Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar las interacciones de la biopelícula con el entorno circundante utilizando métodos integrados para hacerlo. Se construye un sistema de celda de flujo microfluídico de doble entrada en el que los medios que contienen glucosa y los medios libres de glucosa se bombean a través de una celda de flujo generando un gradiente de glucosa. Las bacterias se agregan al sistema y se permite que las biopelículas se desarrollen en el transcurso de varios días.

A continuación, se obtienen imágenes de las biopelículas mediante microscopía confocal 3D para caracterizar el transporte de solu. Dentro de las biopelículas, se inyectan trazadores fluorescentes en el sistema de flujo y se realizan imágenes de lapso de tiempo para caracterizar el campo de flujo alrededor de las colonias de biopelícula, se inyectan microperlas fluorescentes y se realizan imágenes de lapso de tiempo. El transporte de solutos y el análisis de seguimiento de partículas de los datos resultantes demuestran la utilidad de este método en la evaluación de procesos de biopelículas en varios entornos químicos dentro de un solo dispositivo y en un conjunto de experimentos.

La principal ventaja de estos métodos es que permiten la evaluación simultánea de múltiples aspectos de las interacciones entre el biofilm y el entorno. Los métodos reportados aquí pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la formación de biopelículas en ambientes naturales o en infecciones relacionadas con biopelículas. Trabajando en una campana de flujo laminar, transfiera una colonia de posa PAO, un extremo GFP y una colonia de e. coli DH cinco alfa de una placa LB a tubos separados que contienen tres mililitros de caldo lb.

Incubar los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados mientras se agitan a 225 RPM. Este sistema de flujo se basa en una celda microfluídica de doble entrada que facilita la observación del crecimiento de la biopelícula bajo un gradiente químico bien definido formado por la mezcla de dos soluciones dentro de la cámara de flujo. Durante el flujo, se forma un gradiente de concentración suave en la dirección transversal.

Como resultado de la difusión, el perfil de concentración es empinado cerca de la entrada y más relajado aguas abajo. El día del experimento, ensamble cuidadosamente el sistema de flujo. Primero, sujete el tubo a la bomba peristáltica, luego conecte un extremo del tubo a una botella mediana que contenga 900 mililitros de medio FAB con glucosa y el otro extremo a una trampa de burbujas.

Repita este proceso para conectar una segunda botella mediana que contenga 900 mililitros de fab sin glucosa a una segunda trampa de burbujas. A continuación, inserte las válvulas de tres vías justo antes de las entradas de la celda de flujo y conecte cada una de las trampas de burbujas a la celda de flujo. Finalmente, conecte la salida de la celda de flujo a una botella de desecho.

Asegúrese de que la celda de flujo esté colocada con el lado de la cubierta hacia abajo para permitir que las celdas suspendidas se asienten en la cubierta deslizante. Después de ensamblar el sistema de flujo, encienda la bomba peristáltica a un caudal de 10 mililitros por hora para cada entrada para llenar el sistema. Con el medio fabuloso se introduce medio en las dos entradas con una glucosa proporcionada solo en una entrada. A continuación, trabajando en la campana, diluya los dos cultivos bacterianos en una proporción de uno a uno en un mililitro de agua estéril con un OD 600 equivalente de 0,01 para cada bacteria para inocular la celda de flujo, use una jeringa de plástico estéril para inyectar 500 microlitros del inóculo en cada una de las entradas de la celda de flujo a través de la válvula de tres vías.

Después de la inyección, detenga la bomba y permita que las células bacterianas se adhieran al cubreobjetos durante una hora después de que las células se hayan unido, ajuste la bomba a 0,03 mililitros por minuto para cada entrada y permita que el sistema fluya durante tres días a temperatura ambiente, durante los cuales se desarrolla una biopelícula bajo un gradiente de exposición a la glucosa. Pasados tres días. Use un marcador y una regla para dibujar una cuadrícula en el lado del vidrio de la celda de flujo en preparación para la obtención de imágenes.

Esto ayudará a localizar las regiones de la imagen para contrarrestar la tinción para la visualización de E. coli. Primero, apague las luces para oscurecer el área de trabajo, ya que la mancha del mostrador es sensible a la luz. Use una jeringa para inyectar lentamente un mililitro de tinción de ácido nucleico fluorescente rojo permeado de células diluidas en la válvula de tres vías aguas arriba de la cámara de flujo.

Detén el flujo. Mantenga la celda de flujo estancada en la oscuridad durante 30 minutos. Pasados 30 minutos.

Reanude el flujo a 0,03 mililitros por minuto y lave la mancha no consolidada durante 15 minutos. A continuación, detenga el flujo y observe las biopelículas mediante microscopía confocal con un objetivo de 63 x. Encuentre un campo de visión que contenga una buena cantidad de biomasa con colonias de biopelícula que estén bien separadas como se muestra aquí.

A continuación, capture pilas de imágenes 3D en los canales apropiados para mapear los patrones espaciales del desarrollo de biopelículas dentro de la imagen de la célula de flujo, las biopelículas a tres o más distancias longitudinales o X a lo largo de la entrada de la célula de flujo, y a tres posiciones transversales o Y en relación con el gradiente nutricional impuesto. Para caracterizar los patrones de transporte de solu dentro de la biopelícula, comience con la celda de flujo. Después de tres días de revelado de la biopelícula, de nuevo, trabajando en la oscuridad.

Detenga la bomba para detener el flujo, abra las trampas de burbujas para liberar la presión de inyección. A continuación, utilice una jeringa para inyectar un mililitro de solución trazadora de ciencia ficción diluida en cualquiera de las válvulas de tres vías aguas arriba de la celda de flujo. Después de inyectar la solución de ciencia ficción, cierre las trampas de burbujas.

Ajuste la válvula de tres vías y reinicie la bomba a 0,03 mililitros por minuto para entregar la solución de ciencia ficción a la celda de flujo. A continuación, cambie el modo de imagen confocal a XYT con una velocidad de fotogramas de 0,15 hercios. Se prefiere una resolución temporal alta para verbalizar la penetración del tinte, sin embargo, el escaneo rápido disminuye la calidad de la imagen.

Por lo tanto, configure la velocidad de escaneo y el promedio de línea para equilibrar el tiempo, la resolución de la imagen y la calidad de la imagen. Una vez que se hayan configurado los parámetros de imagen, reinicie la bomba para reanudar el flujo. A una velocidad de 0,03 mililitros por minuto, se suministrarán cinco cilindros a la celda de flujo simultáneamente.

Inicie la creación de imágenes confocales de lapso de tiempo. Una vez que se completan las imágenes de lapso de tiempo. Análisis de difusión realizado de acuerdo con las instrucciones del documento adjunto.

Para caracterizar el campo de flujo alrededor de las biopelículas, diluya las microesferas fluorescentes de un micrómetro en agua esterilizada hasta una concentración sólida final de 0,2% y un volumen final de 0,5 mililitros. Luego, haga un vórtice para asegurarse de que las microperlas estén bien dispersas, detenga el flujo y luego inyecte y entregue las microperlas fluorescentes diluidas en la celda de flujo. Como antes, cambie el caudal a 0,01 mililitros por hora.

El bajo caudal permite un seguimiento preciso de la trayectoria de las partículas. Cambie la configuración confocal al modo XYT e instruya al software para que rastree el movimiento de las partículas en una rebanada Z. Capture imágenes de series temporales como antes utilizando una velocidad de fotogramas de un hercio.

Repita el procedimiento de inyección de partículas y la imagen en diferentes ubicaciones Z. Después de completar las imágenes, siga las instrucciones del documento adjunto para calcular los vectores de flujo para estudiar las interacciones bacterianas en una biopelícula bajo un gradiente de glucosa. Posa GFP y E. coli se diferenciaron en biopelículas de doble especie mediante contratinción.

Con cyto 62 se adquirieron imágenes en cada una de las nueve regiones de imagen de la cámara de flujo. En las superposiciones que se muestran aquí, posa GFP aparece en verde o amarillo, y E. coli aparece en rojo. Posa dominó la biomasa de biopelícula en regiones con altas concentraciones de glucosa y E. coli dominó en regiones con bajas concentraciones de glucosa.

Por lo tanto, las dos especies ocuparon nichos ecológicos distintos. Estos resultados demuestran la utilidad de la celda de flujo microfluídico de doble entrada en el estudio de la actividad de desarrollo de biopelículas y las interacciones en entornos complejos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar una celda de flujo microfluídico de doble entrada para cultivar biopelículas bajo gradientes químicos y cómo obtener parámetros ambientales para el desarrollo de biopelículas utilizando las inyecciones de partículas fluorescentes o cazadores después del desarrollo.

Estos métodos allanaron el camino para que los investigadores en los campos de la microbiología ambiental y clínica exploraran interacciones complejas entre las comunidades microbianas y su entorno circundante.