Orientación de Biofilm Asociadas Staphylococcus aureus Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

El objetivo general de este procedimiento es cultivar de manera fácil y reproducible biopelículas bacterianas en un formato de placa de 96 pocillos en clavijas adheridas a la tapa para pruebas de susceptibilidad a los antibióticos utilizando un tinte de viabilidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento y desarrollo de antibióticos mediante la exploración de actividades en células asociadas a biopelículas, que a menudo son más representativas de los estados de infección in vivo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de desafiar fácilmente biopelículas preformadas en un ensayo medio de tres partes y determinar la inhibición utilizando un colorante de viabilidad común.

Para empezar, cultiva un cultivo de organismos productores de biopelículas en un medio rico en nutrientes. Inocular la cepa Newman de Staphylococcus aureus a partir de un tallo de glicerol en 10 mililitros de medio Müller-Hinton. Realice todos los trabajos que impliquen la manipulación de S. aureus con guantes y dentro de un gabinete de bioseguridad.

Incubar durante 16 horas a 37 grados centígrados en un agitador rotativo. Agregue el volumen de cultivo calculado a un tubo de centrífuga y granule las células girándolas durante un minuto a 10, 000 Gs.To prepare el inóculo de biopelícula, aspire el medio de crecimiento gastado y vuelva a suspender la célula en 20 mililitros de CRPMI. Con una pipeta multicanal de 200 microlitros, añada 125 microlitros de inóculo de un depósito de 25 mililitros a cada pocillo de las filas A a G de la placa inferior.

Llene 125 microlitros de medio CRPMI estéril en cada pocillo de la fila H como control de esterilidad. Tome la tapa de la clavija y sujétela por encima de la parte inferior del plato con las clavijas hacia abajo. Alinee cuidadosamente las clavijas individuales con sus respectivos pozos.

Evite el contacto físico entre la placa y las clavijas. Una vez alineado, baje la tapa con cuidado. Selle la tapa a la placa con una película de parafina para evitar la evaporación y colóquela en una bolsa de plástico hermética, sellándola herméticamente.

Mantenga el volumen de aire en la bolsa lo más bajo posible para minimizar la evaporación. Incubar la placa sin agitar a 37 grados centígrados durante 48 horas, en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. El día del desafío de la biopelícula, tome una placa nueva de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de CRPMI, equilibrado a temperatura ambiente, a cada pocillo de las filas B a H. Diluya hasta cuatro compuestos de prueba por separado, en 1.0 mililitro de CRPMI, hasta 2 veces la concentración final deseada.

Agregue 200 microlitros del compuesto 1 en los pocillos A1-A3.200 microlitros del compuesto 2 en los pocillos A4-A6.200 microlitros del compuesto 3 en los pocillos A7-A9. Y 200 microlitros del compuesto 4 en los pozos A10-A12. Diluir en serie los compuestos problema con una pipeta multicanal.

Comience transfiriendo 100 microlitros de la fila A a la fila B y mezcle. De esa manera, continúe transfiriendo 100 microlitros de pocillo a pocillo. Mezcle después de cada transferencia y deténgase en la fila F. Después de mezclar, expulse 100 microlitros de la fila F a un contenedor de residuos.

No transfiera ningún líquido a las filas G y H. Finalmente, agregue 100 microlitros de CRPMI a cada pocillo de la placa con una pipeta multicanal, para llevar el volumen final a 200 microlitros. Agregue 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato a una placa fresca y estéril de 96 pocillos que tenga pocillos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación de la biopelícula. A continuación, retire la bolsa de plástico y la película de parafina de la placa de inicio de la biopelícula incubada.

Levante la tapa hacia arriba, evitando el contacto entre las clavijas y el fondo de la placa, ya que esto puede dañar la biopelícula. Guarde la parte inferior para el análisis posterior de OD600. Enjuague las células planctónicas colocando la tapa de la clavija en la placa que contiene PBS.

Sumerge las clavijas durante cinco segundos. Sáquelos del PBS y sumérjalos una vez más, teniendo cuidado de no golpear las clavijas contra los lados del pozo. Coloque la tapa de la clavija enjuagada en la placa de desafío.

Evite el contacto innecesario entre las clavijas y la placa inferior, ya que esto dañará la biopelícula, lo que dará lugar a resultados inconsistentes. Selle la placa con una película de parafina y colóquela en una bolsa de plástico hermética como antes. Incubar la placa, sin agitar, durante 24 horas a 37 grados centígrados, en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.

Tome la parte inferior de la placa de iniciación de la biopelícula y vuelva a suspender las bacterias en cada pocillo con una pipeta multicanal. Mida el OD600 con un lector de microplacas adecuado, para confirmar el crecimiento que se produce en todos los pocillos, excepto los controles de esterilidad en la fila H. Utilice un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de tomar lecturas de fluorescencia cinética para detectar la conversión de resazurina. Configure una medición de fluorescencia cinética de 24 horas utilizando una excitación de 530 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros.

Ajuste la temperatura de la cámara a 37 grados centígrados y lea la placa cada 20 minutos. Configure el lector de placas para medir desde la parte inferior de la placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepárese para lavar la placa añadiendo 200 microlitros de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos con una pipeta multicanal.

A continuación, prepare el medio de recuperación de la biopelícula, añadiendo 400 microlitros de 0,8 miligramos por mililitro de solución madre de resazurina a 20 mililitros de medio CRPMI, hasta una concentración final de 16 microgramos por miliiliter resazurina. A continuación, agregue 150 microlitros de medio de recuperación de biopelícula con una pipeta multicanal, a cada pocillo de una placa nueva de 96 pocillos. Transfiera la placa de desafío de la incubadora a un gabinete de bioseguridad y retire con cuidado la bolsa de plástico y la película de sellado.

Retire la tapa de la clavija de la placa de desafío y enjuague las células planctónicas en PBS como antes, manteniendo la parte inferior de la placa de desafío para el análisis posterior de OD600. Después de enjuagar, coloque la tapa de la clavija en el fondo de la placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula. Envuelva el costado del plato con una película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pozos perimetrales.

Inmediatamente después de envolver la placa, colóquela en el lector de placas e inicie una lectura cinética durante un período de 24 horas, iniciando el protocolo resazurina-cinético realizado anteriormente. Para cuantificar el crecimiento de las células planctónicas que pueden o no ocurrir durante el desafío, lea el OD600 de todo el fondo de la placa de desafío usando un lector de microplacas. Aquí se muestra un diseño de ejemplo de una placa de desafío, utilizando dos diluciones completas para valorar las concentraciones de compuestos.

Las biopelículas cultivadas se trataron con neocuproína, o su complejo de cobre. Las lecturas de OD600 del fondo de la placa de desafío después de 24 horas revelaron que el complejo de cobre de neocuproína, pero no la neocuproína sola, evitó el desprendimiento y el posterior crecimiento de células viables de biopelículas tratadas a concentraciones de 1,25 micromolares o más. A continuación, se analizaron las biopelículas correspondientes mediante el ensayo de resazurina.

La inspección visual después de 24 horas permite una respuesta rápida de sí o no si se están ejecutando varias placas en paralelo. La resazurina se vuelve rosada en los pozos con biopelículas viables, pero permanece azul cuando la biopelícula ha sido erradicada. Una lectura cinética de la conversión de resazurina puede descubrir efectos dependientes de la concentración en la viabilidad de la biopelícula, como se muestra aquí con la gentamicina.

El retraso dependiente de la concentración en el inicio de la conversión del colorante es indicativo de una disminución de la viabilidad del biofilm. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe golpear las clavijas contra el costado de los pozos.