El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

El objetivo general de esta metodología ELISpot es permitir la cuantificación de las células B secretoras de anticuerpos humanos de la sangre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico sobre la inmunología de las células B y la investigación de vacunas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección y medición de células B secretoras de anticuerpos a nivel de una sola célula.

Tsung-Chih Tseng, un estudiante graduado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Inmediatamente después de obtener una muestra de sangre de 10 ml de la vena cubital mediana en un tubo de 15 ml que contiene EDTA suplementado con potasio, invierta el tubo varias veces para evitar la formación de coágulos. A continuación, añada 35 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos esterilizado en autoclave a las células para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.

Cuando se pueda observar la luz a través del tubo, centrifugar la sangre y confirmar la presencia de una bolita blanca. Retire el tampón de lisis residual con 10 ml de PBS esterilizado en autoclave y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio RPMI 1640. Coloque las células en una placa de cultivo de 10 cm para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono.

A continuación, agite suavemente la placa de cultivo unas cuantas veces y transfiera las células flotantes a un tubo cónico de plástico de 15 ml. Después de dos lavados por centrifugación, vuelva a suspender el pellet de cinco a 10 veces la décima parte de la concentración de seis células por ml en 200 microlitros de tampón PBS frío y agregue 5 microlitros de cóctel de anticuerpos antihumanos biotinilados específico para células sanguíneas por una décima parte de las seis células. Después de una incubación de 30 minutos en hielo, lave las células en un volumen 10 veces superior de PBS estéril y vuelva a suspender el pellet en cinco microlitros de microesferas conjugadas con estreptavidina por una décima parte de las seis células para una incubación de 30 minutos en hielo.

Al final de la incubación, agregue dos ml de tampón PBS a las células y coloque el tubo en un soporte magnético durante ocho minutos a temperatura ambiente. Cuando las microperlas se hayan adherido a la pared del tubo, transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo cónico y agregue 2 ml más de tampón PBS a las células. Después de la segunda recolección de sobrenadante, recoja las células agrupadas por centrifugación y transfiera las células a un tubo de poliestireno de cinco ml y tampón PBS fresco a una concentración de una décima de las siete células por ml.

Después de preformar el bloqueo no específico, agregue un microgramo de cada anticuerpo de selección por una décima parte de las seis células al tubo con una mezcla suave para una incubación de 30 minutos en hielo. Durante los últimos cinco minutos de la incubación, agregue cinco microlitros de 7-AAD a las células. A continuación, añada dos mililitros de PBS fresco a las células y al vórtice antes de centrifugar.

Vuelva a suspender el pellet en un tampón de clasificación fresco a una décima parte de una a cinco veces la concentración de siete celdas por mililitro y filtre las celdas a través de un colador de celdas de 40 micras en un nuevo tubo de poliestireno de cinco mililitros. A continuación, clasifique las células por citometría de flujo en tres tubos de 15 ml que contengan 5 ml de medio RPI fresco para recoger las células B vírgenes, las células B de memoria y las células plasmáticas de plasmablasto. Cuando se hayan cosechado todas las células, siembre los subconjuntos en pocillos individuales de una placa de cultivo celular de 12 pocillos a una concentración de una a diez veces la décima de la quinta célula por mililitro en medio RPMI fresco.

A continuación, active las células B con cinco microgramos de CPG ODN 2006 por una décima de las seis células por mililitro por pocillo en la incubadora de cultivo celular durante cinco días. Al final de la activación, agregue 30 microlitros de etanol al 35% y agua destilada a cada pocillo de las placas ELISpot durante 30 segundos. Luego, reemplace el etanol en cada pocillo con 150 microlitros de agua destilada doble esterilizada en autoclave e incube las placas a temperatura ambiente durante cinco minutos para eliminar el etanol residual.

Realizar un lavado de PBS seguido de la adición de 50 microlitros del fragmento policlonal FAB2 de IG antihumano a cada pocillo. Lave los platos dos veces con PBS como se acaba de demostrar. Bloquee el aglutinante no específico en cada pocillo con 200 microlitros de PBS fresco con BSA durante dos horas a temperatura ambiente.

Después de otra serie de lavado PBS, incubar los pocillos en 100 microlitros de medio RPMI 1640 fresco a 37 grados centígrados. A continuación, sustituya el medio de cada pocillo ELISpot por el número adecuado de células B activadas. Lleve el volumen final de cada pocillo a 150 microlitros con medio RPMI fresco y luego devuelva la placa ELISpot a la incubadora de cultivo celular durante ocho a 14 horas.

Al final del período de incubación, deseche el medio y lave los pocillos con 200 microlitros de PBS más tween20 durante cinco lavados de tres minutos. Tras el último lavado, añadir los anticuerpos de detección adecuados a sus pocillos correspondientes e incubar las placas durante dos horas en la oscuridad. Después de otra serie de lavado de PBS, agregue 50 microlitros de sustrato BCIPMBT a cada pocillo durante cinco a 15 minutos a temperatura ambiente.

Cuando aparezcan manchas moradas, detenga la reacción con 100 microlitros de agua destilada doble por pocillo y enjuague la placa con agua corriente del grifo. A continuación, seque al aire la membrana ELISpot protegida de la luz. En esta muestra de PBMC de donante, después de la lisis de los glóbulos rojos y el agotamiento de las células adherentes, alrededor del 10 por ciento de los linfocitos eran células B CD19 positivas.

En el compartimento de las células B, alrededor del 50 por ciento de las células eran células B CD27 negativas y vírgenes y el 50 por ciento eran células B de memoria que expresaban CD27. El tratamiento con CPG de células B humanas purificadas y CD19 + CD27 + durante cinco días, como se acaba de demostrar, generalmente da como resultado la generación de 50 a 200 IgM y 10 a 50 células secretoras de anticuerpos IgG de una vez diez a la cuarta célula B activada. Una vez dominada, esta técnica ELISpot puede completarse en tres horas si se realiza correctamente.

Antes de comenzar este procedimiento, es importante recordar codificar el lugar con reactivos de captura apropiados para detectar las células secretoras de anticuerpos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la vacunología exploraran la eficacia de la vacuna en ensayos a gran escala y seguimientos longitudinales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar las células B humanas de la sangre.

Separe las células B ingenuas de las de memoria para su diferenciación y realice un ensayo ELISpot para calificar las células secretoras de anticuerpos. No olvide que trabajar con sangre humana puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar este procedimiento.