Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Las espinas dendríticas son protuberancias de membrana de la dendrita de una neurona que reciben información sináptica. El alargamiento, la contracción o la desaparición de las espinas se producen en respuesta a cambios en la función de la red neuronal que resultan de patrones específicos de actividad neuronal. Este fenómeno se conoce como plasticidad cortical para observar cambios morfológicos en las espinas dendríticas.

En los animales vivos, se coloca una placa de imagen en el cráneo de un ratón. Un área del cráneo se adelgaza quirúrgicamente y se requieren imágenes con aumentos bajos y altos. A continuación, se vuelven a crear imágenes de las áreas en puntos de tiempo posteriores.

Los resultados obtenidos muestran que la morfología de la espina dendrítica se puede visualizar claramente utilizando una preparación de cráneo delgado en múltiples puntos temporales. Y esa morfología de la espina es altamente plástica, mostrando cambios en la estructura y también la aparición y desaparición de espinas dendríticas. Hola, soy Emily Kelly en el laboratorio de Anaya Maka en el Departamento de Neurobiología y Anatomía de la Universidad de Rochester.

Hoy le mostraremos el procedimiento para obtener imágenes crónicas de la corteza del vial del ratón siguiendo una combinación llamada preparación. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el recambio de la espina dendrítica. Así que comencemos.

Comience el procedimiento esterilizando las herramientas para la cirugía aséptica. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70% y cubra la superficie de operación con un apósito limpio. Monitoree la profundidad de la anestesia en un ratón anestesiado con cóctel de fentanilo probando su respuesta a un pellizco en el dedo del pie, el ratón que se muestra aquí es un ratón transgénico A-G-F-P-M en el que se expresa GFP.

En la capa cinco células parametálicas que proyectan procesos dendríticos en capas superficiales. Para mantener una temperatura corporal de 37,5 grados centígrados, coloque al animal sobre una manta térmica y vigílelo con un termómetro rectal adjunto. A continuación, aplique una pomada oftálmica en los ojos para evitar que se sequen con unas tijeras.

Quita el pelo de la parte posterior de la cabeza del ratón, desde detrás de las orejas hasta los ojos. A continuación, limpie la parte superior de la cabeza del animal con una aplicación de etanol al 70%, seguido de un exfoliante Betadine y una solución de Betadine. Haga una incisión en la UCL detrás de las orejas y hacia arriba a lo largo del lado derecho o izquierdo de la línea media, dependiendo del hemisferio que se visualizará en los ojos, doble la piel sobre y lejos del sitio de la cirugía.

No retire la piel ya que se suturará posteriormente con pinzas finas. Tire suavemente de la piel hacia arriba y lejos del área de interés. Con pinzas limpias, raspe suavemente el periostio de la zona expuesta del cráneo.

Aplique una pequeña cantidad de cloruro justo al 10% en el cráneo para secar completamente la membrana del periostio y asegurarse de que se ha eliminado por completo. Es importante que el cráneo esté completamente seco. Para asegurar la correcta adherencia del pegamento, raspe suavemente la membrana seca del periostio con una cuchilla microquirúrgica.

A continuación, aplique una fina capa de pegamento acrílico Sano alrededor de la ventana de imagen de la placa principal de acero inoxidable y fije la placa al cráneo. Con el extremo de madera de un bastoncillo de algodón, aplique pegamento a las costuras interiores de la ventana de imagen, asegurándose de llenar todos los espacios entre la placa de imagen y la curvatura del cráneo. Coloque una gota del acelerador de pegamento en la ventana.

A continuación, limpie rápidamente el exceso. Deja que el pegamento se seque una vez que se haya secado por completo. Con un taladro dental fijado con una fresa de acero inoxidable de 0,7 milímetros, comience a adelgazar el cráneo en la ventana de imágenes.

Perforación alterna con aplicación ocasional de solución salina estéril al 0,9%. Para evitar generar demasiado calor en el cráneo. Adelgaza una ventana de cuatro por cuatro milímetros en el cráneo con pequeños trazos a través de la superficie del cráneo.

Con el taladro dental. Pruebe la delgadez del cráneo con pinzas de extremo romo. La superficie del cráneo se hundirá ligeramente con una presión suave.

El grosor óptimo del cráneo para la obtención de imágenes es de entre 10 y 30 micras. Una vez que el cráneo esté adelgazado, limpie la ventana de todos los desechos y coloque solución salina sobre el cráneo. Fotografíe la ventana de imágenes con una cámara digital montada en un telescopio de disección.

La vasculatura cerebral en esta fotografía ayudará a ubicar la posición para colocar la placa de imágenes para sesiones de imágenes posteriores. Transporta al animal a la plataforma de dos fotones. El animal debe permanecer sobre la manta térmica y la temperatura corporal debe controlarse continuamente durante toda la sesión de imágenes.

Un microscopio de dos fotones con un láser mi tai. Se utiliza una bomba de estado sólido de 10 vatios para obtener la máxima potencia y una unidad confocal de vista de flujo Olympus modificada. El sistema está optimizado para la obtención de imágenes de tejidos profundos y los detectores externos se instalan lo más cerca posible del objetivo para permitir la máxima detección de fluorescencia del cerebro, agregue una gota de solución salina a la ventana de imagen utilizando un zoom digital bajo.

Identifique un área que contiene neuronas marcadas brillantemente usando una cámara digital fijada al microscopio. Ips, tome una fotografía del área de imagen. Esto es necesario para volver a la misma ubicación de imagen en un momento posterior.

Obtenga una pila de aumento bajo a través de toda la extensión visible del cerebro que muestre la extensión de la ramificación dendrítica. Esto se utilizará para localizar el área de la imagen en puntos de tiempo posteriores como vasos sanguíneos y dendritas. Mantener su estructura en animales jóvenes y adultos utilizando software de imagen.

Aumente el aumento digital ocho veces, ajuste las coordenadas XY si es necesario y recopile una pila de aumento alto, que mostrará la morfología dendrítica detallada, incluidas las ubicaciones y la estructura de las espinas dendríticas. Tome notas detalladas sobre cada colección de pilas, incluidas las coordenadas panorámicas, el rango de la colección, el tamaño del paso Z y el número de pasos en la pila. Estas notas se utilizarán cuando se regrese a este dendri o axón en un momento posterior.

Después de la toma de imágenes, retire la placa de la cabeza separándola suavemente de la superficie del cráneo. Uso de fórceps. Retire cualquier residuo de pegamento y limpie el cráneo con solución salina estéril al 0,9%.

Sutura la piel sobre el cráneo con hilo de sutura número seis. Limpie el área con etanol al 70% después del procedimiento de imagen. Coloque al animal en una jaula limpia bajo una lámpara de calor hasta que se despierte y sea móvil.

Luego, regrese al animal a su jaula original para obtener imágenes del animal nuevamente en un momento posterior, desde dos días hasta muchos meses después, retire los puntos y vuelva a abrir la piel de la cabeza. Con métodos asépticos, utilice la imagen digital de la vasculatura cerebral tomada durante la primera cirugía para localizar la ubicación original de la imagen. A continuación, vuelva a fijar la placa principal como antes.

Si es necesario, use una cuchilla microquirúrgica para diluir suavemente cualquier hueso que pueda haber vuelto a crecer entre los puntos de tiempo de las imágenes. Adelgace con un taladro dental, limpie la ventana de imágenes de residuos y aplique una gota de solución salina estéril al 0,9%. Lleve al animal a un microscopio de dos fotones y localice el área de imagen original utilizando la imagen digital fluorescente tomada durante la sesión anterior.

Inicie el programa de vista de flujo. Abra la imagen original de baja ampliación, pegue una hoja de transparencia en la pantalla de la computadora y dibuje el patrón principal de los vasos sanguíneos con un bolígrafo de transparencia. A continuación, abra la imagen en vivo y realinee la vasculatura sanguínea con el patrón esbozado en la película transparente.

Elimine la transparencia para volver a crear una imagen de las estructuras ampliadas de ocho x. Abra la pila recopilada deseada de la sesión de imágenes anterior. Dibuje la estructura en una película transparente adherida a la pantalla de la computadora.

Acérquese ocho veces a la imagen en vivo y alinee la imagen con la transparencia. Dependiendo de la precisión de la alineación de la ubicación de baja ampliación, puede ser necesario ajustar también el ángulo de la imagen ligeramente, establecer las coordenadas panorámicas con los parámetros de imagen del primer día, incluido el tamaño del paso y el número de imágenes recopiladas, la repetición de la imagen de Zack se puede realizar dos veces. El número de veces que se abre el cuero cabelludo debe limitarse para evitar alterar la integridad del cráneo, lo que dará lugar a una mala resolución de la imagen en los ratones que expresan GFPM.

Un subconjunto de células parametálicas de capa cinco y los procesos dendríticos correspondientes se visualizaron utilizando microscopía de barrido láser de dos fotones in vivo, aquí se muestran las dendritas de corteza visual marcadas con GFP. Esta imagen es una proyección de una sola imagen obtenida cada cinco micras del PIA hasta una profundidad final de 175 micras. La región en caja se muestra con mayor aumento aquí en el día cero, y nuevamente en el cuarto día aquí, comparando la mayor ampliación de una imagen de rama dendrítica del día cero y el día cuatro.

Estas imágenes muestran espinas estables indicadas por las puntas de flecha blancas que se retraen perdidas, que están marcadas por la punta de flecha roja y nuevas espinas indicadas por la punta de flecha verde. Acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes crónicas de dos fotones en la corteza visual del ratón utilizando una preparación de cráneo delgado. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener especial cuidado durante el proceso de adelgazamiento para evitar daños en el cráneo y la duramadre subyacente, ya que esto dará como resultado una mala resolución de la imagen y tomar notas detalladas.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.