La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

El objetivo general de este procedimiento es determinar la movilidad de la proteína de fluorescencia verde mejorada mediante la medición de la frap de la proteína en una región de interés. Esto se logra mediante un primer seccionamiento del vector EGFP en neuronas de hipocampo de rata cultivadas. A continuación, el registro de Fre se realiza en una columna vertebral de interés utilizando un microscopio confocal Zeiss seven 10.

La tasa de fotoblanqueo se puede calcular utilizando el software Image J y GraphPad Prism. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la movilidad de EGFP en una columna vertebral a partir de una neurona del hipocampo cultivada a través de microscopía confocal. Este protocolo fue desarrollado por Chazen en colaboración conmigo, Ronald Pet, así como con Ya, Wang Bahar Kisha, y el autor principal del artículo original, Robert Ol, quien murió en octubre de 2009.

Dedicamos este video a su memoria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la dinámica de proteínas, como la tasa de renovación de una proteína de interés en una región de interés. Comience este procedimiento cultivando neuronas embrionarias de hipocampo de rata de día 18 en placas de fondo de vidrio de 35 milímetros recubiertas de poli de lisina en placas de transfectación in vitro de 16 a 18 días utilizando el kit de transfección de mamíferos Cal Foss de tecnología de clones antes de comenzar la transfección.

Guarde el medio de cultivo original en un tubo estéril de 15 mililitros para su uso posterior. Llene cada plato de 35 milímetros con 1,5 mililitros de medio de águila modificado de DOL eco 30 minutos antes de la transfección. A continuación, combine 10 microgramos de P-E-G-F-P-N un ADN plasmático con 12,4 microlitros de solución de calcio bimolar y eleve el volumen total a 100 microlitros con agua estéril.

Agregue la mezcla de ADN DROPWISE a 100 microlitros de dos x montones de solución salina tamponada. Vórtice del búfer después de cada gota que se añade. Después de dejar reposar la mezcla final a temperatura ambiente durante 20 minutos, agregue la solución tampón de ADN a las neuronas incubadas DMEM.

Incuba las neuronas a 37 grados centígrados durante una a una hora y media. Después de la incubación, retire el medio que contiene fosfato de calcio de las placas de cultivo y lave las células con DMEM. Repetir el lavado DMEM un total de tres veces.

Intercambie el medio DMEM con el medio de cultivo original antes de devolverlos a la incubadora. Las neuronas se utilizan para el experimento de fracking de dos a cuatro días después de la transfección. Para empezar, sustituya inmediatamente el medio de cultivo en el plato de fondo de vidrio de 35 milímetros por una solución Prewarm Tyro.

Para el experimento de fracking se utiliza un microscopio confocal Zeiss LSM seven 10. El sistema de módulos temporales Zeiss mantiene la temperatura, la humedad y el porcentaje de dióxido de carbono del sistema de trabajo. Asegúrese de que el tanque de dióxido de carbono esté conectado y que la botella de agua, que se usa para equilibrar la humedad, esté llena de agua.

Una vez que el microscopio esté configurado, busque una dendrita madura transfectada con el objetivo 100 x. Si las células transfectadas en la placa son escasas, busque una célula deseada con el objetivo 40 x. A continuación, cambia al objetivo 100 x.

Para capturar imágenes, utilice un zoom óptico de cinco aumentos y una resolución de 2 56 x 2 56 píxeles. Para imaginar un trozo corto de dendrita con varias espinas. Para capturar imágenes, utilice la velocidad nominal nueve, que tarda 0,5 segundos.

Para finalizar un escaneo, ajuste el orificio a dos micrómetros para obtener una fluorescencia fuerte. Al tomar imágenes, intente utilizar una transmisión láser baja, por ejemplo, de uno a 5% para evitar el fotoblanqueo de toda la imagen. A continuación, seleccione la columna vertebral de interés para este experimento.

Se eligen espinas de hongos con diámetros de cabeza de espina de aproximadamente un micrómetro para realizar un experimento de envoltura. Tome cinco imágenes de control antes del blanqueo, luego blanquee el lomo de interés 10 veces al 100% nominalLa transmisión láser captura una serie de imágenes inmediatamente después del blanqueo. El intervalo de tiempo debe ajustarse de acuerdo con las diferentes proteínas diana y los diferentes diseños experimentales.

Para este experimento, las imágenes se capturan cada segundo durante 15 segundos después del blanqueo. A continuación, guarde las imágenes para analizar los datos. Abrir imágenes con el software Image J alinee la pila de imágenes con la herramienta alineada para que el lomo de interés no flote y permanezca en la misma posición.

En la imagen, mida la intensidad relativa de fluorescencia de la columna vertebral de interés, que es una región transfectada pero sin blanquear. Mida la región de fondo en imágenes de lapso de tiempo con la herramienta de monitoreo de intensidad versus tiempo de la imagen J.Utilice una región no fluorescente como la curva de la región de fondo para ajustar la intensidad fluorescente con una ecuación exponencial de una fase en el software GraphPad, Prism u otro software similar. Por último, calcule el porcentaje de fracción móvil e inmóvil de fluorescencia. Mostrado.

Aquí están las mediciones de fracking de la fluorescencia de EGFP en una columna vertebral de una neurona del hipocampo cultivada. La región del control del lomo y el fondo están marcados, y la punta de flecha roja indica el momento del fotoblanqueo. Se tomaron fotografías de la misma área antes y a los 0, 1, 5, 10 y 15 segundos después del fotoblanqueo.

Las curvas FRA de fluorescencia EGFP se muestran durante un período de 15 segundos con los puntos en las curvas que representan el FRA en cada segundo. Las curvas se ajustaron mediante ecuaciones exponenciales monofásicas. La fluorescencia promedio antes del fotoblanqueo se contó como 100%En este experimento, la fracción móvil es del 87% y la fracción inmóvil es del 13%A.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la movilidad de la proteína marcada con GFP A mediante la técnica FRAPPE.