Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico
18 de octubre de 2018
Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como cómo el flujo de fluidos altera el crecimiento y desarrollo de biopelículas fúngicas. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite evaluar cuantitativamente los efectos del flujo sobre el crecimiento y desarrollo de biopelículas en tiempo real. Comience este experimento con el montaje del aparato de flujo, como se describe en el protocolo de texto.
El día del experimento, adjunte la trampa de burbujas, la sonda de temperatura y todos los componentes de un solo uso. Para montar el filtro, retire el émbolo de una jeringa de un mililitro para convertirlo en un adaptador. Forzar el tubo de la botella de filtro en este extremo y fijar un filtro de 2 micras al tubo que conduce al matraz de crecimiento.
Aplique grasa de vacío de silicona alrededor de la púa del adaptador de diapositivas antes de conectarlo, ya que esto ayuda a evitar fugas de aire en el sistema. Llene el matraz de fijación con 100 mililitros de YPD, y llene el matraz de crecimiento con 200 mililitros de YPD. Asegúrese de que el tubo lateral verde llegue al soporte de cada matraz.
Asegúrese de que todas las válvulas estén abiertas. Coloque la trampa de burbujas en un vacío y conecte la bomba al tubo lateral verde aguas abajo de la trampa de burbujas. Bombee el fluido a un caudal de 3,3 mililitros por minuto para llenar completamente el lado verde.
Luego, dispensar y desechar aproximadamente uno a dos mililitros de los medios, porque el primer par de mililitros a menudo contienen células muertas o desechos aleatorios. Asegúrese de que el lado verde de la tubería está lleno de medios y no tiene burbujas aguas abajo de la trampa de la burbuja antes de continuar. Llene el portaobjetos y el depósito con YPD, teniendo cuidado de no introducir burbujas.
Conecte la corredera al aparato de flujo. A continuación, bombee más líquido para crear un tampón de unos 5 metros en el lado naranja. Esto es para evitar que accidentalmente atrapa el aire en la diapositiva en caso de contraflujo.
Ahora, prepare el aparato de flujo para el transporte al microscopio plantando primero la entrada y salida de la trampa de burbujas cerrada. A continuación, sujete las válvulas de matraz laterales verdes y naranjas cerradas. Asegúrese de que las tapas de los tornillos para el amortiguador de pulsación y la botella de filtro estén apretadas, ya que pueden aflojarse durante el autoplacado.
Desconecte la bomba del tubo para facilitar el transporte. A continuación, mueva todos los componentes, incluido el agitador de placa caliente, en un recipiente secundario cerca del microscopio. Fije la sonda de temperatura al agitador de placa caliente y comience a calentar el matraz de fijación a 37 grados Celsius.
Revuelva el medio a 300 RPM y mantenga esto durante todo el experimento. Monte la diapositiva en el microscopio y utilice cinta adhesiva si es necesario para fijarla firmemente. A continuación, conecte la trampa de burbujas a un vacío.
Ahora, conecte la bomba al aparato de flujo. Encienda la bomba a un caudal de 3,3 mililitros por minuto y permita que funcione durante aproximadamente cinco a 10 segundos. Luego, quita la trampa de burbujas en el clan de la tapa de salida.
Deje que la bomba siga funcionando mientras el matraz de fijación se calienta. Una vez que el matraz de unión y la cámara de incubación estén a 37 grados centígrados, agregue suficiente cultivo nocturno de las células fúngicas al matraz de unión para llegar a un millón de células por mililitro. Espere 15 minutos para permitir que las células se aclimaten.
Abra las válvulas de matraz laterales verdes y naranjas mientras cierra ambas válvulas de matraz de crecimiento para iniciar el flujo de células. Espere aproximadamente cinco minutos para permitir que las células lleguen a la diapositiva. Durante este tiempo, enfoque el microscopio y ajuste a los mismos parámetros de imagen utilizados en experimentos anteriores.
Comience la adquisición de imágenes para la fase de enlace. Vuelva después de aproximadamente cinco y 10 minutos para asegurarse de que se ha mantenido el enfoque. Si no es así, intente ajustar el enfoque inmediatamente después de adquirir la siguiente imagen.
Inmediatamente después de que finalice la fase de datos adjuntos, guarde el archivo. A continuación, abra las válvulas de matraz de crecimiento lateral verde y naranja mientras cierra ambas válvulas de matraz de fijación. Tenga cuidado de no golpear la etapa si hay válvulas dentro de la cámara de incubación.
Desconecte la sonda del termómetro y sustituya el matraz de fijación por el matraz de crecimiento. Ahora, configure el software para adquirir una imagen cada 15 minutos durante 22 horas, y comience la adquisición de imágenes para la fase de crecimiento. Una vez finalizada la adquisición de la fase de crecimiento y guardado el archivo, abra las válvulas de matraz de fijación lateral verde y naranja, lo que puede hacer un ruido a medida que la presión se libera en el lado naranja.
Tire hacia arriba en el tubo lateral verde procedente de ambos matraces de medios, hasta que estén por lo menos varios centímetros por encima del medio. A continuación, ejecute la bomba a una alta velocidad para eliminar todos los medios de la tubería, lo que hace que la limpieza sea mucho más fácil. Por último, cuantifique los vídeos como se describe en el protocolo de texto.
Este video de microscopía de campo oscuro time lapse muestra la unión de células albican de tipo salvaje Candida a la subfluencia del sustrato durante la fase de fijación, seguido por el crecimiento y desarrollo posterior durante la fase de crecimiento que conduce a la formación de biopelículas. Los datos de estos videos se pueden analizar para las tasas de unión celular y desprendimiento y biomasa a lo largo del tiempo, que se muestra aquí es la biomasa total dentro de la región de imágenes según lo determinado por el análisis de densitometría. También se muestra la tasa acumulada de unión celular y el porcentaje de desprendimiento de biomasa a lo largo del tiempo.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar las mismas condiciones de imagen en todos los experimentos, ya que esto permite realizar comparaciones cuantitativas entre ellos.
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Descripción general
Este artículo describe un aparato de flujo diseñado para la obtención de imágenes en tiempo real de la formación de biopelículas fúngicas bajo condiciones de flujo. También analiza algoritmos cuantitativos para el análisis de las imágenes adquiridas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Investigación de biopelículas
- Dinámica de fluidos
Antecedentes
- Los biofilms fúngicos son importantes en diversos contextos ecológicos y clínicos.
- Comprender cómo el flujo de fluidos afecta el desarrollo del biofilm es crucial para la microbiología.
- Las técnicas de imagen en tiempo real pueden proporcionar información sobre la dinámica de los biofilms.
- El análisis cuantitativo de imágenes puede mejorar la comprensión de los patrones de crecimiento de los biofilms.
Objetivo del estudio
- Evaluar los efectos del flujo de fluidos en el crecimiento de biopelículas fúngicas.
- Proporcionar un método para la observación en tiempo real de la formación de biopelículas.
- Desarrollar algoritmos para el análisis cuantitativo de datos de imágenes.
Métodos Utilizados
- Montaje de un aparato de flujo para la obtención de imágenes.
- Conexión de componentes como un trampa de burbujas y una sonda de temperatura.
- Uso de un sistema de filtración para controlar el flujo de fluido.
- Aplicación de algoritmos cuantitativos a las imágenes adquiridas.
Resultados principales
- El aparato de flujo logró visualizar la formación de biopelículas fúngicas.
- Los datos en tiempo real proporcionaron información sobre el crecimiento de biopelículas bajo condiciones de flujo variables.
- Algoritmos cuantitativos permitieron un análisis detallado del desarrollo de biopelículas.
- El método demostró ventajas frente a las técnicas tradicionales de imagen.
Conclusiones
- El aparato de flujo es eficaz para estudiar biopelículas fúngicas.
- La imagen en tiempo real puede avanzar significativamente la investigación microbiológica.
- El análisis cuantitativo es esencial para comprender la dinámica de las biopelículas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este sistema permite la evaluación cuantitativa en tiempo real de la dinámica de biopelículas fúngicas bajo flujo controlado, abordando una brecha crítica en la modelización de las interacciones huésped-patógeno bajo esfuerzo cortante fisiológico. Al proporcionar mediciones de cinética de adhesión/desprendimiento y de biomasa, apoya la desactivación mecanicista de riesgos en la validación de dianas antifúngicas durante el descubrimiento preclínico. El diseño de bajo costo y compatible con microscopio permite una amplia adopción en laboratorios de descubrimiento para la fenotipificación reproducible de biopelículas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar cómo el flujo de fluidos modula la adhesión fúngica y la formación de biopelículas, aportando información sobre la relevancia de dianas en modelos de infección mucosal.
- Valor operativo: Proporciona lecturas cuantificables en tiempo real de las tasas de adhesión y desprendimiento celular bajo esfuerzo cortante, lo que apoya el cribado de dianas basado en hipótesis.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera datos temporales de biomasa y desprendimiento mediante densitometría, lo que permite la comparación cuantitativa de cepas silvestres y mutantes bajo flujo.
- Valor operativo: Compatible con microscopios ópticos estándar, lo que permite una implementación escalable y de bajo costo para campañas de cribado de compuestos antifúngicos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Modela condiciones de flujo relevantes para la candidiasis orofaríngea, vinculando hallazgos in vitro con el comportamiento clínico de biopelículas bajo cizallamiento salival.
- Valor operativo: Permite imágenes longitudinales de biopelículas (hasta 22 horas), posibilitando el análisis temporal de la eficacia antifúngica y el desarrollo de resistencia.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El aparato se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando datos fenotípicos adaptados al flujo para reducir los riesgos de los blancos antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la interrogación mecanicista de vías de adhesión y reguladores de biopelículas bajo flujo fisiológicamente relevante, aclarando la función del blanco en contextos de infección.
- Tamizaje: Proporciona métricas cuantitativas estandarizadas de biopelículas (tasa de adhesión, porcentaje de desprendimiento, biomasa a lo largo del tiempo) para tamizaje reproducible de compuestos bajo condiciones dinámicas.
- Análisis: Permite la cuantificación de biomasa basada en densitometría y el análisis cinético de adhesión/desprendimiento, apoyando la priorización de resultados con base en datos.
- Investigación Traducional: Modela tensiones de cizalladura relevantes para el ser humano en la mucosa oral, mejorando la fidelidad predictiva de los modelos preclínicos de biopelículas para el desarrollo de antifúngicos.
- Reutilización Empresarial: Diseñado para uso repetido con componentes modulares, lo que permite la estandarización entre laboratorios y proyectos que estudian la adhesión microbiana bajo flujo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas antifúngicas al vincular perturbaciones genéticas o farmacológicas con fenotipos de biopelículas dependientes del flujo.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante tasas de flujo estandarizadas, condiciones de imagen y protocolos de análisis cuantitativo uniformes en todos los experimentos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos tempranos de eficacia frente a biopelículas ajustados al flujo, reduciendo los fracasos en fases avanzadas debido a la baja relevancia de la diana en entornos huésped dinámicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos antifúngicos según su desempeño bajo estrés por cizalladura, alineándose con los nichos clínicos de infección.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en configuración de microfluídica, técnica estéril y microscopía de lapso de tiempo para una operación consistente.
- Necesita un microscopio óptico con estabilización de platina, control de temperatura (37°C) y bomba peristáltica capaz de un flujo de 3,3 mL/min.
- Exige la estandarización entre equipos de los parámetros de imagen (enfoque, iluminación, intervalo de adquisición) para permitir comparaciones cuantitativas entre experimentos.
- La adaptación a especies distintas de Candida o medios alternativos puede requerir optimización de las tasas de flujo y de la química superficial para prevenir obstrucciones o bioensuciamiento.
- Las limitaciones prácticas incluyen un bajo rendimiento debido a la preparación manual de portaobjetos y restricciones en las regiones de imagen, lo que lo hace inadecuado para cribados primarios de alto rendimiento, pero ideal para estudios mecanicistas de seguimiento.
