Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como cómo el flujo de fluidos altera el crecimiento y desarrollo de biopelículas fúngicas. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite evaluar cuantitativamente los efectos del flujo sobre el crecimiento y desarrollo de biopelículas en tiempo real. Comience este experimento con el montaje del aparato de flujo, como se describe en el protocolo de texto.

El día del experimento, adjunte la trampa de burbujas, la sonda de temperatura y todos los componentes de un solo uso. Para montar el filtro, retire el émbolo de una jeringa de un mililitro para convertirlo en un adaptador. Forzar el tubo de la botella de filtro en este extremo y fijar un filtro de 2 micras al tubo que conduce al matraz de crecimiento.

Aplique grasa de vacío de silicona alrededor de la púa del adaptador de diapositivas antes de conectarlo, ya que esto ayuda a evitar fugas de aire en el sistema. Llene el matraz de fijación con 100 mililitros de YPD, y llene el matraz de crecimiento con 200 mililitros de YPD. Asegúrese de que el tubo lateral verde llegue al soporte de cada matraz.

Asegúrese de que todas las válvulas estén abiertas. Coloque la trampa de burbujas en un vacío y conecte la bomba al tubo lateral verde aguas abajo de la trampa de burbujas. Bombee el fluido a un caudal de 3,3 mililitros por minuto para llenar completamente el lado verde.

Luego, dispensar y desechar aproximadamente uno a dos mililitros de los medios, porque el primer par de mililitros a menudo contienen células muertas o desechos aleatorios. Asegúrese de que el lado verde de la tubería está lleno de medios y no tiene burbujas aguas abajo de la trampa de la burbuja antes de continuar. Llene el portaobjetos y el depósito con YPD, teniendo cuidado de no introducir burbujas.

Conecte la corredera al aparato de flujo. A continuación, bombee más líquido para crear un tampón de unos 5 metros en el lado naranja. Esto es para evitar que accidentalmente atrapa el aire en la diapositiva en caso de contraflujo.

Ahora, prepare el aparato de flujo para el transporte al microscopio plantando primero la entrada y salida de la trampa de burbujas cerrada. A continuación, sujete las válvulas de matraz laterales verdes y naranjas cerradas. Asegúrese de que las tapas de los tornillos para el amortiguador de pulsación y la botella de filtro estén apretadas, ya que pueden aflojarse durante el autoplacado.

Desconecte la bomba del tubo para facilitar el transporte. A continuación, mueva todos los componentes, incluido el agitador de placa caliente, en un recipiente secundario cerca del microscopio. Fije la sonda de temperatura al agitador de placa caliente y comience a calentar el matraz de fijación a 37 grados Celsius.

Revuelva el medio a 300 RPM y mantenga esto durante todo el experimento. Monte la diapositiva en el microscopio y utilice cinta adhesiva si es necesario para fijarla firmemente. A continuación, conecte la trampa de burbujas a un vacío.

Ahora, conecte la bomba al aparato de flujo. Encienda la bomba a un caudal de 3,3 mililitros por minuto y permita que funcione durante aproximadamente cinco a 10 segundos. Luego, quita la trampa de burbujas en el clan de la tapa de salida.

Deje que la bomba siga funcionando mientras el matraz de fijación se calienta. Una vez que el matraz de unión y la cámara de incubación estén a 37 grados centígrados, agregue suficiente cultivo nocturno de las células fúngicas al matraz de unión para llegar a un millón de células por mililitro. Espere 15 minutos para permitir que las células se aclimaten.

Abra las válvulas de matraz laterales verdes y naranjas mientras cierra ambas válvulas de matraz de crecimiento para iniciar el flujo de células. Espere aproximadamente cinco minutos para permitir que las células lleguen a la diapositiva. Durante este tiempo, enfoque el microscopio y ajuste a los mismos parámetros de imagen utilizados en experimentos anteriores.

Comience la adquisición de imágenes para la fase de enlace. Vuelva después de aproximadamente cinco y 10 minutos para asegurarse de que se ha mantenido el enfoque. Si no es así, intente ajustar el enfoque inmediatamente después de adquirir la siguiente imagen.

Inmediatamente después de que finalice la fase de datos adjuntos, guarde el archivo. A continuación, abra las válvulas de matraz de crecimiento lateral verde y naranja mientras cierra ambas válvulas de matraz de fijación. Tenga cuidado de no golpear la etapa si hay válvulas dentro de la cámara de incubación.

Desconecte la sonda del termómetro y sustituya el matraz de fijación por el matraz de crecimiento. Ahora, configure el software para adquirir una imagen cada 15 minutos durante 22 horas, y comience la adquisición de imágenes para la fase de crecimiento. Una vez finalizada la adquisición de la fase de crecimiento y guardado el archivo, abra las válvulas de matraz de fijación lateral verde y naranja, lo que puede hacer un ruido a medida que la presión se libera en el lado naranja.

Tire hacia arriba en el tubo lateral verde procedente de ambos matraces de medios, hasta que estén por lo menos varios centímetros por encima del medio. A continuación, ejecute la bomba a una alta velocidad para eliminar todos los medios de la tubería, lo que hace que la limpieza sea mucho más fácil. Por último, cuantifique los vídeos como se describe en el protocolo de texto.

Este video de microscopía de campo oscuro time lapse muestra la unión de células albican de tipo salvaje Candida a la subfluencia del sustrato durante la fase de fijación, seguido por el crecimiento y desarrollo posterior durante la fase de crecimiento que conduce a la formación de biopelículas. Los datos de estos videos se pueden analizar para las tasas de unión celular y desprendimiento y biomasa a lo largo del tiempo, que se muestra aquí es la biomasa total dentro de la región de imágenes según lo determinado por el análisis de densitometría. También se muestra la tasa acumulada de unión celular y el porcentaje de desprendimiento de biomasa a lo largo del tiempo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar las mismas condiciones de imagen en todos los experimentos, ya que esto permite realizar comparaciones cuantitativas entre ellos.