Orientación de Biofilm Asociadas

El objetivo general de este procedimiento es cultivar de manera sencilla y reproducible biopelículas bacterianas en formato de placa de 96 pocillos sobre pernos unidos a la tapa, para realizar pruebas de susceptibilidad a antibióticos mediante un colorante de viabilidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento y desarrollo de antibióticos, al explorar actividades sobre células asociadas a biopelículas, que a menudo representan de forma más fiel los estados de infección in vivo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de desafiar fácilmente biopelículas previamente formadas en un ensayo de tres partes y determinar la inhibición utilizando un colorante de viabilidad común.

Para comenzar, cultive un cultivo de un organismo productor de biopelícula en un medio rico en nutrientes. Inocule la cepa de Staphylococcus aureus Newman a partir de un cultivo en glicerol en 10 mililitros de medio Muller-Hinton. Realice todo el trabajo que implique el manejo de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de seguridad biológica.

Incubar durante 16 horas a 37 grados Celsius en un agitador rotatorio. Añadir el volumen de cultivo calculado a un tubo de centrífuga y pelotar las células centrifugando durante un minuto a 10.000 G. Para preparar el inóculo de biopelícula, aspirar el medio de crecimiento gastado y resuspender el pellet celular en 20 mililitros de CRPMI. Utilizando una pipeta multicanal de 200 microlitros, añadir 125 microlitros de inóculo desde un reservorio de 25 mililitros a cada pocillo de las filas A a G de la placa inferior.

Llene 125 microlitros de medio CRPMI estéril en cada pocillo de la fila H como control de esterilidad. Tome la tapa con pernos y sosténgala sobre el fondo de la placa con los pernos orientados hacia abajo. Alinee cuidadosamente cada perno con su pocillo respectivo.

Evite el contacto físico entre la placa y los pernos. Una vez alineado, baje cuidadosamente la tapa. Selle la tapa a la placa con una película de parafina para prevenir la evaporación y colóquela en una bolsa de plástico hermética, cerrándola firmemente.

Mantenga el volumen de aire en la bolsa lo más bajo posible para minimizar la evaporación. Incube la placa sin agitación a 37 grados Celsius durante 48 horas, en un incubador con 5% de dióxido de carbono. El día del desafío con biopelícula, tome una placa fresca de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de CRPMI, equilibrado a temperatura ambiente, a cada pocillo de las filas B a H. Diluya hasta cuatro compuestos de prueba por separado, en 1,0 mililitro de CRPMI, hasta 2x la concentración final deseada.

Añada 200 microlitros del compuesto 1 en los pocillos A1-A3. 200 microlitros del compuesto 2 en los pocillos A4-A6. 200 microlitros del compuesto 3 en los pocillos A7-A9. Y 200 microlitros del compuesto 4 en los pocillos A10-A12. Diluya seriamente los compuestos de prueba utilizando una pipeta multicanal.

Comience transfiriendo 100 microlitros desde la fila A hasta la fila B y mezcle. De esta manera, continúe transfiriendo 100 microlitros de pocillo en pocillo. Mezcle después de cada transferencia y deténgase en la fila F. Después de mezclar, deseche 100 microlitros de la fila F en un recipiente de desecho.

No transfiera ningún líquido a las filas G y H. Finalmente, agregue 100 microlitros de CRPMI a cada pocillo de la placa utilizando una pipeta multicanal, para llevar el volumen final a 200 microlitros. Agregue 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato a una placa estéril nueva de 96 pocillos que tenga pocillos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación de biofilm. A continuación, retire la bolsa de plástico y la película de parafina de la placa de iniciación de biofilm incubada.

Levante la tapa verticalmente, evitando el contacto entre los pasadores y la base de la placa, ya que esto podría dañar el biofilm. Guarde la parte inferior para el análisis posterior de OD600. Lave las células planctónicas colocando la tapa con pasadores sobre la placa que contiene PBS.

Sumerja los pernos durante cinco segundos. Sáquelos del PBS y sumérjalos una vez más, teniendo cuidado de no golpear los pernos contra los lados de la cavidad. Coloque la tapa con pernos enjuagados en la placa de desafío.

Evite el contacto innecesario entre los pernos y la placa inferior, ya que esto dañará el biofilm, lo que provocará resultados inconsistentes. Selle la placa con una película de parafina y colóquela en una bolsa de plástico hermética como antes. Incube la placa, sin agitación, durante 24 horas a 37 grados Celsius, en un incubador con 5% de dióxido de carbono.

Tome la parte inferior de la placa de iniciación de biopelícula y re-suspenda las bacterias en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Mida la DO600 con un lector de microplacas adecuado para confirmar el crecimiento en todos los pocillos, excepto en los controles de esterilidad de la fila H. Utilice un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de realizar lecturas cinéticas de fluorescencia para detectar la conversión de resazurina. Configure una medición cinética de fluorescencia de 24 horas con una excitación de 530 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros.

Configure la temperatura de la cámara a 37 grados Celsius y realice la lectura de la placa cada 20 minutos. Configure el lector de placas para que mida desde la parte inferior de la placa según las instrucciones del fabricante. Prepárese para lavar la placa añadiendo 200 microlitros de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal.

Luego, prepare el medio de recuperación de biopelícula añadiendo 400 microlitros de una solución stock de resazurina 0,8 miligramos por mililitro a 20 mililitros de medio CRPMI, para obtener una concentración final de 16 microgramos por mililitro de resazurina. A continuación, añada 150 microlitros de medio de recuperación de biopelícula con una pipeta multicanal a cada pocillo de una placa fresca de 96 pocillos. Transfiera la placa de desafío del incubador a una cabina de seguridad biológica y retire cuidadosamente la bolsa de plástico y la película sellante.

Retire la tapa con pernos de la placa de desafío y enjuague las células planctónicas con PBS como antes, conservando el fondo de la placa de desafío para el análisis posterior de OD600. Después del enjuague, coloque la tapa con pernos en el fondo de la placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula. Envuelva los bordes de la placa con película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pozos periféricos.

Inmediatamente después de envolver la placa, colóquela en el lector de placas e inicie una lectura cinética durante un período de 24 horas, activando el protocolo cinético de resazurina previamente creado. Para cuantificar el crecimiento de células planctónicas que pueda ocurrir durante el ensayo, lea la DO600 de toda la parte inferior de la placa de ensayo utilizando un lector de microplacas. Aquí se muestra un ejemplo de distribución de una placa de ensayo, utilizando dos diluciones completas para titular las concentraciones del compuesto.

Los biofilms cultivados fueron tratados con neocuproína o su complejo de cobre. Las lecturas de DO600 en la parte inferior de la placa de desafío después de 24 horas revelaron que el complejo de cobre de neocuproína, pero no la neocuproína sola, evitó la diseminación y el crecimiento subsiguiente de células viables a partir de los biofilms tratados, a concentraciones de 1,25 micromolar o superiores. Los biofilms correspondientes se analizaron posteriormente mediante el ensayo de resazurina.

La inspección visual tras 24 horas permite obtener rápidamente una respuesta sí-no si se están procesando varias placas en paralelo. La resazurina se vuelve rosa en los pocillos con biofilms viables, pero permanece azul cuando el biofilm ha sido erradicado. Una lectura cinética de la conversión de resazurina puede revelar efectos dependientes de la concentración sobre la viabilidad del biofilm, como se muestra aquí con gentamicina.

El retraso dependiente de la concentración en el inicio de la conversión del colorante indica una disminución de la viabilidad del biofilm. Al realizar este procedimiento, es importante recordar no golpear los pernos contra los lados de los pozos.