Cuantificación de la carga bacteriana tisular en un modelo murino de infección intestinal crónica

Comienza con un ratón eutanasiado infectado con una cepa bacteriana resistente a los antibióticos que modela una infección intestinal crónica.

Expone la cavidad abdominal para acceder al ceco y al bazo.

Extrae los tejidos cecal y esplénico, que representan los sitios intestinales y sistémicos de colonización bacteriana.

Coloca cada pañuelo en un tubo separado que contiene un amortiguador y una perla de acero.

Homogeneizar el tejido agitando rápidamente los tubos, haciendo que las perlas de acero choquen con el tejido, lo descompongan y liberen bacterias en la suspensión.

Realizar diluciones en serie de los homogeneados en el tampón para reducir la concentración bacteriana.

Alicotas de placa de cada dilución sobre agar nutritivo suplementado con un antibiótico para recuperar selectivamente bacterias resistentes a los antibióticos.

Incuba las placas para permitir que las bacterias viables crezcan en colonias.

Cuenta las colonias para estimar el número de bacterias viables por gramo de tejido y compara las cargas bacterianas en el ceco y el bazo.

Primero, coloca microtubos de fondo redondo de 2 mililitros con cierre seguro, añade 1 mililitro de PBS estéril y una perla de acero inoxidable autoclave a cada tubo. Prepesa los tubos antes de la recogida de tejido.

Después de eutanasiar a ratones, reseca sus tejidos cecal y esplénico, asegurándote de recoger tejido de animales individuales en tubos separados. Pesa cada tubo para determinar el peso del tejido.

Utiliza un aparato de mezclador para homogeneizar los tejidos a 30 hercios durante 15 minutos. Luego, transfiere 900 microlitros de PBS a cada pozo de un megabloque de 96 pozos de 2 mililitros. Pipetear 100 microlitros de tejido se homogenea en el primer pozo y mezclar bien.

Realizar diluciones en serie añadiendo 100 microlitros a los pozos posteriores, hasta obtener una dilución de 10 elevado a la sexta dilución negativa. La lámina 10 microlitros de cada dilución triplica sobre agar LB que contiene estreptomicina. Luego, cuenta las unidades formadoras de colonias promedio y determina las unidades formadoras por gramo de tejido según lo establecido en el protocolo de texto.