Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

El objetivo general de este procedimiento es detectar las respuestas de linfocitos T frente a antígenos de interés. Esto se logra primero mediante la codificación con anticuerpos de captura. El segundo paso del procedimiento consiste en añadir células y los antígenos de interés, y luego incubar durante la noche.

El tercer paso del procedimiento consiste en añadir los anticuerpos de detección. El paso final del procedimiento es desarrollar la placa con reactivos sustrato y analizar los puntos. Finalmente, se pueden obtener resultados que identifiquen citocinas de interés mediante el análisis de las unidades formadoras de puntos.

Hola, mi nombre es la Dra. Ki Richter y soy instructora de investigación en el laboratorio de la Dra. Wonder Drake en la Universidad de Vanderbilt, en la división de Enfermedades Infecciosas. Hoy vamos a demostrar la técnica de Elispot, también conocida como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en placas. Las doctoras Isfahan Chambers y Tiffany Cone demostrarán la técnica para ustedes hoy.

Para mantener los estándares de cultivo celular, realice las manipulaciones en condiciones estériles dentro de la campana, abra una placa con pocillos y lávela tres veces con PBS. Prepare una solución de recubrimiento del anticuerpo de captura en PBS. Mezcle bien mediante vortex para mayor comodidad.

Transfiera la solución de anticuerpo a un depósito para el pipeteador multicanal y reparta 100 microlitros de solución de recubrimiento en cada pozo. Selle bien la placa con perfil y colóquela en el refrigerador durante la noche. Estas placas recubiertas con anticuerpo son estables durante semanas.

La regla general indica que una placa puede utilizarse si aún queda líquido en los pocillos. Para preparar las células para este ensayo, tiña con azul de tripano los linfocitos mononucleares periféricos recién aislados para evaluar la viabilidad y cuéntelos. Siembre los PBMC a 2 millones de células por mililitro en nuestro medio 10 y incube durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Con el fin de llevar un control del experimento, etiquete la tapa de la placa para ELISpot con el número de identificación de la muestra, las condiciones de los pocillos y la fecha.

Lave la placa seis veces con PBS estéril utilizando el método de vaciar y absorber. Tenga cuidado de no salpicar la placa al vaciar, ya que esto podría hacer que los pocillos de la placa se vuelvan púrpuras. Añada 20 medios a cada pocillo e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora.

Mientras la placa está en incubación, cuente las células que fueron reposadas durante la noche. Recupere los PBMC mediante centrifugación. Decante el sobrenadante y resuspenda el sedimento en nuestro medio 10 a una concentración de 1 millón de células por mililitro.

Tras la incubación de una hora de la placa de puntos con alilo, retire el medio R 20 mediante el método de vertido y secado. Tenga cuidado de no salpicar la placa al verter. Añada 100 microlitros de suspensión celular a cada pocillo.

Siga el diseño experimental añadiendo péptidos y antígenos a los pocillos de prueba correspondientes. Incluya siempre un control negativo de células sin péptidos y también pocillos de control positivo con fitohemaglutinina añadida. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Lave la placa seis veces con 150 microlitros de XPBS uno utilizando el método de vaciado y absorción. Añada 100 microlitros de PBS a cada pocillo de la placa y coloque la placa en el refrigerador o a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpo biotinilado en PBS.

Saque la placa de puntos ALI del refrigerador y deseche el PBS agitándola sobre el recipiente de desechos. Tenga cuidado de no salpicar la placa al verter un alícuota de la solución de anticuerpo biotinilado en cada pocillo e incube la placa en la cabina de cultivo celular a temperatura ambiente durante una hora. Lave la placa seis veces con PBS utilizando el método de vaciado y absorción, aplicando este método también en el último lavado.

Deje el PBS en la placa ahora. Prepare la solución de anticuerpo ESTREPTAVIDINA en PBS, asegurándose de mezclar bien mediante vortex. Descarte la última lavada de PBS de los pocillos y trace la placa de puntos ALI.

Añada la solución de anticuerpo estreptavidina a cada pocillo e incube la placa en la campana de cultivo celular a temperatura ambiente durante una hora. Con el fin de eliminar el anticuerpo trevain en exceso, lave la placa seis veces con PBS utilizando el método de vertido y secado, dejando el PBS sobre la placa en el último lavado. Dada la sensibilidad a la luz de la solución sustrato de fosfatasa alcalina B-C-I-P-M-B-T.

Trabaje en la oscuridad al preparar la solución de sustrato según lo indicado por los fabricantes en las instrucciones del kit de sustrato de fosfatasa alcalina; deseche el PBS restante de los pocillos y seque suavemente la placa con los puntos de lisado. Añada la solución de sustrato a cada pocillo y encienda la luz. Después de cinco a 10 minutos de desarrollo del color, deje que los reactivos permanezcan en la placa hasta que los puntos comiencen a volverse púrpura y estén bastante oscuros.

Esto lleva hasta 20 minutos. Lave la placa de manchas Ali tres veces con agua del grifo y deje secar al aire. Cada placa contiene un control positivo, un control negativo y el péptido de interés, realizados al menos por duplicado.

Los pocillos de control positivo presentan un color morado intenso que refleja una capa de células confluente y casi ningún fondo blanco. Los pocillos de control negativo no tienen fondo morado ni manchas, tal como se esperaba. Los pocillos de las muestras de prueba ilustran las respuestas celulares a péptidos microbianos aquí.

Los puntos morados representan una única célula sensible que expresa la citocina de interés al realizar la técnica LA spot. Tenga cuidado de no perforar la membrana con las puntas de pipeta ni permitir que su placa se seque, ya que esto provocará un fondo elevado.