Name: Orientación de Biofilm Asociadas Staphylococcus aureus Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a cultivar biofilms bacterianos en placas de 96 pocillos para evaluar la susceptibilidad antibiótica de Staphylococcus aureus mediante el ensayo con resazurina. Este método permite determinar la viabilidad celular y descubrir nuevos compuestos antimicrobianos eficaces contra infecciones persistentes.

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Agradecemos a Saran Kupul por su asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por la subvención R01-AI104952 de los NIH a FW. El Centro de Investigación sobre el SIDA (CFAR) de la Universidad de Alabama en Birmingham (UAB), un programa financiado por los NIH (P30 AI027767) que fue posible gracias a los siguientes institutos de los NIH: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1. Iniciación de biopelículas <ol><li> Hacer crecer una cultura de producción de biofilm organismo en un medio rico en nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus cepa Newman en 10 ml de medio Mueller-Hinton de un stock de glicerol. Realizar todos los trabajos que impliquen la manipulación de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de bioseguridad. </li><li> Incubar durante 16 horas a 37 ° C en un agitador rotatorio (100 a 200 rpm). </li><li> Determinar DO600 del cultivo usando un espectrofotómetro y una cubeta estándar (longitud de recorrido: 1 cm). </li><li> Calcular el volumen (V) de la cultura necesaria para preparar 20 ml de inóculo con OD 600 (inóculo) de 0,1 en chelexed medios Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) 9 usando la fórmula: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (cultivo )] Nota: Referencia 9 proporciona detalles sobre la preparación cRPMI. <ol><li> Añadir el volumen de cultivo calculado (desde arriba) a un tubo de centrífuga y las células de pellets por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g. para prepare inóculo biofilm, aspirar el pellet de células medio de cultivo y se resuspenden en 20 ml pasado cRPMI. </li></ol></li><li> Verter inóculo en un depósito de 25 ml. </li><li> Retirar con cuidado la tapa de una placa de PEG de 96 pocillos estériles tirando de él hacia arriba. Nota: Se debe tener cuidado de no contaminar las clavijas que cuelgan por debajo de la tapa. La tapa se puede colocar boca abajo sobre una superficie limpia dentro de una cabina de bioseguridad. </li><li> Usando una pipeta multicanal l 200, añadir 125 l de inóculo a cada pocillo de las filas A a G de la placa inferior. </li><li> Llenar medio cRPMI 125 l estéril en cada pocillo de la fila H como un control de esterilidad. </li><li> Tome la clavija-tapa y mantenerla por encima del fondo del plato con las clavijas hacia abajo. alinee con cuidado las clavijas individuales con sus respectivos pozos. Evitar el contacto físico entre la placa y las clavijas. Una vez alineado, baje la tapa con cuidado hacia abajo. Evitar desajustes como reajustes realizados después de las clavijas han tocado la placa inferior puede contcontroles de esterilidad aminar en la fila H. </li><li> Sellar la tapa a la placa con película de parafina para evitar la evaporación y colocar en una bolsa de plástico con cierre, sellado herméticamente. Mantenga el volumen de aire en la bolsa lo más bajo posible para minimizar la evaporación. </li><li> Se incuba sin agitación a 37 ° C durante 48 horas en un incubador de CO2 al 5%. Nota: 48 h de crecimiento ha sido óptima para S. aureus, pero variará basado en el organismo utilizado. Nota: Aunque la incubación estática es un buen punto de partida para optimizar el ensayo, agitando suavemente a 150 rpm en un agitador de microplacas es una posible variación que pueden mejorar la formación de biopelículas de algunos S. aureus aislados. </li></ol> 2. Preparación de la placa de biofilm Challenge <ol><li> En el día del desafío biopelícula tomar una placa de 96 pocillos fresca y añadir 100 l de cRPMI, se equilibraron a temperatura ambiente, a cada pocillo de las filas B a H. Para evitar inconsistencias en los resultados, utilizar una placa de 96 pocillos que tiene capacidad para 200 lde medios de comunicación cuando las clavijas están en el interior, y cuenta con pozos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación biofilm. </li><li> Diluir hasta 4 compuestos de ensayo por separado en 1.0 ml de cRPMI a 2x la concentración final deseada, con el fin de dar cuenta de una dilución final en el paso 2.7. Nota: Un buen punto de partida es 8 veces por encima de la concentración inhibitoria de las células planctónicas. </li><li> Añadir 200 l de compuesto 1 en los pocillos A1 a A3, compuesto 2: pocillos A4 a A6, el compuesto 3 en pozos A7 a A9 y el compuesto 4 en pocillos A10 a A12. </li><li> Diluciones seriadas de los compuestos de ensayo utilizando una pipeta multicanal y la transferencia de 100 l de la fila A a la fila B y mezclar. </li><li> De esa manera, continúe el traspaso de 100 l pozo en pozo. Mezclar después de cada traslado y la parada en la fila F. </li><li> Después de mezclar, expulsar a 100 l de la fila F en un contenedor de residuos. No transfiera cualquier líquido a las filas G y H. </li><li> Añadir 100 l de cRPMI a cada pocillo de la placa usando una pipeta multicanal allevar el volumen a 200 l. Ver Figura 1 para la disposición final de la placa. </li></ol> 3. El biofilm Challenge <ol><li> Añadir 200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una placa de 96 pocillos estéril fresco que cuenta con pozos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación biofilm. </li><li> Retire la bolsa de plástico y lámina de parafina de la placa se incubó la iniciación de biopelículas. </li><li> Levante la tapa hacia arriba. Evitar el contacto entre las clavijas y el fondo del plato, ya que podría dañar la biopelícula. Mantenga la parte inferior para su posterior análisis OD 600 (véase la sección 3.8). </li><li> Enjuague las células planctónicas mediante la colocación de la clavija-tapa sobre la placa que contenía PBS (del paso 3.1). Sumergir las clavijas durante 5 segundos, sacar de la PBS, y se sumerja de nuevo, teniendo cuidado de no golpear las clavijas contra los lados así. </li><li> Coloque la clavija-tapa se enjuaga en la placa de desafío. Evitar el contacto innecesario entre las clavijas y la placa inferior, ya que dañará la biopelícula que lleva aresultados inconsistentes. </li><li> La placa del sello con la película de parafina y colocar en una bolsa de plástico con cierre, como se describe en el paso 1.10. </li><li> Se incuba la placa sin agitación durante 24 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Tomar parte inferior de la placa de biofilm iniciación de 3,3. Volver a suspender las bacterias en cada pocillo usando una pipeta multicanal y medir el diámetro exterior 600 con un lector de microplacas adecuado para confirmar el crecimiento se produce en todos los pozos, pero los controles de esterilidad en la fila H. </li></ol> 4. Determinación de biopelículas <ol><li> Use un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de tomar lecturas de fluorescencia cinéticos para la detección de resazurina conversión. Configurar una medición de fluorescencia cinética de 24 horas usando una excitación de 530 nm y 590 nm de emisión. </li><li> Ajuste la temperatura de la cámara a 37 ° C y tiene la placa de leer cada 20 minutos. Ajuste el lector de placas para medir desde la parte inferior de la placa de acuerdo con instrucciones del fabricanteciones. </li><li> Preparar la placa de lavado mediante la adición de 200 l de PBS con una pipeta multicanal a una placa de 96 pocillo estéril. </li><li> Preparar medio de recuperación de biopelícula mediante la adición de 400 l de 0,8 mg / ml de solución madre de resazurina a 20 ml de medio cRPMI a una concentración final de 16 mg de resazurina / ml. Nota: La resazurina es un irritante conocido piel. Use una bata de laboratorio, gafas protectoras contra salpicaduras y guantes durante la manipulación. CRPMI como el medio de recuperación de biopelícula se utilizó ya que proporciona la señal de fondo más baja, pero puede ser sustituido por medios de Mueller Hinton si es apropiado. </li><li> Añadir 150 l de medio de recuperación de la biopelícula con una pipeta multicanal a cada pocillo de una placa de 96 pocillos fresca. </li><li> Transferencia placa desafío de la incubadora en una cabina de bioseguridad y retirar con cuidado bolsa de plástico y lámina de cierre. </li><li> Retire la clavija-tapa de la placa de desafío y enjuagar las células planctónicas en PBS como se describe en 3.4. Mantenga la parte inferior de la placa de desafío para la posterior OD 600 analisis (véase 4.10). </li><li> Después de aclarar, coloque la clavija-tapa en la parte inferior placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula. </li><li> Envolver el lado de la placa con película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pocillos de perímetro. Inmediatamente después de concluir la placa, colocarla en el lector de placas y empezar una lectura cinética durante un período de 24 horas, iniciando el hecho previamente resazurina protocolo cinética desde el paso 4.1. </li><li> Para cuantificar el crecimiento de las células planctónicas que pueden o no pueden ocurrir durante desafío, leer la OD 600 de toda la placa inferior desafío usando un lector de micro placa. Siga las instrucciones dadas en el paso 3.8. Nota: resuspender cuidadosamente el contenido de cada pocillo como células vertimiento de la biopelícula tienden a crecer en grupos en la parte inferior del pozo. Cualquier burbuja dentro del pozo serán fuertemente interferir con las lecturas de DO a 600 y deben ser evitadas o eliminadas antes de la lectura. </li></ol>

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<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riddle+of+biofilm+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito un ensayo de biopelícula modificado para determinar la actividad de los inhibidores de la prueba sobre S. biopelículas aureus que se centran en el estado metabólico de las células del biofilm asociado. Mientras que la iniciación de la biopelícula se describe y procedimientos reto recomendaciones del fabricante sobre todo imitaba, el uso de resazurina tinte para detectar y cuantificar las células del biofilm-asociado que sobreviven a un desafío inhibidor de 24 hr simplifica enormeme...

Los microbios patógenos pueden formar biopelículas in vivo que conducen a infecciones crónicas no agudos 1. Infección por biofilm asociado es un factor de riesgo grave de procedimientos médicos que implican la implantación de cuerpos extraños (por ejemplo, substituciones de huesos artificiales, implantes de pecho) o la instalación de los tubos traqueales o catéteres urinarios 2. En estos contextos, la terapia anti-infecciosa es casi siempre necesario como infecciones basado en biopelícula rara vez se borran por su cuenta, incluso en individuos inmunocompetentes. Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más frecuentemente observados implicados en las complicaciones relacionadas con la biopelícula que se producen durante el uso de dispositivos médicos invasivos 3. Desafortunadamente, la naturaleza misma de biofilms como una barrera protectora hace más resistentes al tratamiento que las células planctónicas 1,4, y la evaluación de la eficacia clínica predicho es una parte crítica de tanto inicialel desarrollo de fármacos, así como vigilar la resistencia. Existe una creciente reconocimiento de que las condiciones de laboratorio, se centró en las culturas planctónicos, pueden no representar fielmente la enfermedad en el mundo real 5. Agravando aún más el problema, la replicación de los fenotipos de biopelícula es difícil, y los modelos de biopelículas existentes son tediosos y sufren de alta variabilidad inter e intra-ensayo 6. Por lo tanto, muchos investigadores, por necesidad, por defecto a ensayos de células planctónicas de susceptibilidad a los fármacos, lo que potencialmente descuidar un aspecto importante de la virulencia bacteriana y la enfermedad. Aquí se describe el protocolo para el ensayo de bacterias, específicamente S. aureus, en los biofilms pre-crecido que utilizan un sistema de biopelícula 7,8 basadas en 96 pocillos. Mientras que el protocolo para la formación de biopelículas y el desafío sigue esencialmente la recomendación del fabricante, se presenta una metodología rica en información alternativa para cuantificar la viabilidad de la bioFILM después de la exposición. Brevemente, las bacterias se cultivan en la placa de clavija, donde las biopelículas se forman en las clavijas sobresalientes unidos a la tapa de la placa. Después de la formación de biopelículas, las clavijas se sumergen suavemente en pocillos de una placa fresca llena con PBS para eliminar las células planctónicas. El PEG-tapa, con biofilms adjuntos, se transfiere a una nueva placa de desafío, que contiene varias concentraciones de antibióticos a ensayar. Después de una segunda incubación, las tapas se retiran de nuevo, se lavaron y se transfirieron a una placa de recuperación que contiene resazurina tinte, donde se someten a una incubación final. conversión resazurina se puede grabar cinéticamente o toma como una lectura de punto final después de un período de recuperación definido. Este método basado en el colorante de la cuantificación de la viabilidad de biofilms difiere considerablemente de las CFU (unidades formadoras de colonias) tediosas metodología basada en contar se describe en el protocolo original 7. OD 600 mediciones de la placa desafío de las drogas y resazurina cinética de conversión sirven como lectura viabilidadouts de células planctónicas y biofilm, respectivamente, que ofrecen un ensayo rápido, fiable, rico en información y técnicamente simple para la supervivencia de biopelículas.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>Siga las recomendaciones del fabricante</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Corning&nbsp;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 chelexado medio durante 1 hora con resina Chelex 100 y luego suplementado con 10% sin chelexed RPMI-1640</td></tr><tr><td>Chelex 100 Resina</td><td>Bio Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC-placas</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Sal de Sodio</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>800 &micro; g/ml en agua desionizada&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Plataforma de agitación de microplacas estériles de filtro</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 Lector de placas</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Registro y análisis de la conversión de resazurina</td></tr><tr><td>Neocuproína</td><td>Sigma</td><td>N1501&nbsp;</td><td>preparar 10 mM de stock en etanol 100%, almacenar a -80 &ordm; C</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>prepare una solución madre de 100 mM en agua, almacene a 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Cu-Neocuproína</td> de <td>fabricación</td><td></td> propia <td>Generada mediante la mezcla de molaridades iguales de neocuproína y sulfato de cobre. La mezcla se diluyó en medio CRPMI hasta la concentración deseada.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

orientación de biofilm asociadas<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; uso de ensayo de susceptibilidad a fármacos basado resazurina

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

La mayoría de las bacterias patógenas son capaces de formar biopelículas durante la infección, pero debido a la dificultad de manipular y evaluar las biopelículas, la gran mayoría del trabajo de laboratorio se realiza con células planctónicas. Aquí, describimos un ensayo de biopelícula de placa de clavija realizado con Staphylococcus aureus. Las biopelículas bacterianas se cultivan en clavijas unidas a una tapa de placa de microtitulación de 96 pocillos, se lavan mediante una inmersión suave en tampón y se colocan en una placa de desafío con medicamentos. Tras la posterior incubación se vuelven a lavar y se trasladan a una placa de recuperación final, en la que el colorante fluorescente resazurina sirve como indicador de viabilidad. Este ensayo ofrece una mayor facilidad de uso, fiabilidad y reproducibilidad, así como una gran cantidad de datos cuando se realiza como una lectura cinética. Además, este ensayo se puede adaptar a un enfoque de cribado de fármacos de rendimiento medio mediante el cual se toma una lectura fluorescente de punto final, lo que ofrece un camino para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.

El ensayo de la resazurina es suficientemente sensible para detectar con fiabilidad muy pocas células viables capaces de replicarse en medio libre de fármaco después de la exposición. En esta metodología, se define el biofilm erradicar la concentración mínima como la concentración más baja a la que no se observa una conversión de resazurina dentro de las 24 horas. El ensayo se basa en la resazurina moléculas oxidativas que se encuentran en las células metabólicamente activas que conviert...

La mayoría de las infecciones bacterianas producen una biopelícula. En virtud de su entorno, las bacterias asociadas a la biopelícula suelen ser fenotípicamente resistentes a los fármacos. Por lo tanto, las nuevas moléculas antibacterianas que matan las bacterias en las biopelículas son una alta prioridad. Establecemos un ensayo para detectar rápidamente compuestos antimicrobianos que sean eficaces para erradicar las biopelículas.

Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar de manera sencilla y reproducible biopelículas bacterianas en formato de placa de 96 pocillos sobre pernos unidos a la tapa, para realizar pruebas de susceptibilidad a antibióticos mediante un colorante de viabilidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento y desarrollo de antibióticos, al explorar actividades sobre células asociadas a biopelículas, que a menudo representan de forma más fiel los estados de infección in vivo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de desafiar fácilmente biopelículas previamente formadas en un ensayo de tres partes y determinar la inhibición utilizando un colorante de viabilidad común.Para comenzar, cultive un cultivo de un organismo productor de biopelícula en un medio rico en nutrientes. Inocule la cepa de Staphylococcus aureus Newman a partir de un cultivo en glicerol en 10 mililitros de medio Muller-Hinton. Realice todo el trabajo que implique el manejo de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de seguridad biológica.Incubar durante 16 horas a 37 grados Celsius en un agitador rotatorio. Añadir el volumen de cultivo calculado a un tubo de centrífuga y pelotar las células centrifugando durante un minuto a 10.000 G. Para preparar el inóculo de biopelícula, aspirar el medio de crecimiento gastado y resuspender el pellet celular en 20 mililitros de CRPMI. Utilizando una pipeta multicanal de 200 microlitros, añadir 125 microlitros de inóculo desde un reservorio de 25 mililitros a cada pocillo de las filas A a G de la placa inferior.Llene 125 microlitros de medio CRPMI estéril en cada pocillo de la fila H como control de esterilidad. Tome la tapa con pernos y sosténgala sobre el fondo de la placa con los pernos orientados hacia abajo. Alinee cuidadosamente cada perno con su pocillo respectivo.Evite el contacto físico entre la placa y los pernos. Una vez alineado, baje cuidadosamente la tapa. Selle la tapa a la placa con una película de parafina para prevenir la evaporación y colóquela en una bolsa de plástico hermética, cerrándola firmemente.Mantenga el volumen de aire en la bolsa lo más bajo posible para minimizar la evaporación. Incube la placa sin agitación a 37 grados Celsius durante 48 horas, en un incubador con 5% de dióxido de carbono. El día del desafío con biopelícula, tome una placa fresca de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de CRPMI, equilibrado a temperatura ambiente, a cada pocillo de las filas B a H. Diluya hasta cuatro compuestos de prueba por separado, en 1,0 mililitro de CRPMI, hasta 2x la concentración final deseada.Añada 200 microlitros del compuesto 1 en los pocillos A1-A3. 200 microlitros del compuesto 2 en los pocillos A4-A6. 200 microlitros del compuesto 3 en los pocillos A7-A9. Y 200 microlitros del compuesto 4 en los pocillos A10-A12. Diluya seriamente los compuestos de prueba utilizando una pipeta multicanal.Comience transfiriendo 100 microlitros desde la fila A hasta la fila B y mezcle. De esta manera, continúe transfiriendo 100 microlitros de pocillo en pocillo. Mezcle después de cada transferencia y deténgase en la fila F. Después de mezclar, deseche 100 microlitros de la fila F en un recipiente de desecho.No transfiera ningún líquido a las filas G y H. Finalmente, agregue 100 microlitros de CRPMI a cada pocillo de la placa utilizando una pipeta multicanal, para llevar el volumen final a 200 microlitros. Agregue 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato a una placa estéril nueva de 96 pocillos que tenga pocillos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación de biofilm. A continuación, retire la bolsa de plástico y la película de parafina de la placa de iniciación de biofilm incubada.Levante la tapa verticalmente, evitando el contacto entre los pasadores y la base de la placa, ya que esto podría dañar el biofilm. Guarde la parte inferior para el análisis posterior de OD600. Lave las células planctónicas colocando la tapa con pasadores sobre la placa que contiene PBS.Sumerja los pernos durante cinco segundos. Sáquelos del PBS y sumérjalos una vez más, teniendo cuidado de no golpear los pernos contra los lados de la cavidad. Coloque la tapa con pernos enjuagados en la placa de desafío.Evite el contacto innecesario entre los pernos y la placa inferior, ya que esto dañará el biofilm, lo que provocará resultados inconsistentes. Selle la placa con una película de parafina y colóquela en una bolsa de plástico hermética como antes. Incube la placa, sin agitación, durante 24 horas a 37 grados Celsius, en un incubador con 5% de dióxido de carbono.Tome la parte inferior de la placa de iniciación de biopelícula y re-suspenda las bacterias en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Mida la DO600 con un lector de microplacas adecuado para confirmar el crecimiento en todos los pocillos, excepto en los controles de esterilidad de la fila H. Utilice un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de realizar lecturas cinéticas de fluorescencia para detectar la conversión de resazurina. Configure una medición cinética de fluorescencia de 24 horas con una excitación de 530 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros.Configure la temperatura de la cámara a 37 grados Celsius y realice la lectura de la placa cada 20 minutos. Configure el lector de placas para que mida desde la parte inferior de la placa según las instrucciones del fabricante. Prepárese para lavar la placa añadiendo 200 microlitros de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal.Luego, prepare el medio de recuperación de biopelícula añadiendo 400 microlitros de una solución stock de resazurina 0,8 miligramos por mililitro a 20 mililitros de medio CRPMI, para obtener una concentración final de 16 microgramos por mililitro de resazurina. A continuación, añada 150 microlitros de medio de recuperación de biopelícula con una pipeta multicanal a cada pocillo de una placa fresca de 96 pocillos. Transfiera la placa de desafío del incubador a una cabina de seguridad biológica y retire cuidadosamente la bolsa de plástico y la película sellante.Retire la tapa con pernos de la placa de desafío y enjuague las células planctónicas con PBS como antes, conservando el fondo de la placa de desafío para el análisis posterior de OD600. Después del enjuague, coloque la tapa con pernos en el fondo de la placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula. Envuelva los bordes de la placa con película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pozos periféricos.Inmediatamente después de envolver la placa, colóquela en el lector de placas e inicie una lectura cinética durante un período de 24 horas, activando el protocolo cinético de resazurina previamente creado. Para cuantificar el crecimiento de células planctónicas que pueda ocurrir durante el ensayo, lea la DO600 de toda la parte inferior de la placa de ensayo utilizando un lector de microplacas. Aquí se muestra un ejemplo de distribución de una placa de ensayo, utilizando dos diluciones completas para titular las concentraciones del compuesto.Los biofilms cultivados fueron tratados con neocuproína o su complejo de cobre. Las lecturas de DO600 en la parte inferior de la placa de desafío después de 24 horas revelaron que el complejo de cobre de neocuproína, pero no la neocuproína sola, evitó la diseminación y el crecimiento subsiguiente de células viables a partir de los biofilms tratados, a concentraciones de 1,25 micromolar o superiores. Los biofilms correspondientes se analizaron posteriormente mediante el ensayo de resazurina.La inspección visual tras 24 horas permite obtener rápidamente una respuesta sí-no si se están procesando varias placas en paralelo. La resazurina se vuelve rosa en los pocillos con biofilms viables, pero permanece azul cuando el biofilm ha sido erradicado. Una lectura cinética de la conversión de resazurina puede revelar efectos dependientes de la concentración sobre la viabilidad del biofilm, como se muestra aquí con gentamicina.El retraso dependiente de la concentración en el inicio de la conversión del colorante indica una disminución de la viabilidad del biofilm. Al realizar este procedimiento, es importante recordar no golpear los pernos contra los lados de los pozos.

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Las pruebas de diagnóstico actual sensibilidad a los antimicrobianos se basa en el crecimiento de plancton de las cepas en condiciones de nutrientes ricos y aeróbicas. En este caso, contamos con un medio alternativo de esputo artificiales para estudiar la susceptibilidad antimicrobiana de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, tanto en condiciones aeróbicas y microaerófilos más representativos de la fibrosis quística pulmonar.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

Fuente: Bucher, T., et al. Metodologías para el estudio de biopelículas de B. subtilis como modelo para caracterizar inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demuestra cómo la integridad de la matriz de biofilm influye en la resistencia bacteriana al etanol comparando unidades formadoras de colonias en biopelículas no tratadas y con inhibidores alterados. La reducción de las UFC en muestras tratadas con inhibidores demuestra que la matriz extracelular es...

Ensayo de resistencia al etanol para evaluar la integridad de la matriz de biofilm

Fuente: Zhang, M. et al., Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimulada de incorporación de deuterio en una sola bacteria. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demuestra la aplicación de la microscopía de dispersión Raman estimulada para evaluar la susceptibilidad a los antibióticos mediante el seguimiento de la actividad metabólica marcada con deuterio. Al monitorizar señales de carbono-deuterio, el método permite la detección rápida de poblaciones...

Detección de la susceptibilidad a antibióticos bacterianos mediante un microscopio Raman de dispersión estimulado

Este video muestra un ensayo para el cribado de compuestos antimicrobianos que eliminan eficientemente las biopelículas utilizando una placa de clavija. La metodología monitoriza el estado metabólico del biofilm tras el tratamiento con compuestos antimicrobianos, facilitando la determinación de la concentración mínima de erradicación del biofilm.

Un ensayo de biopelícula de placa de clavija para el cribado de agentes antibacterianos

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Las infecciones por biofilm muestran una alta tolerancia a la quimioterapia. Ningún ensayo por sí solo capta la complejidad de las biopelículas. En su lugar, se necesitan ensayos complementarios. Presentamos una plataforma de cribado (desarrollada para S. aureus) que combina ensayos de viabilidad, biomasa y matriz de biopelícula. Permite el descubrimiento de fármacos anti-biopelícula, incluida la evaluación de los efectos quimioterapéuticos a largo plazo.

Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales

Este protocolo tiene como objetivo describir cómo estudiar el alcance de la internalización de Staphylococcus aureus y su capacidad para sobrevivir dentro de la célula huésped humana, así como la eficacia intracelular de los compuestos antimicrobianos.

Ensayo de protección enzimática mejorado para estudiar la internalización de Staphylococcus aureus y la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos

Esta metodología permite el establecimiento de un modelo de biofilm polimicrobiano en fibrosis quística para pruebas de sensibilidad antimicrobiana en laboratorios clínicos y de investigación. Este modelo proporciona resultados precisos y fiables en una amplia gama de salidas.

Desarrollo de un modelo de biofilm de colonias polimicrobianas para probar antimicrobianos en la fibrosis quística

El ensayo describe un método rápido para medir la formación de biopelículas a principios de bacterias y hongos. Este método utiliza una placa de microtitulación como sustrato para la formación de biopelículas microbianas, y el biofilm se visualiza utilizando la cepa de cristal violeta. El ensayo ofrece ya sea un ensayo cualitativo o cuantitativo de la formación de biofilm temprano.

Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo

Protocolos para la utilización de abrir las biopelículas de flujo del sistema de reactores de flujo por goteo y la rotación de los reactores de disco se presentan en detalle.

El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

Aprende a cultivar biofilms bacterianos en placas de 96 pocillos para evaluar la susceptibilidad antibiótica de Staphylococcus aureus mediante el ensayo con resazurina. Este método permite determinar la viabilidad celular y descubrir nuevos compuestos antimicrobianos eficaces contra infecciones persistentes.

Orientación de Biofilm Asociadas

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