El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

El objetivo general de este procedimiento es hacer crecer biopelículas bacterianas bajo o moderado utilizando un reactor de biopelícula de flujo de goteo o un reactor de disco giratorio. Los cupones de la biopelícula reaccionan cuando se inoculan primero con bacterias y se incuban a 37 grados centígrados para permitir que las células bacterianas se adhieran a las superficies de crecimiento. Una vez que las células se han unido a los cupones, se inicia un flujo de medios de crecimiento que produce una fuerza pura que opera durante el desarrollo de la biopelícula.

A continuación, se pueden cosechar biopelículas maduras para su análisis y observación. El uso de microscopía electrónica de barrido se puede realizar para determinar la ultra estructura de las biopelículas producidas. Soy Blaze Balls.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como las celdas de flujo, es que se logra fácilmente una alta producción de biomasa y múltiples biopelículas idénticas. Rachel Stevenson y Kelly Schwartz, una técnica y estudiante de posgrado de mi laboratorio, demostrarán este procedimiento. El reactor de biopelícula de flujo por goteo consta de cuatro cámaras con puertos de entrada para la entrada de medios y puertos de salida para la salida de residuos.

Dentro de cada cámara hay un cupón extraíble sobre el que crece la biopelícula. Para ensamblar el reactor de biopelícula de flujo de goteo, coloque los cupones en cada cámara paralela y asegure las tapas de la cámara. Esterilizar el sistema en autoclave el reactor ensamblado, así como el tubo de nutrientes en fluido para esterilizar el sistema antes de su uso.

También autoclave el medio de crecimiento de la biopelícula para inocular el reactor de flujo de goteo esterilizado. Coloque el aparato sobre una superficie plana y sujete las líneas de efluente. A continuación, llene cada cámara con 10 mililitros de medio de crecimiento estéril a base de caldo de soja tríptico y agregue 100 microlitros de staphylococcus aureus.

Cultivo durante la noche cultivado en el mismo medio a cada cámara por separado. Coloque el reactor inoculado en una incubadora a 37 grados centígrados durante 18 horas para permitir que las células se adhieran a la superficie del cupón. Después de la incubación, UNC sujeta la tubería de efluente y coloca el reactor en un cortador de bloques de madera inclinado en un ángulo de 10 grados. Asépticamente.

Conecte el tubo de nutrientes fluido a una botella que contenga caldo de nutrientes de flujo continuo. Pase la línea de tubería a través de la bomba y cebe la tubería haciendo funcionar la bomba a toda velocidad. Una vez que el tubo de fluido esté cebado, detenga la bomba y conecte agujas de una pulgada de calibre 22 en el extremo de cada tubo.

Limpie el tapón de entrada de la cámara con una toallita de etanol y de forma aséptica. Inserte las agujas a través del tapón de entrada. Encienda la bomba y deje que el medio gotee sobre los cupones.

A un caudal de aproximadamente 125 microlitros por minuto, el medio debe fluir hacia abajo desde el puerto del tapón de entrada hasta el puerto de efluente. Operar el reactor en flujo continuo durante tres días. De vez en cuando se comprueba que el reactor tiene un drenaje adecuado.

El drenaje se verifica mediante una inspección visual de las cámaras para garantizar que los medios no se acumulen en las cámaras. Si los medios se acumulan, pellizcan, la tubería de salida generalmente promoverá el drenaje adecuado para recolectar las biopelículas, detener la bomba y quitar las agujas del reactor. A continuación, coloque el reactor sobre una superficie plana.

Después de tres días de flujo continuo, las biopelículas de Staphylococcus aureus aparecen como biomasa amarilla esparcida a lo largo de los cupones inoculados. Una micrografía electrónica de barrido de la biopelícula revela que el Staphylococcus aureus cubre el cupón en una comunidad de biopelículas asociada a la superficie. Con el fin de cuantificar la biomasa obtenida, se utilizan pinzas estériles para eliminar sépticamente los cupones, recolectar las bacterias con un raspador de células y luego transferirlas a un tubo cónico que contiene cinco mililitros de PBS estéril.

Con un pañuelo de papel, el homogeneizador disgrega los grupos bacterianos hasta obtener una suspensión uniforme. Las unidades formadoras de colonias se cuantifican mediante la siembra de diluciones seriadas en placas tríptico de sogar, incubando durante 24 horas a 37 grados centígrados y contando las colonias. El reactor de biopelícula de disco giratorio está compuesto por un chemos stat a través del cual se bombea el medio de crecimiento.

Un disco giratorio con una barra de estrella y 18 cupones diseñados para caber en el disco giratorio. Para ensamblar el reactor primero, cargue los cupones del disco giratorio en las ranuras del disco giratorio. A continuación, coloque el disco cargado dentro de un vaso de precipitados de vidrio de un litro con un puerto de desbordamiento y tape el reactor con un tapón de goma número 15 con un orificio para el flujo de medios y un orificio para la aireación.

Autoclave, el reactor ensamblado y la tubería de entrada para esterilizar el sistema. Para inocular el reactor, llene el vaso con 250 mililitros de medio de cultivo estéril y agregue 500 microlitros de un cultivo nocturno de Staphylococcus aureus cultivado en caldo de soja tríptico. Coloque el reactor en una placa de agitación configurada a 250 rotaciones por minuto e incube durante la noche a 37 grados centígrados para permitir que las células se adhieran a los cupones.

Después de la incubación nocturna, conecte el tubo de entrada al puerto del depósito medio y a la bomba peristáltica. Encienda la bomba y ajuste el caudal a 0,25 mililitros por minuto. Deje que el reactor funcione durante 24 horas a 37 grados centígrados para recolectar las biopelículas resultantes.

Detener el reactor y de forma aséptica. Retire el disco sin tocar los cupones. Con pinzas estériles, retire los cupones y sumerja cuidadosamente cada uno en PBS estéril para eliminar las bacterias sueltas para las pruebas de compuestos antimicrobianos.

Asépticamente, coloque los cupones en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos que contenga compuestos de interés. Incubar la placa durante cuatro horas a 37 grados centígrados. A continuación, transfiera los cupones a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan una vez PBS y disperse las biopelículas con un homogeneizador.

Finalmente, diluciones seriadas en placa de las células en medio de agar nutriente para determinar el número de unidades formadoras de colonias viables por muestra como se describió anteriormente. Este gráfico muestra el número de unidades formadoras de colonias en biopelículas preparadas utilizando el reactor de disco giratorio y expuestas al peróxido de hidrógeno, la capacidad de producir hasta 18 biopelículas idénticas. El uso del reactor de disco giratorio hace que esta técnica sea ideal para las pruebas de compuestos antimicrobianos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ejecutar biopelículas de reactor de disco giratorio y flujo de goteo. Estos reactores de biopelícula ofrecen alternativas a las biopelículas de celda de flujo y de placa de microtitulación, y son ideales cuando se necesita una gran cantidad de biomasa de biopelícula o se desean pruebas antimicrobianas en biopelículas establecidas.