Name: Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a realizar imagen crónica de la corteza visual en ratones mediante preparación de cráneo adelgazado. Este método permite observar la dinámica de espinas dendríticas in vivo y estudiar la plasticidad cortical.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Premio Carrera Burroughs Wellcome en las Ciencias Biomédicas (AKM), la Fundación de Becas de Investigación Whitehall (AKM), Beca de la Fundación Sloan (AKM), NIH EY019277 (AKM), y una financiación NEI, Visión Entrenamiento Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Para visualizar las neuronas en el cerebro intacto utilizando microscopía de dos fotones, una preparación donde las neuronas son etiquetados con marcadores fluorescentes se utiliza. En los experimentos que aquí se presenta se utiliza la línea de las buenas prácticas agrarias-M de ratones transgénicos que las etiquetas de la capa de células piramidales 5 1. Capa 5 células piramidales proyecto prolongaciones dendríticas en las capas superficiales, lo que permite la visualización de las dendritas y espinas dendríticas hasta una profundidad de 300 m por debajo del nivel de la PIA. Un enfoque alternativo es a las células de la etiqueta utilizando los marcadores virales (véase Lowery et al., Presentado a JOVE). </li><li> Esterilizar el área de trabajo con 70% de etanol y las herramientas de autoclave para la cirugía aséptica. Cubrir la superficie de operación con vendaje limpio. </li><li> Anestesiar a los ratones con un cóctel de fentanilo (fentanilo 0,05 mg / kg, midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg), seguido de una dosis de la cuarta parte de Avertin (0,0075 mg / ml), utilizando IACUC los procedimientos aprobados. Tratamiento previo a los ratones con el analgésico, la buprenorfina (0,5 mg / kg) administrada por vía subcutánea (SQ). Controlar el nivel de plano anestésico por la reacción de pruebas para pellizcar la cola / dedo del pie. </li><li> Mantener los animales a 37,5 ° C con una manta de calentamiento con un termómetro rectal adjunto. </li><li> Aplique un ungüento oftálmico para los ojos para evitar que los ojos se sequen. Ojos Hood con hoja de papel para proteger los ojos de la fuente de luz durante la cirugía. </li><li> Con la tijera, quitar el pelo de la parte posterior de la cabeza (detrás de las orejas) en los ojos. </li><li> Limpie la parte superior de la cabeza del animal con la aplicación secuencial de etanol al 70%, seguido de lavado y la solución de betadine betadine. </li><li> Hacer una incisión en L-por detrás de las orejas y hasta por el lado derecho o izquierdo de la línea media (dependiendo de en qué hemisferio se creará una imagen) a los ojos. Pliegue de la piel sobre y fuera del lugar de la cirugía. No quite la piel, la piel se sutura después de la sesión de imágenes. </li><li> Con unas pinzas finas tire suavemente de la piel hacia arriba y lejos de su área de interés. </li><li> Raspar suavemente el periostio de la zona expuesta de cráneo con unas pinzas o una hoja limpia de microcirugía. Utilizando un hisopo de algodón, aplique una pequeña cantidad del 10% de cloruro férrico en el cráneo que se seque completamente la membrana periostio y asegurarse de que se ha eliminado por completo. Es importante que el cráneo está completamente seco para asegurar la adhesión adecuada de la cola (ver 11). El uso de fórceps o una hoja de microcirugía, raspar suavemente lejos de membrana seca periostio. </li><li> Aplique una capa fina de pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana de imagen de la placa de acero inoxidable de la cabeza (ver Figura 1) y fijar la placa en el cráneo. </li><li> Con el extremo de un palo de madera, algodón, esponja, aplique el pegamento en las costuras en el interior de la ventana de imagen, asegurándose de llenar todos los huecos entre la placa de imagen y la curvatura del cráneo. </li><li> Coloque una gota de pegamento en el acelerador de la ventana. Rápidamente borrar acelerador de exceso de pegamento con un hisopo de algodón o kim limpiar. El pegamento debe ser completamente solidificado antes de perforar. </li><li> Comiencen a perder masa del cráneo en la ventana de imagen usando un taladro dental identificado con una de 0,7 mm de acero inoxidable fresa. Perforación se alternan con la aplicación ocasional de 0,9% solución salina estéril para evitar que se genere un exceso de calor en el cráneo. </li><li> Delgada ventana de 4x4 mm en el cráneo con movimientos pequeños en toda la superficie del cráneo con un taladro dental. Prueba de la delgadez de la cabeza con unas pinzas de extremos romos. La superficie del cráneo guión un poco con una suave presión. El grosor del cráneo óptimo para la imagen es de entre 10 y 30 micras. </li><li> Cuando el cráneo es fina y limpia la ventana de todos los desechos, el lugar de solución salina en el cráneo. Fotografía de la ventana de imagen con una cámara digital montada en un microscopio de disección. La fotografía y el uso de la vasculatura del cerebro que ayuda a localizar la posición de colocar la placa de imagen para las sesiones de formación de imágenes posteriores. </li><li> Transporte de los animales a la plataforma de 2 fotones. El animal debe permanecer en la manta térmica (con sonda rectal) durante la sesión de las imágenes. Nota: mientras que en la sedación, la temperatura del animal corporal fluctúa mucho en la ausencia de una unidad de calentamiento que resulta en daño cortical o incluso la muerte. </li><li> Un microscopio de dos fotones con un láser Mai Tai, una bomba de 10 W en estado sólido de potencia máxima y una modificación de Olympus unidad Fluoview confocal se utiliza. El sistema está optimizado para obtener imágenes de tejidos profundos y detectores externos se instalan tan cerca del objetivo como sea posible para permitir la detección de la fluorescencia máxima desde el cerebro. Una Olympus LUMPlan fl / IR lente objetivo 20X/0.95NA se utiliza. 0,9% se utiliza durante la exploración para el objetivo de inmersión. </li><li> El uso de este microscopio, y un zoom digital de bajo (x1) identificar un área que contiene las neuronas brillantes etiquetados. </li><li> Utilizando una cámara digital colocada en el microscopio ocular, tomar una fotografía de la superficie de imágenes. Por otra parte, esbozar el patrón de vasos sanguíneos. Esto es necesario para volver aa su vez a la ubicación de imágenes en un mismo punto de tiempo posterior. </li><li> Obtener una pila de bajo aumento (objetivo x20, 512x512 píxeles, 5 m paso) a través de toda la extensión visible del cerebro (generalmente durante ~ 200 micras) que muestra el grado de ramificación dendrítica. Nota: esta imagen bajo aumento se utiliza para localizar el área de la imagen en puntos de tiempo posteriores que tanto los vasos sanguíneos y las dendritas mantener su estructura en los animales jóvenes y adultos. </li><li> Usando software de imagen (Fluoview, v. 5.0, FV300), aumentar la ampliación digital de 8 veces. Ajustar la coordenadas X, Y (pan coordenadas) y si es necesario recoger un montón de gran aumento que muestra la morfología detallada dendríticas incluyendo la ubicación y la estructura de las espinas dendríticas. Tome notas detalladas sobre cada colección de pila, es decir, pan coordenadas, la gama de la colección, el tamaño de z a paso y el número de pasos en la pila. Estas notas se utilizarán al regresar a esta dendrita o axón a un tiempo posterior. </li><li> Siguiente imagen, retire la placa de la cabeza con cuidado separar la placa de la superficie del cráneo. Con unas pinzas, quite cualquier adhesivo residual que queda en el cráneo y limpiar la superficie del cráneo con el 0,9% de solución salina estéril. Suturar la piel sobre el cráneo, usando # 6 hilo de sutura. Limpie el área con el 70% de etanol. Para aliviar el dolor durante la recuperación post-operatoria, la administración de 0,1 mg / kg analgésico buprenorfina, SQ. </li><li> Lugar de los animales en la jaula de limpiar debajo de una lámpara de calor hasta que se despierta y es móvil. Volver a la jaula de los animales originales. </li><li> Para crear la imagen de los animales en un momento posterior (los puntos de una imagen en tiempo puede variar de 2 días a varios meses de diferencia), sacar los puntos o volver a abrir la piel de la cabeza utilizando métodos asépticos que el anterior. El uso de la imagen digital del cerebro vascular (tomadas en la fecha la primera cirugía) para localizar la ubicación de imagen original. Reaffix de acero inoxidable headplate (pasos 10-12). Utilice una hoja de microcirugía para adelgazar suavemente lejos cualquier hueso que podría haber crecido de nuevo entre los puntos de una imagen en tiempo. Si es necesario, delgado, con taladro dental. Ventana de imágenes libres de escombros y aplicar una gota de solución salina 0,9% estéril. </li><li> Llevar animales a la de dos fotones microscopio y localizar campo de la imagen original. Usa la fotografía digital tomada durante la sesión de imágenes de primera ayuda. </li><li> Abra el programa Fluoview y abrir la imagen original bajo aumento. Coloque una hoja de transparencia a la pantalla de la computadora y dibujar el patrón de los vasos sanguíneos principales utilizando una pluma de transparencia. </li><li> Abra la imagen en vivo y realinear los vasos sanguíneos con el modelo esbozado en la película de transparencia. </li><li> Para crear la imagen del zoom de 8x en las estructuras, abrir la pila deseada recogidos de la sesión de imágenes anteriores. Dibuje la estructura (es decir, axonal, dendríticas, gliales) en una película de transparencia, colocada en la pantalla del ordenador. </li><li> Zoom 8x de la imagen en vivo y ajustar el panorama coordenadas para los parámetros de imagen del primer día. Dependiendo de la exactitud de la alineación de la ubicación de bajo aumento, puede ser necesario ajustar también el ángulo de la imagen un poco. Una vez que la estructura deseada se encuentra, coinciden con la estructura de su patrón esbozado una gran ampliación. Recoger el z-stack con el tamaño del paso idénticos y el número de z-stack imágenes para su posterior análisis. </li><li> Repita los pasos 29 y 30 hasta que todas las imágenes de gran aumento se recojan. </li><li> Cuando la imagen está completa, repita los pasos 22-24. Nueva imagen se puede repetir en un máximo de 2 puntos de tiempo separados. </li><li> Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Vivarium y la División de Medicina de Animales de Laboratorio de la Universidad de Rochester, Facultad de Medicina y Odontología, en plena acreditación por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio, Internacional (AAALAC) y están en conformidad con la ley estatal, la legislación federal y la política de NIH. </li></ol> Resultados representante En las buenas prácticas agrarias-M ratones que expresan, un subconjunto de la capa de células piramidales y 5 correspondientes procesos dendríticas pueden ser fácilmente visualizados usando 2-fotón microscopía de escaneo láser (2PLSM) 1. Aquí hemos demostrado una preparación diluida, en el cráneo que se adelgaza el cráneo sobre la ubicación de imagen deseada a ~ 10-30 micras. Se realiza correctamente, el protocolo nos permite visualizar claramente las dendritas corticales y las espinas en la corteza visual intacto para el análisis agudo o crónico (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cabeza de la costumbre y la placa base. (A) Vista superior de la cabeza por encargo y la placa base que se utiliza para la preparación de la cirugía cráneo-diluido. (B) Vista lateral de la cabeza a medida y la placa base. (C, D) esquemática detallada y la imagen de la placa de la cabeza. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> en vivo en la corteza visual de un transgénico GFP-M ratón usando la microscopía de dos fotones. La imagen es una proyección de imagen individuales obtenidos cada 5 m de la pia a una profundidad final de 175 micras. El área de caja en una representa a la región ampliada en (B) y (C) fotografiado en el día 0 (D0) y cuatro días más tarde (D4). (D, E) Mayor aumento de la rama dendríticas en caja de B y C que demuestran espinas estable (cabezas de flecha blanca), perdido / espinas retracción (cabezas de flecha roja) y nuevas espinas (cabezas de flecha verde). Las barras de escala = A. 200 micras, B, C. 20 m, D, E. 5 micras.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

Imágenes crónica utilizando microscopía de dos fotones se está convirtiendo en una técnica cada vez más popular para estudiar los cambios morfológicos se dispararon durante 2-5 plasticidad. Aquí se demuestra una preparación diluida-cráneo de seguir identificado las espinas dendríticas en el cerebro del ratón intacto en día imágenes diferentes. En este protocolo, el cráneo se deja intacta, causando el mínimo daño a la corteza y que resulta en niveles muy bajos de la neuroinflamación que pueden alterar la funci...

<table><tbody><tr><td>Citrato de fentanilo</td><td></td><td>En el laboratorio</td><td></td><td>Cóctel de fentanilo: cóctel anestésico&lt;br/&gt;Dosis i.p.: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentración final de la mezcla: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Clorhidrato de medetomidina</td><td></td><td>En casa</td><td></td><td>Cóctel de fentanilo: cóctel anestésico&lt;br/&gt;Dosis i.p.: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentración final de la mezcla: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>En el laboratorio</td><td></td><td>Cóctel de fentanilo: cóctel anestésico&lt;br/&gt;Dosis i.p.: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentración final de la mezcla: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Cóctel Avertin: Anestésico;&lt;br/&gt;Dosis IP: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentración final de la mezcla: 1%</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol (Concentración final: 0,775 %)</td><td></td><td></td><td></td><td>Cóctel Avertin: Anestésico;&lt;br/&gt;Dosis i.p.: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentración final de la mezcla: 0,775 %</td></tr><tr><td>Sistema de Control de Temperatura TC-1000 para Ratones</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Ratón</td><td>Regulación de la temperatura corporal</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>En casa</td><td></td><td>Pomada ocular</td></tr><tr><td>Cloruro férrico al 10 %</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Preparación de cráneo delgado</td></tr><tr><td>Hoja microquirúrgica</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Preparación de cráneo delgado</td></tr><tr><td>Cianoacrilato 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>Preparación de cráneo delgado</td></tr><tr><td>Cianoacrilato 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>Preparación de cráneo delgado</td></tr><tr><td>Acelerador de pegamento Zip Kicker</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>Preparación de cráneo delgado</td></tr><tr><td>Microfresas de acero de 0,7 mm de diámetro de punta</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Preparación de cráneo delgado</td></tr><tr><td>Microtorque Control Box y pieza de mano Tech2000</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ENCENDIDO/APAGADO</td><td>Preparación de cráneo delgado</td></tr><tr><td>#6-0 (0,7 métrico) sutura de seda</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Conicidad C-1</td></tr><tr><td>Pinzas para vendaje ocular, 10 cm, ancho de la punta 0,5 mm, curvas</td><td>Instrumentos quirúrgicos</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn extrafinas, 8,5 cm, punta recta, filo de corte de 13 mm</td><td>Instrumentos quirúrgicos</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas estándar, rectas, punta de 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Instrumentos quirúrgicos</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de diluido-cráneo

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Imágenes in vivo utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (2PLSM) permite el estudio de las células vivas y los procesos neuronales en el cerebro intacto. La técnica que aquí se presenta permite que la imagen de la misma área del cerebro en varios puntos del tiempo (crónica de imágenes) con resolución microscópica que permite el seguimiento de las espinas dendríticas, que son las pequeñas estructuras que representan la mayoría de los sitios postsinápticos excitatorios en el SNC. La capacidad de resolver bien claramente las estructuras corticales más de varios puntos del tiempo tiene muchas ventajas, especialmente en el estudio de la plasticidad del cerebro en la que los cambios morfológicos en las sinapsis y la remodelación del circuito puede ayudar a explicar los mecanismos subyacentes. En este material de vídeo y complementarias, se muestra un protocolo para la crónica en vivo de imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo. La preparación diluida-cráneo es un método mínimamente invasivo, lo que evita posibles daños a la duración y / o la corteza, lo que reduce la aparición de una respuesta inflamatoria. Cuando este protocolo se realiza correctamente, es posible seguir con claridad los cambios en las características de la espina dendrítica en el cerebro intacto durante un período prolongado de tiempo.

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la crónica<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

La obtención de imágenes in vivo mediante microscopía de barrido láser de dos fotones (2PLSM) permite el estudio de células vivas y procesos neuronales en el cerebro intacto. El ...

Las espinas dendríticas son prolongaciones de la membrana del dendrito de una neurona que reciben entradas sinápticas. El alargamiento, encogimiento, aparición o desaparición de espinas ocurre como respuesta a cambios en la función de la red neuronal que resultan de patrones específicos de actividad neural. Este fenómeno se conoce como plasticidad cortical para observar los cambios morfológicos en las espinas dendríticas.En animales vivos, se fija una placa de imagen al cráneo de un ratón. Un área del cráneo se adelgaza quirúrgicamente y se obtienen imágenes a baja y alta magnificación. Luego, las áreas se vuelven a imaginar en puntos temporales posteriores.Los resultados obtenidos muestran que la morfología de las espinas dendríticas puede visualizarse claramente mediante una preparación de cráneo delgado en múltiples puntos temporales. Y que la morfología de las espinas es altamente plástica, mostrando cambios en la estructura, así como la aparición y desaparición de espinas dendríticas. Hola, soy Emily Kelly en el laboratorio de Anaya Maka en el Departamento de Neurobiología y Anatomía de la Universidad de Rochester.Hoy les mostraremos el procedimiento para la imagen crónica de la corteza víscal del ratón tras una preparación llamada fijación. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el recambio de espinas dendríticas. Así que comencemos.Comience el procedimiento esterilizando las herramientas para cirugía aséptica. Luego esterilice el área de trabajo utilizando etanol al 70% y cubra la superficie operatoria con un campo limpio. Monitoree la profundidad de la anestesia en un ratón anestesiado con una mezcla de fentanilo mediante la prueba de respuesta a un pellizco en el dedo del pie; el ratón mostrado aquí es un ratón transgénico A-G-F-P-M en el que se expresa GFP.En células parametales de la capa cinco que proyectan procesos dendríticos hacia capas superficiales. Para mantener una temperatura corporal de 37,5 grados Celsius, coloque al animal sobre una manta calefactora y monitórelo con un termómetro rectal adjunto. Luego, aplique una pomada oftálmica en los ojos para evitar que se sequen, utilizando tijeras.Retire el pelo de la parte posterior de la cabeza del ratón, desde detrás de las orejas hasta los ojos. Luego limpie la parte superior de la cabeza del animal aplicando etanol al 70%, seguido de una fricción con Betadine y solución de Betadine. Realice una incisión LCU detrás de las orejas y hacia arriba a lo largo del lado derecho o izquierdo de la línea media, dependiendo del hemisferio que se va a imaginar hasta los ojos, y doble la piel hacia arriba y lejos del sitio quirúrgico.No retire la piel ya que se suturará posteriormente utilizando pinzas finas. Tire suavemente de la piel hacia arriba y alejándola del área de interés. Utilizando pinzas limpias, raspe suavemente el periostio del área expuesta del cráneo.Aplique una pequeña cantidad de cloruro férrico al 10 % sobre el cráneo para secar completamente la membrana perióstica y asegurarse de que haya sido eliminada por completo. Es importante que el cráneo esté completamente seco. Para garantizar una correcta adherencia del pegamento, raspe suavemente la membrana perióstica seca con una hoja de cirugía microquirúrgica.A continuación, aplique una capa fina de pegamento acrílico Sano alrededor de la ventana de imagen de la placa craneal de acero inoxidable y fije la placa al cráneo. Con el extremo de madera de un bastoncillo de algodón, aplique pegamento en las costuras internas de la ventana de imagen, asegurándose de rellenar todos los espacios entre la placa de imagen y la curvatura del cráneo. Coloque una gota del acelerador de pegamento dentro de la ventana.Luego, limpie rápidamente el exceso. Deje secar el pegamento una vez que se haya secado completamente. Utilizando un taladro dental equipado con una fresa de acero inoxidable de 0,7 milímetros, comience a adelgazar el cráneo en la ventana de imagen.Realice perforaciones alternadas con aplicaciones ocasionales de solución salina estéril al 0,9 % para evitar generar demasiado calor en el cráneo. Afile una ventana de cuatro por cuatro milímetros en el cráneo utilizando pequeños movimientos sobre la superficie ósea.Con la fresa dental. Pruebe la delgadez del cráneo con pinzas de extremo romo. La superficie del cráneo se hundirá ligeramente con presión suave.El grosor óptimo del cráneo para la obtención de imágenes está entre 10 y 30 micrómetros. Una vez que el cráneo esté afinado, limpie la ventana de todos los residuos y coloque solución salina sobre el cráneo. Fotografíe la ventana de imagen con una cámara digital montada en un microscopio estereoscópico.La vasculatura cerebral en esta fotografía ayudará a localizar la posición donde colocar la placa de imagen para sesiones posteriores. Transporte al animal al equipo de dos fotones. El animal debe permanecer sobre la manta calefactora y su temperatura corporal debe monitorearse continuamente durante toda la sesión de imagen. Un microscopio de dos fotones con un láser mi tai. Se utiliza una bomba de estado sólido de 10 vatios para obtener la potencia máxima y una unidad confocal Olympus Flow View modificada. El sistema está optimizado para la obtención de imágenes en tejidos profundos y los detectores externos están instalados lo más cerca posible del objetivo para permitir la máxima detección de fluorescencia procedente del cerebro; agregue una gota de solución salina en la ventana de obtención de imágenes utilizando un zoom digital bajo.Identifique un área que contenga neuronas intensamente marcadas utilizando una cámara digital fijada al microscopio. Ips, tome una fotografía del área de imagen. Esto es necesario para regresar a la misma ubicación de imagen en un momento posterior.Obtenga una pila de baja magnificación a través de toda la extensión visible del cerebro que muestre el grado de ramificación dendrítica. Esto se utilizará para localizar el área de imagen en puntos de tiempo posteriores, tanto en vasos sanguíneos como en dendritas. Mantenga su estructura en animales jóvenes y adultos utilizando software de imagen.Aumente la ampliación digital ocho veces, ajuste las coordenadas XY si es necesario y recopile un conjunto de imágenes de alta ampliación, que mostrará la morfología dendrítica detallada, incluyendo las ubicaciones y la estructura de las espinas dendríticas. Tome notas detalladas sobre la recopilación de cada conjunto, incluyendo las coordenadas de panorámica, el rango de recopilación, el tamaño del paso Z y el número de pasos en el conjunto. Estas notas se utilizarán cuando regrese a esta dendrita o axón en un momento posterior.Tras la adquisición de imágenes, retire la placa craneal separándola suavemente de la superficie del cráneo. Utilizando pinzas, elimine el adhesivo residual y limpie el cráneo con solución salina estéril al 0,9 %.Suture la piel sobre el cráneo utilizando hilo de sutura número seis. Limpie el área con etanol al 70 % tras el procedimiento de imagen. Coloque al animal en una jaula limpia bajo una lámpara de calor hasta que despierte y pueda moverse.Luego, devuelva el animal a su jaula original para volver a obtener imágenes del animal en un momento posterior, que puede variar desde dos días hasta varios meses después; retire las suturas y vuelva a abrir la piel de la cabeza. Utilizando métodos asépticos, emplee la imagen digital de la vasculatura cerebral tomada durante la primera cirugía para localizar la ubicación original de imagen. A continuación, fije nuevamente la placa craneal como antes.Utilice una hoja microquirúrgica para retirar suavemente cualquier hueso que pueda haber vuelto a crecer entre los puntos temporales de adquisición de imágenes, si es necesario. Afile con una fresa dental, limpie la ventana de imagen de residuos y aplique una gota de solución salina estéril al 0,9 %. Lleve al animal a un microscopio de dos fotones y localice el área original de adquisición de imágenes utilizando la imagen fluorescente digital tomada durante la sesión anterior.Inicie el programa de vista de flujo. Abra la imagen original con baja magnificación, fije una hoja de transparencia a la pantalla del ordenador y dibuje el patrón principal de los vasos sanguíneos utilizando un rotulador para transparencias. A continuación, abra la imagen en vivo y vuelva a alinear la vasculatura sanguínea con el patrón dibujado en la lámina de transparencia.Retire la transparencia para volver a obtener imágenes de las estructuras ampliadas ocho veces. Abra la serie deseada recopilada de la sesión de imagen anterior. Dibuje la estructura sobre una película de transparencia fijada a la pantalla del ordenador.Aumente el zoom ocho veces a partir de la imagen en vivo y alinee la imagen con la transparencia. Dependiendo de la precisión del alineamiento en baja magnificación, puede ser necesario ajustar ligeramente el ángulo de la imagen; configure las coordenadas de desplazamiento según los parámetros de imagen del primer día, incluyendo el tamaño de paso y el número de imágenes. La reimagen de Zack se puede realizar dos veces. El número de veces que se abre el cuero cabelludo debe limitarse para evitar alterar la integridad del cráneo, lo que resultaría en una resolución de imagen deficiente en ratones que expresan GFP.Se visualizó un subconjunto de células parametales de la capa cinco y los procesos dendríticos correspondientes mediante microscopía de barrido láser de dos fotones in vivo; aquí se muestran dendritas de la corteza visual marcadas con GFP. Esta imagen es una proyección de una única imagen obtenida cada cinco micrómetros desde la PIA hasta una profundidad final de 175 micrómetros. La región enmarcada se muestra aquí con mayor aumento en el día cero y nuevamente en el día cuatro; se comparan imágenes con mayor aumento de una rama dendrítica del día cero y del día cuatro.Estas imágenes muestran espinas estables indicadas por cabezas de flecha blancas, espinas retráctiles perdidas marcadas con cabezas de flecha rojas y nuevas espinas indicadas por cabezas de flecha verdes. Acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes crónicas mediante microscopía de dos fotones en la corteza visual de ratón utilizando una preparación de cráneo delgado. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener especial cuidado durante el proceso de adelgazamiento para evitar daños en el cráneo y en la duramadre subyacente, ya que esto provocará una baja resolución de imagen, y tomar notas detalladas.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video y el protocolo de demostrar cómo la implantación de una cubierta de cristal ventana craneal en los roedores. Estas preparaciones se pueden utilizar para la crónica en vivo de dos fotones de imágenes de la corteza cerebral en escalas de tiempo de meses. También puede ser utilizado para otros tipos de imágenes, incluyendo imágenes ópticas señal intrínseca.

Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos...

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

Mediante la combinación de un pulido y reforzado delgada cráneo (puertos) craneal ventana y glioblastoma (GBM) la inyección de células, se puede observar la iniciación glioma y el crecimiento de las células de GBM inyectados en el cerebro de un ratón vivo longitudinalmente.

Imágenes Glioma Iniciación<em&gt; En Vivo</em&gt; A través de un pulido y reforzado fina calavera ventana craneal

Se presenta un método de creación de una ventana adelgazada cráneo cortical (TSCW) en un modelo de ratón...

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.

Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.

Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos

Aprende a realizar imagen crónica de la corteza visual en ratones mediante preparación de cráneo adelgazado. Este método permite observar la dinámica de espinas dendríticas in vivo y estudiar la plasticidad cortical.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Explorar más videos