Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

El objetivo general de este procedimiento es detectar las respuestas de las células T a los antígenos de interés. Esto se logra codificando primero con anticuerpos de captura. El segundo paso del procedimiento es agregar células y antígenos de interés y luego incubar durante la noche.

El tercer paso del procedimiento es agregar anticuerpos de detección. El paso final del procedimiento es el revelado de la placa con reactivos de sustrato y el análisis de los puntos. En última instancia, se pueden obtener resultados que eligen citocinas de interés a través del análisis de unidades de formación de manchas.

Hola, mi nombre es Dr.Ki Richter y soy instructor de investigación en el Laboratorio del Dr. Wonder Drake en la Universidad de Vanderbilt en la división de Enfermedades Infecciosas. Hoy estamos demostrando la técnica Ellie Spot, también conocida como el ensayo de punto inmunológico ligado a enzimas. El Dr. Isfahan Chambers y Tiffany Cone le demostrarán la técnica hoy.

Con el fin de mantener los estándares de cultivo celular, realice manipulaciones en condiciones estériles en la campana, abra una placa Ally Spot y lave tres veces con PBS. Prepare una solución de recubrimiento del anticuerpo de captura en PBS. Mezcle bien mediante vórtice para mayor comodidad.

Transfiera la solución de anticuerpos a un depósito para el multicanal, el pipeteador y la alícuota de 100 microlitros de solución de recubrimiento en cada uno. Selle bien la placa con perfil y colóquela en un refrigerador durante la noche. Estas placas recubiertas de anticuerpos son buenas durante semanas.

La regla general dicta que se puede usar un plato si todavía queda líquido en los pozos. Para preparar las células para este ensayo, tiñe las células mononucleares de sangre periférica recién aisladas con azul de trien para su viabilidad y cuéntalas: Coloque el pbmc a 2 millones de células por mililitro en nuestros 10 medios e incube durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Para realizar un seguimiento del experimento, etiquete la tapa de la placa Ali con el número de identificación del espécimen, las condiciones del pozo y la fecha.

Lave la placa seis veces con PBS estéril utilizando el método de volcado y secado. Tenga cuidado de no salpicar el plato mientras lo descarga, ya que esto podría hacer que los pozos del plato se vuelvan morados. Agregue nuestros 20 medios a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante una hora.

Mientras se incuba la placa, cuente las células que descansaron durante la noche. Cosechar el pbmc por centrifugación. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en nuestros 10 medios a una concentración de 1 millón de células por mililitro.

Después de la incubación de una hora de la placa ally spot, retire el medio R 20 utilizando el método de volcado y secado. Tenga cuidado de no salpicar el plato mientras lo descarga. Agregue 100 microlitros de suspensión celular a cada uno.

Siga bien el diseño experimental con adición de péptidos y antígenos a los pocillos de prueba correspondientes. Incluir siempre un control negativo de células sin péptidos y también pocillos de control positivo con fitohemaglutinina añadida. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

Lave la placa seis veces con 150 microlitros de un XPBS utilizando el método de volcado y secado. Agregue 100 microlitros de PBS a cada pocillo del plato y coloque el plato en el refrigerador o a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpos de biotina en PBS.

Saque la placa ALI del refrigerador y deseche el PBS arrojándolo a la cesta de basura. Tenga cuidado de no salpicar la placa mientras vierte una alícuota de la solución de anticuerpos de biotina en cada pocillo e incube la placa en la campana de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante una hora. Lave la placa seis veces con PBS usando el método de volcado y secado en el último lavado.

Deja el PBS en el plato ahora. Prepare la solución de anticuerpos STREPTAVIDIN en PBS, asegurándose de agitar la solución en vórtice. Bueno, deseche el último lavado de PBS de los pozos y trace la placa puntual ALI.

Agregue la solución de anticuerpos contra la estreptavidina a cada pocillo e incube la placa en la campana de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante una hora. Para eliminar el exceso de anticuerpo de trevaína, lave la placa seis veces con PBS utilizando el método de volcado y secado en el último lavado, conduzca el PBS en la placa. Dada la sensibilidad a la luz de la solución de sustrato de fosfatasa alcalina B-C-I-P-M-B-T.

Trabaje en la oscuridad al preparar la solución de tallo como lo describen los fabricantes en las instrucciones del kit de sustrato de fosfatasa alcalina, deseche el PBS restante de los pocillos y seque la placa de punto ly. Agregue solución de sustrato a cada pocillo y encienda la luz. Después de cinco a 10 minutos de que se desarrolle el color, permita que los reactivos permanezcan en la placa hasta que las manchas comiencen a ponerse púrpuras y estén bastante oscuras.

Esto tarda hasta 20 minutos. Lave la placa Ali tres veces con agua del grifo y deje secar al aire. Cada placa contiene un control positivo, un control negativo y un péptido de interés realizado como mínimo por duplicado.

Los pocillos de control positivo son de un color púrpura intenso, reflejan una capa confluente de células y apenas tienen un fondo blanco. Los pozos de control negativo no tienen fondo púrpura ni manchas como se esperaba. Los pocillos de muestra de prueba ilustran aquí las respuestas celulares a los péptidos microbianos.

Las manchas moradas representan una sola célula sensible que expresa la citocina de interés al realizar la técnica de la mancha LA. Tenga cuidado de no perforar la membrana con las puntas de las pipetas ni de dejar que la placa se seque, ya que esto dará lugar a un fondo alto.