajo de criotomografía electrónica para tejidos gruesos demostrado en hipocampo de ratón

Aprende criotomografía electrónica para visualizar la ultraestructura celular bacteriana con resolución macromolecular. Este método utiliza congelación por inmersión y alta presión para obtener imágenes 3D de alta calidad.

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