Name: Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprende a realizar el ensayo ELISPOT para detectar respuestas de células T contra antígenos microbianos específicos. Este método permite cuantificar citocinas mediante unidades formadoras de spots en estudios de inmunología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Apoyado en parte por Vanderbilt CTSA conceder una UL1 RR024975 del Centro Nacional para Recursos de Investigación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo fue financiado por el NIH R01 HL 83839, R01 IA 65744.

Para el siguiente protocolo, que utilizan las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en las células de interés. Sin embargo, este protocolo podrá ser utilizado con otros tipos de células. Realizar el ensayo en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. Día 1: Preparación de las placas y las células <ol><li> Sacar una placa de ELISPOT y abrirlo en el capó. </li><li> Lavar la placa 3 veces con 150 ml de 1X PBS utilizando una pipeta multicanal, si está disponible, pipeteado y otra solo es aceptable. </li><li> Saca un paquete de depósitos y abrirlo en el capó. </li><li> Añadir 2 mg / mL del anticuerpo de captura anti-humano interferón γ, a 11 mL de PBS 1X. Vortex bien. La transferencia de la mezcla de anticuerpos a un depósito. </li><li> Colocar 100 L de la solución de revestimiento en cada pocillo con el multicanal. </li><li> Envuelva el plato en parafina. </li><li> Colocar la placa en el refrigerador durante la noche. Las placas son buenas para la semana. La regla de oro es que si todavía queda líquido en los pozos, la placa se puede utilizar. </li></ol> Preparación de células Si el PBMCs son frescos y luego contar las células e incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2. Para PBMC almacenados en nitrógeno líquido, el deshielo de las células es necesario. El protocolo es el siguiente: <ol><li> Descongele el criovial de las células a 37 ° C baño de agua hasta que esté casi completamente descongelado. </li><li> Inmediatamente resuspender en 5 ml de los medios de comunicación R10. </li><li> Girar durante 5 minutos a 225 x g. </li><li> Volver a suspender de nuevo en 5 ml de los medios de comunicación R10 y contar las células viables con azul de tripano. </li><li> Llevar a la concentración de 2 x 10 6 células / ml en los medios de comunicación R10. </li><li> Descansar durante la noche a 37 º C con CO2 al 5%. </li></ol> Día 2: Configurar la Plata <ol><li> Etiqueta de la tapa la placa con el número de muestras de identificación, las condiciones del pozo, y la fecha. </li><li> Lavar la placa 6 veces con 150 l de PBS estéril 1x con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. Esto podría provocar que los pozos de la placa de color morado. </li><li> Añadir 100 ml de R20 a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Mientras que la placa se está incubando, el recuento de las células que habían descansado durante la noche. </li><li> Haga girar la suspensión de células a 1500 rpm durante 5 minutos. Se decanta el sobrenadante y resuspender el precipitado para que tenga una concentración final de 1x10 6 células por 1 mL en los medios de comunicación R10. </li><li> Después de la incubación de 1 hora, retirar el R20 con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. </li><li> Añadir 100 ml de solución de células (10 5 células) a cada pocillo. Añadir péptidos apropiado y / o los antígenos de los pocillos correspondientes por duplicado. Use una nueva punta cada vez que entra en la solución de péptido de trabajo. Concentración de péptido normal es de 10-40 mg / ml. Desde péptidos varían, cada investigador debe valorar péptidos para obtener resultados óptimos. </li><li> En los pocillos de control negativo, sólo agregar celdas (sin péptidos) </li><li> En los pocillos de control positivo, añadir la fitohemaglutinina (PHA, 10 mg / ml, Sigma). </li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C con 5% de CO 2 (~ 18 horas). </li></ol> Día 3: El desarrollo de la Plata <ol><li> Lavar la placa 6 veces con 150 l 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia. </li><li> Añadir 100 ml de PBS en cada pocillo de la placa con la pipeta multicanal. </li><li> Coloque el plato en el refrigerador durante 15 minutos. </li><li> Tome la placa de la nevera y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos. </li><li> Prepare la solución de anticuerpos con biotina <ul><li> Añadir 0,5 mg / ml de anticuerpos con biotina (MAB 7-B6-1) a 11ml de PBS. </li><li> Vortex la solución para mezclar bien. </li><li> Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito. </li></ul></li><li> Deseche el PBS accionando a la papelera. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. </li><li> Colocar 100 L de la solución en cada pocillo. </li><li> Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante una hora. </li><li> Se lava la placa 6 veces con 150μL 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 º, salir de la PBS en el plato hasta que haya preparado el anticuerpo estreptavidina. </li><li> Prepare el anticuerpo estreptavidina. <ul><li> Añadir 5,5 μ l estreptavidina anticuerpos (estreptavidina-fosfatasa alcalina) de 11ml de PBS (dilución 1:2000). </li><li> Vortex la solución para mezclar bien. </li><li> Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito. </li></ul></li><li> Deseche el resto de PBS en los pocillos y secar la placa. </li><li> Añadir 100 ml de la solución de estreptavidina a cada pocillo. </li><li> Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Lavar las placas 6 veces con PBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 º, salir de la PBS en el plato hasta que haya hecho la solución de color. </li><li> Trabajar en la oscuridad. Prepare la solución de sustrato de fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina sustrato Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato 1 a 11 ml de tampón Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 2 a Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 3 a Tris, vórtice bien. </li></ul></li><li> Deseche el resto de PBS y secar la placa. </li><li> Añadir 100 ml de la solución de color a cada pocillo de la placa con el multicanal. </li><li> Encienda la luz después de 5 a 10 minutos de color en desarrollo. </li><li> Dejar que los reactivos de color de permanecer en el plato hasta que las manchas comienzan a volverse púrpura y son bastante oscuras. Esto debe tomar entre 5 y 20 minutos. Tenga cuidado de no dejar la solución del sustrato en mucho tiempo, ya que hacerlo podría causar ruido de fondo alto. </li><li> Lavar la placa ELISPOT 3 veces con agua del grifo. </li><li> Dejar secar por una hora o toda la noche. </li><li> Lea la placa de forma manual o con lector de placas ELISPOT. </li><li> Guarde la placa en una caja lejos de la luz. </li></ol> Los resultados representativos: ELISPOT está diseñado para cuantificar la respuesta inmune contra los antígenos microbianos. Cada punto indica una célula de respuesta único, que expresa la citoquina de interés. Las manchas pueden ser contados manualmente o con un lector de placas ELISPOT. Evaluación que el ELISPOT se ha realizado correctamente debe comenzar con la investigación del control negativo para la producción de la citoquina de fondo de interés. En los pozos de control negativo se podría esperar para ver sin puntos, aunque un poco de fondo (color morado) pueden estar presentes. Por lo general, no debe ser inferior a un promedio de cinco puntos por cada pozo. El control de los pozos positivos confirman que la reacción se ha realizado correctamente, y que las células responden a la estimulación antigénica. En los pocillos de control positivo que se puede esperar para ver un fondo de color morado oscuro, debido a una confluencia de puntos (Fig. 1). Debe haber poco o ningún fondo blanco. Si el control positivo y las muestras de control negativo son adecuados, uno puede contar con los pozos que contienen el antígeno de interés. A "subóptima" resultado sería reflejada por el fondo de alto (los pozos son de color púrpura), sin manchas o puntos muy pocos, el centro en blanco, puntos mal definidos o manchas confluentes. Una lista de consejos para solucionar problemas es siempre (Tabla 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un representante de la placa de ELISPOT. Cada plato debe contener un control positivo, control negativo y el péptido de interés llevado a cabo en el mínimo de dos pozos. C9, C10, D9 y D10 son los pocillos de control positivo, como se puede ver que hay un profundo color púrpura, las células confluentes y casi ningún fondo blanco. Los pozos de control negativo son G11, G12, H11 y H12. Estos pozos no tienen fondo morado y sin manchas como se esperaba. Los puntos del G7, el G8, H7 y H8, ilustran las respuestas celulares a péptidos microbianos, los puntos púrpura representan una sola célula que expresa la respuesta de citoquinas de interés. Tabla 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Observación </td><td> Problema Posible </td><td> Solución posible </td></tr><tr><td> De fondo de alta </td><td> 1. Ambos lados de la membrana no se lava correctamente 2. Demasiadas células secretoras de citoquinas 3. Placa no se seca correctamente 4. Sobre la placa de desarrollo </td><td> 1. Lave ambos lados de la membrana con agua destilada antes y después del desarrollo del color. Los reactivos pueden filtrarse a través de la membrana en la base de la placa, y estas pueden causar ruido de fondo alto si no se enjuaga. 2. Reducir el número de células por pozo, para ello será necesario la optimización 3. Secar la placa ya antes de leer 4. Reducir el tiempo de desarrollo </td></tr><tr><td> Sin manchas / manchas muy pocos </td><td> 1. No hay suficientes células secretoras de citoquinas / proteína de interés 2. Asegúrese de que las células son estimuladas correctamente 3. Las células no se incubaron durante long suficiente o puede tomar un tiempo para responder a los estimulantes 4. El desarrollo del color inadecuado 5. Anticuerpos no lo suficiente como primarios o secundarios </td><td> 1. Aumentar el número de células. Para ello será necesario la optimización 2. También utiliza un control de estímulos positivos - un estimulante que sabe que inducen la expresión de su citoquinas / proteína de interés 3. Aumentar el tiempo de incubación de células o el uso del método indirecto (pre-tratamiento de las células con estimulantes) 4. Monitorear el desarrollo de color con un microscopio de los gastos generales y garantizar que los reactivos en desarrollo han sido almacenados correctamente y no han perdido la actividad 5. La concentración del anticuerpo primario y / o secundaria será necesario un aumento. Para ello será necesario la optimización. </td></tr><tr><td> Las áreas en blanco </td><td> 1. Membrana no tratados previamente 2. La membrana se ha secado en algún momento 3. Células distribuidas de manera desigual </td><td> 1. Asegúrese de que la membrana está adecuadamente tratados previamente con etanol al 70% (todas las membranas no es necesario esto para que consulte con su proveedor). Lavar bien con PBS 3 veces después 2. Asegúrese de que la membrana no se seca 3. Asegúrese de mezclar las células con cuidado para tener una buena suspensión celulares homólogos antes de pipetear a cabo en los pozos </td></tr><tr><td> Centro de blanco </td><td> 1. Los daños causados ​​por el lavado </td><td> 1. Velocidad de flujo en la lavadora automática (o pipeta) puede ser demasiado alto. Necesidad de un procedimiento de lavado más suave </td></tr><tr><td> Falsos Positivos </td><td> 1. Agregados secundaria de anticuerpos 2. Las células todavía en la membrana 3. La contaminación de células cultura </td><td> 1. Filtro de la secundaria de anticuerpos 2. Asegúrese de que todos se lavan las células de la membrana con PBS Tween 20 antes de la incubación del anticuerpo secundario. Las células de la izquierda en la membrana se dan en forma de manchas irregulares 3. Mantenga los reactivos como estéril y limpia como sea posible. Asegúrese de que su técnica de cultivo celular es aséptico. Compruebe que los falsos positivos mediante la ejecución de un control de los medios de comunicación negativa. De movimiento de las placas, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">ver los puntos mal definidos</a> </td></tr><tr><td> Las manchas confluentes </td><td> 1. Revestimiento de los pobres, los anticuerpos demasiado 2. Cultivo celular prolongada 3. Células sobre-estimulado </td><td> 1. Reducir la concentración del anticuerpo primario 2. Cuanto más tiempo se incuban las células, más citoquinas / proteínas que se secretan. Esto se traducirá en grandes manchas que comienzan a fusionarse y se vuelven indistinguibles. 3. Reducir el cultivo de células de paso el tiempo de incubación. La sobre-estimulación se traducirá en una gran cantidad de citoquinas / proteína secretada por la célula. Esto producirá manchas que comienzan a fusionarse y se vuelven indistinguibles. Reducir la cantidad de estimulantes en los medios de cultivo o de la cultura para un corto período de tiempo </td></tr><tr><td> Puntos mal definidos </td><td> 1. Membrana no tratados previamente (si la membrana requiere de esto, consulte con el proveedor) 2. Placa de movimiento durante la incubación de células </td><td> 1. La membrana debe ser pre-tratados con etanol o esto puede resultar en manchas difusas, mal definidas. Será difícil para el lector para distinguir estos 2. No permita que la placa se mueva durante la incubación de células como las células que se han movido a crear más de un punto. Si es posible utilizar una incubadora dedicada que no se abran durante la incubación. No toque la placa después de la adición de las células </td></tr><tr><td> Positivos de control de los pozos es baja </td><td> 1. Subdesarrollo - puede ser un resultado del uso de estreptavidina-fosfatasa alcalina y / o soluciones BCIP / NBT que no han sido llevados a la temperatura ambiente </td><td> 1. Llevar los reactivos a temperatura ambiente antes de añadir a los pozos </td></tr><tr><td> La densidad de los puntos hace que sea difícil cuantificarlos </td><td> 1. Muchas células se han añadido a los pozos </td><td> 1. Hacer diluciones de las células (es decir, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 células por pozo) para determinar el número óptimo de las células que darán lugar a la formación de manchas de distintos </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
<li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li>
<li>Kim, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li>
<li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li>
<li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li>
<li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li>
<li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+differentiated%2C+resting+gn-specific+memory+CD8%2B+T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li>
<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

El ensayo de ELISPOT se ha convertido en uno de los ensayos más importantes y ampliamente utilizado para controlar las respuestas inmunitarias en el ser humano y una variedad de otras especies. Con el ensayo de ELISPOT, las frecuencias de las células inmunitarias se puede medir a nivel celular individual sin la expansión o la manipulación de las poblaciones de células. ELISPOT se ha aplicado ampliamente para investigar antígeno de respuestas inmunes específicas en varias enfermedades, incluyendo infecciones, cáncer, ale...

A. Preparación de los medios de comunicación <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="A los materiales"> B. Preparación de Tris Buffer <ol><li> Añadir 800 ml de ddH2O de vaso de 1 litro. </li><li> Medida 12 gramos de Tris y añadir a la jarra. </li><li> Añadir 0,12 gramos de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl 2: 6H 2 O) en el vaso. </li><li> Remover con la varilla de agitación magnética en la placa de agitación automática. </li><li> Una vez disuelto, el pH de la solución a 9,5. </li><li> Añadir 200 ml de ddH2O al vaso, con lo que hasta 1000 ml. </li><li> Filtrar la solución con un filtro de 0,22 micras. </li></ol> C. necesarios para el análisis ELISPOT Materiales: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Materiales B">

enzima-inmunoensayo de ensayo (elispot): la cuantificación de la th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

La inmunidad adaptativa es un componente importante a la limpieza de patógenos intracelulares. La capacidad para detectar y cuantificar estas respuestas en los seres humanos es una herramienta diagnóstica importante. El ensayo de la enzima-inmunoensayo (ELISPOT) está ganando popularidad por su capacidad para identificar la respuesta inmune celular contra antígenos microbianos, incluyendo las poblaciones inmunodeprimidas como las infectadas por el VIH, el trasplante, y el uso de esteroides. Este ensayo tiene la capacidad de cuantificar la respuesta inmune contra antígenos microbianos específicos, así como distinguir si estas respuestas son Th1 o Th2 en el carácter. ELISPOT no se limita a la zona de la inflamación. Es versátil en su capacidad para evaluar la respuesta inmune en la sangre periférica, así como los sitios de participación activa, como lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, y ascitis. La detección de la respuesta inmune contra un antígeno único o múltiple es posible, así como epítopos específicos dentro de las proteínas microbianas. Este ensayo permite la detección de la respuesta inmune con el tiempo, así como las diferencias en los antígenos reconocidos por las células T de acogida. Doble ELISPOT color están disponibles para la detección de la expresión simultánea de dos citoquinas. Las recientes aplicaciones de esta técnica incluyen el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar, así como la investigación de la contribución de los antígenos infecciosas a las enfermedades autoinmunes.

Identificación de objetivos microbiana de la inmunidad adaptativa en las enfermedades idiopáticas se puede lograr mediante el uso de la prueba de inmunoensayo enzimático.

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

La inmunidad adaptativa es un componente importante para la eliminación de patógenos intracelulares. La capacidad de detectar y cuantificar estas respuestas en humanos es un...

El objetivo general de este procedimiento es detectar las respuestas de linfocitos T frente a antígenos de interés. Esto se logra primero mediante la codificación con anticuerpos de captura. El segundo paso del procedimiento consiste en añadir células y los antígenos de interés, y luego incubar durante la noche.El tercer paso del procedimiento consiste en añadir los anticuerpos de detección. El paso final del procedimiento es desarrollar la placa con reactivos sustrato y analizar los puntos. Finalmente, se pueden obtener resultados que identifiquen citocinas de interés mediante el análisis de las unidades formadoras de puntos.Hola, mi nombre es la Dra. Ki Richter y soy instructora de investigación en el laboratorio de la Dra. Wonder Drake en la Universidad de Vanderbilt, en la división de Enfermedades Infecciosas. Hoy vamos a demostrar la técnica de Elispot, también conocida como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en placas. Las doctoras Isfahan Chambers y Tiffany Cone demostrarán la técnica para ustedes hoy.Para mantener los estándares de cultivo celular, realice las manipulaciones en condiciones estériles dentro de la campana, abra una placa con pocillos y lávela tres veces con PBS. Prepare una solución de recubrimiento del anticuerpo de captura en PBS. Mezcle bien mediante vortex para mayor comodidad.Transfiera la solución de anticuerpo a un depósito para el pipeteador multicanal y reparta 100 microlitros de solución de recubrimiento en cada pozo. Selle bien la placa con perfil y colóquela en el refrigerador durante la noche. Estas placas recubiertas con anticuerpo son estables durante semanas.La regla general indica que una placa puede utilizarse si aún queda líquido en los pocillos. Para preparar las células para este ensayo, tiña con azul de tripano los linfocitos mononucleares periféricos recién aislados para evaluar la viabilidad y cuéntelos. Siembre los PBMC a 2 millones de células por mililitro en nuestro medio 10 y incube durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Con el fin de llevar un control del experimento, etiquete la tapa de la placa para ELISpot con el número de identificación de la muestra, las condiciones de los pocillos y la fecha.Lave la placa seis veces con PBS estéril utilizando el método de vaciar y absorber. Tenga cuidado de no salpicar la placa al vaciar, ya que esto podría hacer que los pocillos de la placa se vuelvan púrpuras. Añada 20 medios a cada pocillo e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora.Mientras la placa está en incubación, cuente las células que fueron reposadas durante la noche. Recupere los PBMC mediante centrifugación. Decante el sobrenadante y resuspenda el sedimento en nuestro medio 10 a una concentración de 1 millón de células por mililitro.Tras la incubación de una hora de la placa de puntos con alilo, retire el medio R 20 mediante el método de vertido y secado. Tenga cuidado de no salpicar la placa al verter. Añada 100 microlitros de suspensión celular a cada pocillo.Siga el diseño experimental añadiendo péptidos y antígenos a los pocillos de prueba correspondientes. Incluya siempre un control negativo de células sin péptidos y también pocillos de control positivo con fitohemaglutinina añadida. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Lave la placa seis veces con 150 microlitros de XPBS uno utilizando el método de vaciado y absorción. Añada 100 microlitros de PBS a cada pocillo de la placa y coloque la placa en el refrigerador o a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpo biotinilado en PBS.Saque la placa de puntos ALI del refrigerador y deseche el PBS agitándola sobre el recipiente de desechos. Tenga cuidado de no salpicar la placa al verter un alícuota de la solución de anticuerpo biotinilado en cada pocillo e incube la placa en la cabina de cultivo celular a temperatura ambiente durante una hora. Lave la placa seis veces con PBS utilizando el método de vaciado y absorción, aplicando este método también en el último lavado.Deje el PBS en la placa ahora. Prepare la solución de anticuerpo ESTREPTAVIDINA en PBS, asegurándose de mezclar bien mediante vortex. Descarte la última lavada de PBS de los pocillos y trace la placa de puntos ALI.Añada la solución de anticuerpo estreptavidina a cada pocillo e incube la placa en la campana de cultivo celular a temperatura ambiente durante una hora. Con el fin de eliminar el anticuerpo trevain en exceso, lave la placa seis veces con PBS utilizando el método de vertido y secado, dejando el PBS sobre la placa en el último lavado. Dada la sensibilidad a la luz de la solución sustrato de fosfatasa alcalina B-C-I-P-M-B-T.Trabaje en la oscuridad al preparar la solución de sustrato según lo indicado por los fabricantes en las instrucciones del kit de sustrato de fosfatasa alcalina; deseche el PBS restante de los pocillos y seque suavemente la placa con los puntos de lisado. Añada la solución de sustrato a cada pocillo y encienda la luz. Después de cinco a 10 minutos de desarrollo del color, deje que los reactivos permanezcan en la placa hasta que los puntos comiencen a volverse púrpura y estén bastante oscuros.Esto lleva hasta 20 minutos. Lave la placa de manchas Ali tres veces con agua del grifo y deje secar al aire. Cada placa contiene un control positivo, un control negativo y el péptido de interés, realizados al menos por duplicado.Los pocillos de control positivo presentan un color morado intenso que refleja una capa de células confluente y casi ningún fondo blanco. Los pocillos de control negativo no tienen fondo morado ni manchas, tal como se esperaba. Los pocillos de las muestras de prueba ilustran las respuestas celulares a péptidos microbianos aquí.Los puntos morados representan una única célula sensible que expresa la citocina de interés al realizar la técnica LA spot. Tenga cuidado de no perforar la membrana con las puntas de pipeta ni permitir que su placa se seque, ya que esto provocará un fondo elevado.

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Caracterizar los epítopos de células T de patógenos que causan infecciones localizadas, como el virus del papiloma humano, es un desafío debido al número limitado de células T en circulación. Se describe un método mediante el cual se aislaron y caracterizaron células T raras a partir de un número muy pequeño de células.

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

Este vídeo demuestra el uso del ensayo ELISpot para evaluar la función de los linfocitos B secretores de anticuerpos, ASCs. Los anticuerpos secretados por las ASC interactúan con los fragmentos de anticuerpos policlonales unidos a la membrana, que son detectados por los anticuerpos IgG o IgM conjugados con enzimas. La mancha de color producida en cada pocillo indica la presencia del isotipo del anticuerpo específico, que se correlaciona con la actividad secretora de las células B.

Evaluación funcional de linfocitos B secretores de anticuerpos mediante el ensayo ELISpot

Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).

Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

Cultivaron interferón-γ ensayo inmunospot ligado a enzimas a largo plazo se utiliza como una medida de respuestas de memoria centrales y se correlaciona con respuestas a la vacuna anti-micobacterianas protectoras. Con este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica son estimulados con antígenos de micobacterias y la interleucina-2 durante 14 días, permitiendo la diferenciación y expansión de las células T de memoria centrales.

Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

QA-1 (HLA-E en humanos) pertenece a un grupo de moléculas de histocompatibilidad no clásicas complejas 1b. Inmunización con epítopos de Unión-1-control de calidad se ha demostrado para aumentar la regulación inmune del tejido específico y mejorar varias enfermedades autoinmunes. Adjunto describimos una estrategia de biblioteca de péptidos superpuestas para la identificación de los epitopos de Qa-1 en una proteína.

Biblioteca de péptido superpuestas a epitopos Qa-1 en una proteína

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

El desarrollo de la prueba de interferón-gamma ELISpot para conejillo de Indias PBMCs permite la caracterización de las respuestas de células T en este modelo altamente relevante para el estudio de las enfermedades infecciosas. Hemos aplicado el ensayo para medir las respuestas de células T asociadas con entrega intradérmica de vacunas de ADN.

Optimizado de interferón-gamma ELISpot análisis a las respuestas de la célula de T de medida en el modelo de conejillo de Indias después de la vacunación

Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

Aprende a realizar el ensayo ELISPOT para detectar respuestas de células T contra antígenos microbianos específicos. Este método permite cuantificar citocinas mediante unidades formadoras de spots en estudios de inmunología.

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Explorar más videos