Name: Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a caracterizar interacciones de biopelículas con su entorno usando un sistema de flujo microfluídico de doble entrada. Este método permite generar gradientes químicos controlados y analizar dinámicas de transporte con microscopía confocal 3D.

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Damos las gracias a Matt Parsek en la Universidad de Washington (Seattle, WA) para proporcionar P. aeruginosa y E. cepas de E. coli y Roger Nokes de la Universidad de Canterbury (Nueva Zelanda) para proporcionar acceso a software Arroyos. Este trabajo fue apoyado por el subsidio R01AI081983 de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Confocal de imágenes se realizó en las instalaciones de la Northwestern Imaging Biológica (BIF).

Configuración de la célula 1. Flujo y Inoculación NOTA:. Utilice una celda de flujo de microfluidos de doble entrada se describe en Song et al, 2014 14 para crecer biopelículas. Esta celda de flujo es capaz de crear gradientes químicos lisas bien definidos. El diseño de la célula de flujo se muestra en la figura 1 y el flujo de fabricación de células se ha descrito anteriormente en Song et al., 2014 14. Aquí detalle nuestros métodos mediante el uso de P. aeruginosa y E. coli para formar biopelículas, pero otras especies puede ser adecuado también. Se utilizó P. aeruginosa PAO1- gfp, que expresa constitutivamente una proteína fluorescente verde (GFP), como un organismo modelo para el desarrollo de biopelículas. Además, se utilizó E. coli DH5a para formar biopelículas de especies mixtas con P. aeruginosa. P. aeruginosa y E. cepas de E. coli se cultivaron en placas de agar LB. <ol><li> Prepare la celda de flujo usando polidimetilsiloxano (PDMS) unido a uncubreobjetos de vidrio a través del tratamiento con plasma de oxígeno como se describe en 14. Las dimensiones de la cámara de celda de flujo son 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (longitud x anchura x profundidad). </li><li> Preparar modificado medio de crecimiento FAB 15. Para observar el crecimiento de biopelícula bajo un gradiente nutricional dentro de la celda de flujo, la introducción de Fab modificado medio 15 con glucosa 0,6 mM en una entrada y introducir medio FAB sin ninguna fuente de carbono a través de la otra entrada. Filtro-esterilizar (tamaño de poro = 0,2 micras) la solución de glucosa de valores (60 mM) antes de añadir al medio de FAB. También autoclave el medio FAB con el ciclo 1 (líquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) antes de su uso. </li><li> Esterilizar el sistema de flujo. Antes de la inoculación, autoclave toda la trayectoria de flujo (botellas medianas, tubos, trampas de burbujas, las células de flujo) usando el ciclo 1, a excepción de las válvulas de tres vías de plástico desechables (y pre-esterilizados) situados aguas arriba de la celda de flujo. (Válvulas de tres formas se utilizan para inyectar células cultura, trazador fluorescente y microperlas.) Para evitar la contaminación durante el montaje, cubre todas las aberturas de tubos y conectores con papel de aluminio o bolsas de autoclave antes de la esterilización en autoclave. </li><li> Conectar el sistema de flujo. Montar los componentes del sistema de celda de flujo cuidadosamente (ver video para el montaje sistema de flujo) y entregar medio de crecimiento a la célula de flujo a través de una bomba peristáltica que controla con precisión la velocidad de flujo. </li><li> Preparar el cultivo de células para la inoculación mediante la transferencia de una colonia de P. aeruginosa o E. coli a partir de placas de LB a 3 ml de caldo LB y agitar el cultivo O / N a 225 rpm y 37 ° C. Diluir los cultivos de células S / N en 1 ml esterilizados agua a una DO final 600 = 0,01 como el inóculo. (Cultura y diluir las bacterias en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.) </li><li> Para los experimentos con las biopelículas de especies mixtas, diluir los dos cultivos bacterianos a una relación de 1: 1 en 1 ml con una DO 600 = 0,01 equivalente para cada bacteria. </li><li> Inocular la celda de flujo. Inyectar 1 ml de inóculo a la entrada de la celda de flujo de la válvula de tres vías. Después de la inyección, una pausa en el flujo durante 1 hora para permitir que las células bacterianas que se adhieren a la cubierta de vidrio. (Asegúrese de que la celda de flujo se coloca con el lado cubreobjetos hacia abajo para permitir que las células suspendidas se asienten en el cubreobjetos.) </li><li> Después de 1 hr, reanudar el flujo y bombear el medio de crecimiento a la célula de flujo a una velocidad constante de 0,03 ml / min para cada entrada durante 3 días. </li></ol> 2. Caracterización de Biofilm Desarrollo en respuesta a gradientes de nutrientes Utilizando Microscopía Confocal NOTA: P. aeruginosa se ​​pueden obtener imágenes con GFP expresada constitutivamente, pero E. coli en las biopelículas de especies mixtas debe ser imaginada por counterstaining. <ol><li> Tenga en cuenta las biopelículas de 3 días usando microscopía confocal. Para los resultados representativos, observar biofilms utilizando un microscopio confocal con un objetivo 63X. Antes de la proyección de imagen, marcala célula de doble entrada de flujo con una rejilla en el lado de cubierta de vidrio. (El propósito de esta rejilla es permitir que el experimentador para localizar las regiones de formación de imágenes dentro de la cámara de la celda de flujo.) </li><li> Para contrateñir, diluir 10 l de rojo fluorescente colorante de ácidos nucleicos de células permeante, tales como mancha nucleico fluorescente verde ácido, tal como STYO 62, solución madre (1 mM) en 990 l de agua esterilizada y luego inyectar lentamente la mancha diluida utilizando una jeringa en la cámara de la celda de flujo de la válvula de tres vías aguas arriba. Mantenga la celda de flujo estancado y en la oscuridad durante 30 min, luego reanudar el flujo para lavar la mancha no unida durante 15 min. </li><li> Realizar imagen confocal. Active el 488 nm láser de argón para la excitación y la emisión de canales de recogida de las buenas prácticas agrarias (500-535 nm) y la mancha de ácido nucleico (por colorante de ácidos nucleicos fluorescente verde, 650-750 nm). Ajustar las ganancias y las compensaciones para los dos canales para tener imágenes brillantes y limpias. Seleccione xyz y el modo de imágenes simultáneas. Utilice el mando de control de z para identificar la parte inferior y la parte superior de la biopelícula en el campo. Ajuste el z-paso para 0,5 micras para la adquisición de una imagen pila 3-D. (Para garantizar una alta calidad de imagen, utilice un promedio de la línea de cuatro para la adquisición de imágenes.) </li><li> Para asignar los patrones espaciales de desarrollo de la biopelícula dentro de la celda de flujo, las biopelículas de la imagen en tres o más longitudinal (x) las distancias a lo largo de la entrada de la celda de flujo, y a las tres transversal (y) posiciones relativas al gradiente nutricional impuesta, como se muestra en la Figura 1 . </li></ol> 3. Caracterización de solutos Interna Transporte por inyecciones de trazador fluorescente Conservador NOTA: Un indicador fluorescente conservador, como Cy5, puede ser utilizado para caracterizar los patrones de transporte de solutos dentro de la biopelícula. <ol><li> Disolver Cy5 (Mono-reactiva NHS Ester) en agua a una concentración final de 10 mg / ml como una solución madre. La solución madre, Cy5 en un congelador a -20ºC. NOTA: Como Cy5 es luz-sensitive, almacenar, diluir e inyectar soluciones Cy5 en la oscuridad. </li><li> Antes de las inyecciones de trazador fluorescente, tomar una imagen de la pila 3-D de la biopelícula de 3 días con la microscopía confocal (con un objetivo 63X). (Regiones anchas de colonias biofilm son ideales para las observaciones de series de tiempo de transporte de tinte.) También elegir un plano z con colonias bien separadas para imágenes (como se muestra en la Figura 5A). </li><li> Para cada experimento de inyección Cy5, diluir 2 l de la solución madre Cy5 en 998 l de agua esterilizada para producir una solución de inyección que tiene una concentración Cy5 de 20 mg / ml. </li><li> Parar la bomba para pausar el flujo e inyectar la solución en el Cy5 aguas arriba de la celda de flujo usando una jeringa a través de la válvula de 3 vías. (Es importante para evitar las burbujas de aire entren en la trayectoria de flujo mientras se inyecta. Trampas de burbujas deben mantenerse abierta durante la inyección de nuevo.) </li><li> Después de inyectar la solución Cy5, cerrar las trampas de burbujas, ajuste la válvula de 3 vías, y reinicie elbomba para suministrar la solución Cy5 se inyecta en la celda de flujo. </li><li> Cambiar el modo de imagen confocal para XYT. Activar canales Cy5 y GFP bajo el modo de imágenes simultáneas. Ajustar la configuración confocal en intensidad Cy5 (intensidad del láser, la ganancia y offset) para evitar la saturación de señales, lo cual es crítico para la cuantificación. (Se prefiere alta resolución temporal para la visualización de penetración del colorante. Sin embargo, el escaneo rápido disminuye la calidad de la imagen.) Elija la velocidad de exploración adecuada y media línea para equilibrar el tiempo de resolución de la imagen y la calidad de imagen. Para este protocolo utilizar un promedio de la línea de cuatro y una velocidad de 0,15 Hz. </li><li> Reanudar el flujo para entregar Cy5 en la célula de flujo (todavía a un caudal de 0,03 ml / min). Al mismo tiempo la hora de inicio de la serie de imagen confocal. </li><li> Cuantificar la penetración Cy5 por radialmente promedio de intensidad Cy5 dentro de una colonia biofilm circular 2-D. Para promedio, primero identificar el borde de un clúster de biofilm, a continuación, generar un mapa de distancia para una sección de 2-D de la agrupaciónY, finalmente, los patrones radiales promedio de las intensidades de Cy5 para generar una curva de penetración (véase la figura 6). <ol><li> Para darse cuenta computacionalmente paso 3.8, utilice Biospa (Análisis del patrón espacial Biofilm) paquete de software (no publicado, paquete de software y manual disponibles bajo petición) u otros programas de análisis de imágenes. </li><li> Para utilizar Biospa, primero importar una imagen definida en Biospa. A continuación, seleccione el umbral adecuado para los canales de las buenas prácticas agrarias y Cy5 para que las imágenes binarias. En el menú de análisis / cálculo, seleccione Análisis Avanzado y luego Análisis Difusión. Utilice el canal de las buenas prácticas agrarias para definir el borde de un clúster y utilizar la herramienta de polígono para seleccionar un clúster como la región de interés (ROI). </li><li> Haga doble clic en el cluster biofilm seleccionado para realizar el análisis de la difusión. Guardar los resultados del análisis de difusión y calibrar la intensidad de Cy5 a la concentración de Cy5 usando una curva de calibración. <ol><li> Para generar Cy5 curva de calibración de concentración, medir intensidades de Cy5 sobre un conce Cy5gradiente ntration bajo microscopía confocal. (Intensidad Cy5 y la concentración tienen una relación lineal.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Caracterización de la Rodeando Flow Field de Seguimiento fluorescente Partículas NOTA: Las partículas fluorescentes, como microperlas fluorescentes, se puede utilizar para caracterizar el campo de flujo alrededor de las biopelículas. Campo de flujo alrededor de biofilms puede calcularse a partir de las observaciones de series de posiciones de las partículas que utilizan el software de seguimiento de partículas velocimetría. Los resultados mostrados aquí fueron obtenidos con el software Streams 2.02 paquete de 16 (descarga de software y guía del usuario disponible en <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> Diluir las microperlas fluorescentes (diámetro ~ 1 mM) en agua esterilizada a una concentración de sólidos final de 0,2% y un volumen final de 0,5 ml. Vortex para asegurarse de que las microperlasson bien dispersado. </li><li> Inyectar y entregar las microperlas fluorescentes diluido en la celda de flujo siguiendo los procedimientos de los pasos 3.3 a 3.5. Para permitir un seguimiento preciso de la trayectoria de la partícula, utilice una tasa relativamente baja de flujo (0,01 ml / h para los resultados de rastreo de partículas en este documento). </li><li> Cambie la configuración confocal al modo XYT para seguir el movimiento de las partículas en un z-slice y tomar imágenes de series de tiempo. (A la velocidad de fotogramas de 1 Hz se utilizó para los resultados representativos que se muestran en este documento.) Repetir la inyección de partículas y la imagen en diferentes lugares z para generar flujo de campo 3-D. </li><li> Pre-proceso de la serie temporal de imágenes confocal restando la señal de fluorescencia de fondo (la señal en la primera imagen adquirida del conjunto de imágenes) utilizando ImageJ (descargar el software y el manual disponible en <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) u otros programas. </li><li> En ImageJ, abrir la primera imagen de un conjunto de imágenes y luego importar el conjunto de imágenes. Bajo Proceso / Imagen Calculator, reste la primera imagen de la imagen de conjunto. Guarde el conjunto de imágenes pre-procesado. </li><li> Para calcular los vectores de flujo, la importación de series de tiempo confocal de imágenes en Streams 2.02. En &quot;vista del proceso abierto&quot;, seleccionar y ejecutar &quot;Identificar partículas&quot;. Utilice umbral adecuado para identificar partículas. Utilice 0,5 y 5 micras de diámetro como umbrales mínimos y máximos de 1 micras partículas. </li><li> A continuación, en &quot;vista del proceso abierto&quot;, seleccionar y ejecutar &quot;análisis de tuberías PTV&quot; para generar trayectorias de las partículas. Compruebe las trayectorias de las partículas para ver si representan el movimiento de las partículas. Por último, seleccionar y ejecutar &quot;Crear campo de velocidad&quot; para generar un mapa vectorial de flujo. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos demostrado una serie de métodos para caracterizar tres importantes interacciones biofilm-ambiente: respuesta biofilm a gradientes químicos, los efectos de la formación de biopelículas en el microambiente que rodea el flujo, y la heterogeneidad biofilm resultante de las limitaciones de transporte interno. En primer lugar, demostramos el uso de una celda de flujo de microfluidos novedoso para imponer un gradiente químico bien definido para el desarrollo de biopelículas. Para generar un g...

Los microorganismos se adhieren a las superficies y formar biopelículas - agregados de células encerradas en una matriz extracelular-polímero 1. Las biopelículas se comportan de manera muy diferente a partir de células microbianas individuales, porque biofilms tienen heterogeneidad espacial dramática resultante de una combinación de limitaciones de transporte de solutos internos y las variaciones espaciales en el metabolismo celular 2,3. Las concentraciones de oxígeno y de nutrientes disminuyen drásticamente en la interfaz entre biofilm y fluido circundante y se agotan más dentro en la biopelícula 2. Las variaciones espaciales en la respiración de biopelículas y la síntesis de proteínas también pueden ocurrir como respuesta al oxígeno localizada y la disponibilidad de nutrientes 2. En los ambientes acuáticos y del suelo, la mayoría de las bacterias viven en los biofilms. Biofilms naturales llevan a cabo importantes procesos biogeoquímicos incluyendo el ciclo del carbono y nitrógeno y reduciendo metales 4,5. Clínicamente, la formación de biopelículas es responsble para pulmonar prolongada e infecciones urinarias 6. Infecciones biofilm asociado son muy problemático porque las células en biofilms tienen muy alta resistencia a los antimicrobianos en comparación con sus homólogos planctónicas 6. Debido a que las biopelículas son importantes en diversos entornos, una cantidad sustancial de investigación se ha centrado en la comprensión de los factores ambientales que controlan las actividades de biofilm y la heterogeneidad espacial en biofilms y el microambiente que rodea. Estudios previos han encontrado que el desarrollo de biopelículas está fuertemente regulada por una serie de factores ambientales: biopelículas se desarrollan diferentes morfologías en diversas condiciones de flujo; oxígeno y nutrientes disponibilidad influencia morfología de la biopelícula; y la tensión de cizallamiento hidrodinámico afecta a la unión de las células planctónicas a las superficies y el desprendimiento de las células de las biopelículas 7-9. Por otra parte, el estado de flujo externo influye en la entrega de los sustratos into y dentro de los biofilms 10. El crecimiento de biofilms también altera rodea condiciones físicas y químicas. Por ejemplo, el crecimiento de biopelículas conduce a la reducción local de oxígeno y nutrientes 2; biofilms se acumulan compuestos inorgánicos y orgánicos desde el ambiente circundante 11; y grupos de biofilm desvían el flujo y el aumento de superficie de fricción 12,13. Debido a que las biopelículas interactúan con su entorno de maneras muy complejas, es fundamental para obtener simultáneamente información sobre las propiedades del biofilm y las condiciones ambientales, y los enfoques multidisciplinarios necesita ser utilizado para caracterizar exhaustivamente interacciones biofilm y medio ambiente. Aquí les presentamos una serie de métodos integrados para caracterizar los patrones espaciales en el crecimiento microbiano en mono-especies y biofilms de doble especies bajo un gradiente nutricional impuesta, y observar la consiguiente modificación de la química local y microambiente fluido. Nos FIRst describen el uso de una celda de flujo microfluídico de doble entrada recientemente desarrollado para observar el crecimiento de biopelícula bajo gradientes químicos bien definidos. A continuación, demuestran el uso de esta celda de flujo de microfluidos para observar el crecimiento de dos especies de bacterias, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, en biofilms bajo un rango de condiciones nutricionales. Se muestra cómo en la visualización in situ de propagación trazador fluorescente en colonias de biopelícula puede ser utilizado para evaluar cuantitativamente los patrones de transporte de solutos en biofilms. Por último, se muestra cómo microescala velocimetría de seguimiento de partículas, realizado con microscopía confocal, se puede utilizar para obtener el campo de flujo local alrededor de las biopelículas que crecen.

<table><tbody><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Configuración de celda de flujo e inoculación</td></tr><tr><td>Tubo de bomba 0.50&nbsp; mm OVC, Naranja/Amarillo</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Configuración e inoculación de la celda</td></tr><tr><td>de flujo Llave de paso de tres vías con cerradura Luer macho giratoria</td><td>Smiths Medical&nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Configuración e inoculación de celdas de flujo</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Encapsulación de celdas solares para la fabricación de paneles solares</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Configuración e inoculación de celdas de flujo</td></tr><tr><td>Pyrex Botella mediana, 1&nbsp; L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Configuración e inoculación de la célula</td></tr><tr><td>de flujo C-FLEX Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Configuración e inoculación de la célula de flujo</td></tr><tr><td>Jeringa de TB de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Configuración e inoculación de la célula de flujo</td></tr><tr><td>Tubo de polímero</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Configuración e inoculación de la célula de flujo</td></tr><tr><td>Adaptador estéril Intramedic Luer Stub Clay</td><td>Adams</td><td>427564</td><td>Configuración e inoculación de la celda</td></tr><tr><td>de flujo PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Configuración e inoculación de la celda de flujo</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>HACH</td><td></td><td>Configuración e inoculación de la celda de flujo</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa estériles (0.2 &mu; m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A Configuración e</td><td>inoculación de la celda de flujo</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Configuración e inoculación de la celda de flujo</td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Medios de crecimiento</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7 Medios de</td><td>crecimiento</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Sulfato de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Sulfato de hierro (II) heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Sulfato de manganeso (II) monohidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Sulfato de zinc heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>sulfato de cobalto (II) heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Molibdato sódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>Luria Bertani Caldo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Sustrato</td></tr><tr><td>TCS SP2 Microscopía confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescente</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Imágenes fluorescentes</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Ciencias de la vida</td><td>PA15100</td><td>Imágenes fluorescentes</td></tr><tr><td>Fluorescente rojo (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Imágenes fluorescentes</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Procesamiento de imágenes</td>de <td>los NIH</td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flujos de procesamiento de imágenes 2.02</td><td>Universidad de Cantebury</td><td></td><td>Procesamiento de imágenes</td></tr></tbody></table>

los métodos para la caracterización de la co-desarrollo de la biopelícula y hábitat heterogeneidad

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Los biofilms son comunidades microbianas unido a la superficie que tienen estructuras complejas y producen heterogeneidades espaciales significativos. El desarrollo del biofilm está fuertemente regulada por el flujo que rodea y el entorno nutricional. El crecimiento de biopelículas también aumenta la heterogeneidad de la microambiente local mediante la generación de campos de flujo complejos y patrones de transporte de solutos. Para investigar el desarrollo de la heterogeneidad en los biofilms y las interacciones entre los biofilms y su micro-hábitat local, crecimos biofilms mono-especies de Pseudomonas aeruginosa y biofilms de doble especies de P. aeruginosa y Escherichia coli bajo gradientes nutricionales en una celda de flujo de microfluidos. Proporcionamos protocolos detallados para la creación de gradientes de nutrientes dentro de la célula de flujo y para el cultivo y visualizar el desarrollo de biopelículas en estas condiciones. También protocolos actuales para una serie de métodos ópticos para cuantificar patrones espaciales en la estructura de la biopelícula, distri fluirbuciones sobre las biopelículas, y el transporte de masa alrededor y dentro de colonias de biopelícula. Estos métodos son compatibles con una amplia investigación sobre el co-desarrollo de biopelículas y la heterogeneidad de hábitats.

La celda de flujo microfluídico de doble entrada permite la observación del crecimiento del biofilm en virtud de un gradiente químico bien definido formado por la mezcla de dos soluciones dentro de la cámara de flujo. El gradiente químico resultante se observó anteriormente por inyección de colorante y caracteriza en detalle por Song et al. 14. Gradientes de concentración lisas se formaron en la dirección transversal, como se muestra en la Figura 1. El perfil de concentración era emp...

Las biopelículas tienen interacciones complejas con su entorno circundante. Para investigar de manera exhaustiva las interacciones entre el biofilm y el medio ambiente, presentamos aquí una serie de métodos para crear un entorno químico heterogéneo para el desarrollo de biopelículas, para cuantificar la velocidad del flujo local y para analizar el transporte de masa dentro y alrededor de las colonias de biopelículas.

Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar las interacciones del biofilm con el entorno circundante mediante métodos integrados para lograrlo. Se construye un sistema de celda de flujo microfluídica con doble entrada en el que medios con glucosa y sin glucosa se bombean a través de una celda de flujo, generando un gradiente de glucosa. Se añaden bacterias al sistema y se permite que los biofilms se desarrollen durante varios días.Los biofilms se analizan luego mediante microscopía confocal 3D para caracterizar el transporte de solutos. Dentro de los biofilms, se inyectan trazadores fluorescentes en el sistema de flujo y se realiza un análisis de imágenes con lapso de tiempo para caracterizar el campo de flujo alrededor de las colonias de biofilm; asimismo, se inyectan microesferas fluorescentes y se lleva a cabo un análisis de imágenes con lapso de tiempo. El análisis del transporte de solutos y el seguimiento de partículas a partir de los datos obtenidos demuestra la utilidad de este método para evaluar los procesos de biofilm en diversos entornos químicos dentro de un único dispositivo y en un conjunto de experimentos.La principal ventaja de estos métodos es que permiten la evaluación simultánea de múltiples aspectos de las interacciones entre los biofilms y su entorno. Los métodos descritos aquí pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la formación de biofilms en ambientes naturales o en infecciones relacionadas con biofilms. Trabaje en una cabina de flujo laminar y transfiera una colonia de Pseudomonas aeruginosa PAO1 GFP y una colonia de Escherichia coli DH5α desde una placa de LB a tubos separados que contengan tres mililitros de caldo LB.Incubar las culturas durante la noche a 37 grados Celsius agitando a 225 RPM. Este sistema de flujo se basa en una celda microfluídica con doble entrada que facilita la observación del crecimiento del biofilm bajo un gradiente químico bien definido, formado por la mezcla de dos soluciones dentro de la cámara de flujo. Durante el flujo, se forma un gradiente de concentración uniforme en la dirección transversal.Como resultado de la difusión, el perfil de concentración es pronunciado cerca de la entrada y más relajado aguas abajo. En el día del experimento, ensamble cuidadosamente el sistema de flujo. Primero, sujete el tubo al interior de la bomba peristáltica, luego conecte un extremo del tubo a un frasco de medio que contenga 900 mililitros de medio FAB con glucosa, y el otro extremo a un trampa de burbujas.Repita este proceso para conectar una segunda botella de medio que contiene 900 mililitros de fab sin glucosa a una segunda trampa de burbujas. A continuación, inserte válvulas de tres vías justo antes de las entradas de la celda de flujo y conecte cada una de las trampas de burbujas a la celda de flujo. Finalmente, conecte la salida de la celda de flujo a una botella de desecho.Asegúrese de que la celda de flujo esté colocada con el cubreobjetos hacia abajo para permitir que las células en suspensión se depositen sobre el cubreobjetos. Una vez ensamblado el sistema de flujo, encienda la bomba peristáltica a un caudal de 10 mililitros por hora para cada entrada, para llenar el sistema. El medio fab se introduce en las dos entradas, con glucosa proporcionada únicamente en una de las entradas. A continuación, trabajando en la cabina de flujo laminar, diluya las dos culturas bacterianas en una proporción de uno a uno en un mililitro de agua estéril, con un OD 600 equivalente de 0,01 para cada bacteria, para inocular la celda de flujo. Utilice una jeringa de plástico estéril para inyectar 500 microlitros del inóculo en cada una de las entradas de la celda de flujo a través de la válvula de tres vías.Después de la inyección, detenga la bomba y permita que las células bacterianas se adhieran al cubreobjetos durante una hora; una vez que las células hayan adherido, configure la bomba a 0,03 mililitros por minuto para cada entrada y permita que el sistema fluya durante tres días a temperatura ambiente, durante los cuales se desarrolla un biofilm bajo un gradiente de exposición a glucosa. Después de transcurridos tres días, use un marcador y una regla para dibujar una cuadrícula en el lado del cubreobjetos de la celda de flujo, en preparación para la adquisición de imágenes.Esto ayudará a localizar las regiones de imagen para la tinción contraria para observar e coli. Primero, apague las luces para oscurecer el área de trabajo, ya que la tinción contraria es sensible a la luz. Utilice una jeringa para inyectar lentamente un mililitro de tinción roja fluorescente de ácidos nucleicos permeable a las células, diluida, en la válvula de tres vías situada aguas arriba de la cámara de flujo.Detenga el flujo. Mantenga la celda de flujo estancada en la oscuridad durante 30 minutos. Después de que hayan transcurrido 30 minutos.Reanude el flujo a 0,03 mililitros por minuto y lave el colorante no unido durante 15 minutos. Luego detenga el flujo y observe los biofilms mediante microscopía confocal con un objetivo de 63 x. Busque un campo de visión que contenga una buena cantidad de biomasa con colonias de biofilm bien separadas, como se muestra aquí.Luego, capture pilas de imágenes 3D en los canales apropiados para mapear los patrones espaciales del desarrollo del biofilm dentro de la imagen de la celda de flujo, los biofilms en tres o más distancias longitudinales o en el eje X a lo largo de la entrada de la celda de flujo, y en tres posiciones transversales o en el eje Y con respecto al gradiente nutricional impuesto. Para caracterizar los patrones de transporte de solutos dentro del biofilm, comience con la celda de flujo. Tras tres días de desarrollo del biofilm, nuevamente, trabajando en la oscuridad.Detenga la bomba para pausar el flujo, abra las trampas de burbujas para liberar la presión de inyección. Luego, use una jeringa para inyectar un mililitro de solución diluida del trazador sci-fi en cualquiera de las válvulas de tres vías aguas arriba de la celda de flujo. Después de inyectar la solución sci-fi, cierre las trampas de burbujas.Ajuste la válvula de tres vías y reinicie la bomba a 0,03 mililitros por minuto para entregar la solución sci-fi a la celda de flujo. A continuación, cambie el modo de imagen confocal a XYT con una frecuencia de cuadros de 0,15 hercios. Se prefiere una alta resolución temporal para describir la penetración del colorante, sin embargo, el escaneo rápido disminuye la calidad de la imagen.Por lo tanto, ajuste la velocidad de escaneo y el promedio de líneas para equilibrar la resolución temporal de la imagen y la calidad de la imagen. Una vez establecidos los parámetros de imagen, reinicie la bomba para reanudar el flujo. A una velocidad de 0,03 mililitros por minuto, sci cinco se entregará simultáneamente en la celda de flujo.Inicie la adquisición confocal con lapso de tiempo. Una vez completada la adquisición con lapso de tiempo, realice el análisis de difusión según las instrucciones del documento adjunto.Para caracterizar el campo de flujo alrededor de los biofilms, diluya las microesferas fluorescentes de un micrómetro en agua esterilizada hasta una concentración sólida final del 0,2 % y un volumen final de 0,5 mililitros. Luego, agite en vórtex para asegurarse de que las microesferas estén bien dispersas, detenga el flujo e inyecte y administre las microesferas fluorescentes diluidas en la celda de flujo. Como antes, ajuste la velocidad de flujo a 0,01 mililitros por hora.La baja velocidad de flujo permite un seguimiento preciso de la trayectoria de la partícula. Cambie la configuración del microscopio confocal al modo XYT e indique al software que siga el movimiento de la partícula en una sola rebanada Z. Capture imágenes de series temporales como antes, utilizando una velocidad de cuadro de un hercio.Repita el procedimiento de inyección de partículas e image en diferentes ubicaciones en Z. Tras completar la adquisición de imágenes, siga las instrucciones del documento adjunto para calcular los vectores de flujo y estudiar las interacciones bacterianas en un biofilm bajo un gradiente de glucosa. Posa GFP y E coli se diferenciaron en biofilms de doble especie mediante tinción contrastante.Con cyto se adquirieron 62 imágenes en cada una de las nueve regiones de imagen en la cámara de flujo. En las superposiciones mostradas aquí, posa GFP aparece verde o amarillo, y e coli aparece rojo. Posa dominó la biomasa del biofilm en regiones con altas concentraciones de glucosa, y e coli dominó en regiones con bajas concentraciones de glucosa.Por lo tanto, las dos especies ocuparon nichos ecológicos distintos. Estos resultados demuestran la utilidad de la celda de flujo microfluídica de doble entrada para estudiar la actividad del desarrollo de biopelículas y sus interacciones en ambientes complejos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar una celda de flujo microfluídica de doble entrada para cultivar biopelículas bajo gradientes químicos y de cómo obtener parámetros ambientales para el desarrollo de biopelículas mediante la inyección de partículas fluorescentes o rastreadores después del desarrollo.Estos métodos allanaron el camino para que los investigadores en los campos de la microbiología ambiental y clínica exploraran las complejas interacciones entre las comunidades microbianas y su entorno circundante.

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Establecimiento de una cocultura fúngico-bacteriana para la formación de biopelículas

Se presenta un protocolo para la cuantificación y comparación concurrente de tres componentes celulares y extracelulares dentro de biofilms. La metodología implica el uso de microscopía de escaneo láser confocal, software de análisis y visualización estructural de biopelículas y software de análisis estadístico.

Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

El objetivo de este documento métodos es describir el uso de un sistema de microfluidos para el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen especies típicamente identificados en la placa dental supragingival humano. Métodos para describir la arquitectura de biopelículas, la viabilidad de biopelículas, y un acercamiento a la cosecha biofilm para los análisis dependientes de la cultura o la cultura independiente se destacan.

El uso de un gran procesamiento<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies

El papel de surtido (segregación espacial) en escenarios de evolución puede ser examinada usando sistemas microbianos simples en el laboratorio que permiten el ajuste de la distribución espacial controlada. Mediante la modificación de la densidad celular fundador, varios niveles de surtido pueden ser visualizados utilizando cepas bacterianas marcadas con fluorescencia en las biopelículas de colonias de Bacillus subtilis.

Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

Este protocolo describe un nuevo método para hacer crecer y cualitativamente analizar biopelículas bacterianas en hifas de los hongos por microscopía confocal y electrónica.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Citometría de flujo en combinación con agrupamiento visual ofrece un método rápido y fácil de usar para el estudio de biopelículas acuáticas. Puede ser utilizado para la caracterización de biopelículas, detección de cambios en la estructura de la comunidad de biofilm y la detección de partículas abióticas en el biofilm.

Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo

Las biopelículas microbianas forman arquitecturas complejas en las interfases y se convierten en patrones espaciales altamente dependientes de la escala. Aquí, presentamos un sistema experimental (duro y software) para la adquisición automatizada de conjuntos de datos de tomografía de coherencia óptica 3D (OCT). Este conjunto de herramientas permite la caracterización no invasiva y multiescala de la morfogénesis de biopelículas en el espacio y el tiempo.

Tomografía de coherencia óptica 3D automatizada para dilucidar la morfogénesis de Biofilm a grandes escalas espaciales

Los cambios inducidos por antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa difieren entre los aislados clínicos cultivados de pacientes con fibrosis quística e infección pulmonar crónica. Después de la microscopía confocal, el software COMSTAT se puede utilizar para cuantificar las variaciones en la arquitectura de la biopelícula (por ejemplo, área de superficie, espesor, biomasa) para aislados individuales para evaluar la eficacia de los agentes antiinfecciosos.

Cuantificación de los efectos de los antimicrobianos en la arquitectura de biopelículas in vitro mediante el software COMSTAT

Aquí se presenta un procedimiento rápido y estandarizado para establecer comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie de varios suelos de rizosfera. Se trata de un protocolo único diseñado para sondear y simular la compleja rizosfera de la microbiota del suelo.

Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera

Aprenda a caracterizar interacciones de biopelículas con su entorno usando un sistema de flujo microfluídico de doble entrada. Este método permite generar gradientes químicos controlados y analizar dinámicas de transporte con microscopía confocal 3D.

Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad

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