Name: La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprende a medir la movilidad de proteínas EGFP en espinas dendríticas de neuronas de hipocampo de rata mediante FRAP. Este método cuantifica fracciones móviles e inmóviles para estudiar dinámica proteica sináptica.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Desórdenes de la Comunicación (NIDCD) Programa Intramural.

1. Neurona transfección <ol><li> Cultura embrionarias neuronas de rata de 18 días (E18) del hipocampo en poli-D-lisina MatTek de 35 mm con fondo de cristal platos 1. En 16-18 días in vitro (DIV), las neuronas transfectar mediante el kit de Clontech CalPhos transfección de mamíferos. En primer lugar, sustituir el medio de cultivo con 1,5 ml de <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">Dulbecco modificado del medio Eagle</a> (DMEM) por 35 mm plato de 0,5 horas antes de la transfección. Salvar el medio de cultivo original en un tubo estéril de 15 ml para más adelante (paso 1.6) el uso. </li><li> Mezcla de 10 mg pEGFP-N1 ADN plásmido con estériles de H 2 O (Clontech) y 12,4 l 2 M solución de calcio (Clontech) para un volumen total de 100 microlitros. </li><li> Añadir la mezcla del paso 1.2) a 100 l 2 × HBS, gota a gota, mientras que 2 × EPF agitación a velocidad media. </li><li> Deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego agregar la mezcla final del paso 1.3) en DMEM-incubaron las neuronas. </li><li> Poner a las neuronas de nuevo en la incubadora a 37 ° C durante 1-1,5 horas. </li><li> Eliminar el fosfato que contienen calcio medio, lavar las células con DMEM tres veces. Antes de regresar la placa de cultivo a la incubadora, el cambio de medio DMEM con el medio de cultivo original. </li></ol> 2. FRAP experimento en una columna <ol><li> Las neuronas son utilizados para el experimento FRAP dos a cuatro días después de la transfección. </li><li> Vuelva a colocar el medio de cultivo de los 35 mm con fondo de cristal plato, por añadir inmediatamente pre-calentado solución Tyrode, que contiene (en mM) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, glucosa 10, glicina 0,005, CaCl2 2,6, y MgCl 2 1.3 (pH ajustado a 7,4 con NaOH). </li><li> A Zeiss LSM 710 microscopio confocal se utiliza para el experimento FRAP. El sistema TempModule Zeiss se utiliza para controlar la temperatura (37 ° C), la humedad y el CO 2 (5%) del sistema de trabajo. Asegúrese de que el cilindro de CO 2 está conectado y la botella de agua, que se utiliza para el equilibrio de humedad, se llena de agua. </li><li> Buscar una dendrita transfectadas madura con el objetivo de 100 × (αplan-Apochromat × 100 / 1,46 de aceite). Si las células transfectadas en el plato son escasos, la búsqueda de una célula deseado con el objetivo de 40 × (Plan-Neofluar 40 × / 1,3 de aceite), y luego cambiar a los 100 × objetivo de capturar imágenes. </li><li> Use 5 x zoom óptico y una resolución de 256 × 256 píxeles a la imagen de un pequeño trozo de la dendrita con varias espinas. Para capturar imágenes, utilizar la velocidad nominal 9 (pixel tiempo de permanencia 3,15 microsegundos) que tarda 0,5 segundos para finalizar el análisis. El agujero está en 2μm para obtener fuerte fluorescencia. Al tomar las imágenes, trate de usar la transmisión de láser de baja, por ejemplo, 5.1%, para evitar photobleaching toda la imagen. </li><li> Seleccione la columna vertebral de su interés. En nuestro experimento, elegimos espinas de setas con sus diámetros columna jefe de ~ 1 micra. </li><li> Para hacer un experimento FRAP, tomar 5 imágenes de control antes del blanqueo, después cloro de la columna vertebral de interés 10 veces en la transmisión nominal láser 100% [El poder de láser de argón es de 30 mW, con un 50% (15 mW) en la línea de láser de 488, y mW aproximadamente 4.3 alcanza el microscopio a través de la línea láser 488], y luego capturar una serie de imágenes inmediatamente después de la decoloración. Para este experimento, las imágenes se capturan cada 1 segundo durante 15 segundos después del blanqueamiento. El intervalo de tiempo se ajustará de acuerdo a las diferentes proteínas de la focalización y diferentes diseños experimentales (Fig. 1). </li><li> Guardar las imágenes. </li></ol> 3. Análisis de los datos <ol><li> Abrir las imágenes con el software ImageJ. </li><li> Alinee la pila de imágenes utilizando la herramienta de alineación ('pilas - arrastrando los pies', 'plugins' → → 'alinear cortes en la pila de' → 'cuerpo rígido "de" traducción "y / o) en ImageJ, de modo que la columna vertebral de interés no flota , en otras palabras - que permanece en la misma posición en la imagen. </li><li> Medir la intensidad de fluorescencia relativa de la columna vertebral de interés (F s), una región, pero sin blanquear transfectadas (control), y una región de fondo (F b) en las imágenes lapso de tiempo, utilizando la herramienta de la "intensidad v Time Monitor 'de ImageJ (' plugins '→' pilas - arrastrando los pies '→' Intensidad v Time Monitor '). La región de control podría ser una pieza de bien enfocada dendrita distal. La región de fondo es una región no fluorescente. </li><li> Calcular la tasa de photobleaching (r) mediante la comparación de la fluorescencia de la región de control antes de (F c0) y después (F c) photobleaching. r = F c / F c0. </li><li> Normalizar la intensidad de la fluorescencia de la columna de destino (F) de la siguiente manera: F = (F s - F b) / r. </li><li> Ajuste de la curva de la intensidad de la fluorescencia de la columna de destino con una ecuación de una fase exponencial de software GraphPad Prism (Fig. 2) o Other software similar. </li><li> Calcular la fracción móvil (f m) y la fracción inmóvil (f i) por las siguientes ecuaciones: f m = ∞ F / F 0, donde F ∞ es la intensidad de la fluorescencia después de la recuperación completa, y F 0 es la intensidad de fluorescencia antes de photobleaching. f i = 1 - f m. </li></ol> 4. Los resultados representativos: En este estudio, llevamos a cabo un experimento FRAP en las neuronas del hipocampo madura. A 18-22 DIV, espinas de setas ya están formados. Con nuestro método, los cambios dinámicos de la intensidad de fluorescencia en una pequeña región, como una columna vertebral, se puede grabar. Para analizar el proceso de recuperación de fluorescencia de EGFP, tomamos 5 imágenes como los controles antes del blanqueamiento y luego una imagen cada 1 segundo inmediatamente después de la decoloración durante 15 segundos. La resolución de la imagen es suficiente para el análisis cuantitativo. Los perfiles de la recuperación de la fluorescencia de etiquetado proteínas de fluorescencia son altamente reproducibles. También brevemente se muestra cómo definir las fracciones móviles e inmóviles de una proteína de fluorescencia, usando ImageJ y el software GraphPad Prism. El método FRAP y el análisis que mostramos aquí pueden ser ampliamente utilizados en la neurociencia, la biología celular y otros estudios. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. FRAP mediciones de EGFP fluorescencia en una columna de una neurona del hipocampo cultivadas. Las puntas de flecha roja indica el tiempo de photobleaching. Las fotografías representan la misma zona antes (Pre) y photobleaching a los 0, 1, 5, 10, 15 segundos después. La región de la columna vertebral, el control y el fondo están marcadas con las letras S, C y B, respectivamente. Las neuronas se mantienen a 37 ° C durante el experimento. Barra de escala, 1 micra. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. FRAP curvas de EGFP fluorescencia en un periodo de 15 segundos. La línea verde muestra la curva original, la línea roja muestra la curva normalizada. Los puntos en las curvas muestran el FRAP cada 1 segundo. Las curvas se ajustaron a una fase de ecuaciones exponenciales. La media de fluorescencia photobleaching antes se había contado el 100%. En este experimento, la fracción móvil (MF) es del 94% y la fracción inmóvil (SI) es del 6%.

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

Análisis FRAP ha sido ampliamente utilizado in vivo e in vitro estudios 1-2. Esta técnica utiliza comúnmente GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Proteína de fusión">proteínas de fusión</a> , aunque también se podría utilizar el rojo proteínas de fusión alga 3. Este análisis es sensible y puede ser utilizado para caracterizar la movilidad de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas. Para producir el análisis FRAP sentido, es importante para evitar photobleaching innecesarios antes y durante el experimento FRAP. Hay dos maneras de lograr esto. En primer lugar, el proceso de buscar y observar la neurona experimental debe ser rápida. Sobre todo, la observación de las neuronas con un objetivo 100X durante mucho tiempo significativamente blanquea la fluorescencia. Segunda potencia, y el escaneo láser de alta frecuencia a menudo aumentan la posibilidad de photobleaching. Por lo tanto, será necesario calcular la tasa de photobleaching en una región de control y normalización de la curva del FRAP en la región experimental. El método de normalización se ha descrito en el protocolo (ver paso 3.3-3.5 para más detalles). El paso photobleaching también es fundamental para garantizar buenos resultados FRAP. En este experimento, blanqueador de la columna vertebral de interés 10 veces al 100% de transmisión de láser. Esta condición es suficiente para blanquear la fluorescencia de una columna a nivel de base en una preparación fija. Por lo tanto, ajustar la intensidad de fluorescencia para el mismo número que de fondo a 0 segundos después de photobleaching. Dependiendo de la velocidad de la primera exploración, una cantidad importante de recuperación de fluorescencia ya puede ser detectado cuando la proteína de interés es muy móvil. Muchas sondas de la proteína fluorescente se han desarrollado para estudiar la dinámica de las proteínas con el FRAP. Un enfoque complementario es, por ejemplo, para utilizar fotoactivables GFP (PA-GFP), o variantes fotoconvertible. Junto con la técnica FRAP, estas herramientas son cada vez más imprescindible para vivir estudios de células de imágenes 4.6.

<table><tbody><tr><td>Placas de vidrio de fondo de 35 mm</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfección mamífero CalPhos</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido pEGFP-N1</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Zeiss</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Zeiss TempModule</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Software GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (frap) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP se ha utilizado para cuantificar la movilidad de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas. El uso de un láser de excitación fuerte, la fluorescencia de la proteína GFP-etiquetados se blanquea en la región de interés. La fluorescencia de la región se recupera cuando el crudo de proteína GFP-etiquetados desde fuera de la región se difunde en la región de interés. La movilidad de la proteína se analiza mediante la medición de la tasa de recuperación de fluorescencia. Esta técnica podría ser usada para caracterizar la movilidad de la proteína y la tasa de rotación. En este estudio, que expresan el vector (aumento de proteína verde fluorescente) EGFP en cultivos de neuronas del hipocampo. Usando el microscopio confocal Zeiss 710, que photobleach la señal de fluorescencia de la proteína GFP en una sola columna, y luego tomar imágenes de lapso de tiempo para registrar la recuperación de fluorescencia después de photobleaching. Por último, estimar el porcentaje de fracciones móviles e inmóviles de la GFP en las espinas, mediante el análisis de los datos de imagen usando ImageJ y softwares Graphpad. Este protocolo FRAP muestra cómo realizar un experimento FRAP básica, así como la forma de analizar los datos.

FRAP se ha utilizado para cuantificar la movilidad de la proteína verde fluorescente (GFP) de etiquetado proteínas en células cultivadas. Se examinaron las fracciones móviles / inmóviles de la GFP mediante el análisis del porcentaje de recuperación después de fluorescencia photobleaching. En este estudio, FRAP llevó a cabo en las espinas de las neuronas del hipocampo.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

La técnica FRAP se ha utilizado para cuantificar la movilidad de proteínas marcadas con GFP. Mediante el uso de un láser de excitación potente, se blanquea la fluorescencia de una proteína marcada con GFP...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la movilidad de la proteína verde fluorescente mejorada mediante la medición del blanqueamiento fluorescente recuperado después de un pulso de fotodegradación (FRAP) de la proteína en una región de interés. Esto se logra primero transfectando el vector EGFP en neuronas hipocampales de rata en cultivo. A continuación, se realiza la grabación FRAP en una espina de interés utilizando un microscopio confocal Zeiss seven 10.La tasa de fotoblanqueamiento puede calcularse entonces utilizando el software Image J y GraphPad Prism. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la movilidad de EGFP en una espina de una neurona hipocampal en cultivo mediante microscopía confocal. Este protocolo fue desarrollado por Chazen en colaboración conmigo, Ronald Pet, así como con Ya, Wang Bahar Kisha, y el autor principal del artículo original, Robert Ol, quien falleció en octubre de 2009.Dedicamos este video a su memoria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la dinámica de proteínas, como la tasa de renovación de una proteína de interés en una región de interés. Comience este procedimiento cultivando neuronas hipocampales de rata del día embrionario 18 en placas de vidrio de fondo transparente de 35 milímetros recubiertas con poli-D-lisina durante 16 a 18 días in vitro, y transfecte las neuronas utilizando el kit de transfección mamífero CloneTech CalFectin antes de comenzar la transfección.Guarde el medio de cultivo original en un tubo estéril de 15 mililitros para su uso posterior. Llene cada placa de 35 milímetros con 1.5 mililitros de medio de Eagle modificado DOL eco 30 minutos antes de la transfección. A continuación, combine 10 microgramos de ADN plasmídico P-E-G-F-P-N uno con 12.4 microlitros de solución de calcio dos molar y complete el volumen hasta 100 microlitros con agua estéril.Añada la mezcla de ADN GOTA A GOTA a 100 microlitros de solución salina tamponada al doble. Vortexee el tampón después de añadir cada gota. Tras dejar reposar la mezcla final a temperatura ambiente durante 20 minutos, añada la solución de ADN en tampón a las neuronas incubadas en DMEM.Incubar las neuronas a 37 grados Celsius durante una hora y media. Después de la incubación, retirar el medio que contiene fosfato de calcio de las placas de cultivo y lavar las células con DMEM. Repetir el lavado con DMEM un total de tres veces.Sustituya el medio DMEM por el medio de cultivo original antes de devolverlos al incubador. Las neuronas se utilizan para el experimento de frack de dos a cuatro días después de la transfección. Para comenzar, reemplace inmediatamente el medio de cultivo en la placa de fondo de vidrio de 35 milímetros con la solución Tyro precalentada.Se utiliza un microscopio confocal Zeiss LSM seven 10 para el experimento de frack. El sistema de módulo térmico Zeiss mantiene la temperatura, la humedad y el porcentaje de dióxido de carbono del sistema en funcionamiento. Asegúrese de que el tanque de dióxido de carbono esté conectado y de que la botella de agua, utilizada para equilibrar la humedad, esté llena de agua.Una vez que el microscopio esté configurado, localice una dendrita madura transfectada con el objetivo de 100x. Si las células transfectadas en la placa son escasas, busque una célula deseada con el objetivo de 40x. Luego cambie al objetivo de 100x.Para capturar imágenes, utilice un aumento óptico de cinco x y una resolución de 256 por 256 píxeles. Para obtener imágenes de un segmento corto de dendrita con varias espinas. Para capturar imágenes, use una velocidad nominal de nueve, lo que toma 0,5 segundos.Para finalizar un escaneo, ajuste el diafragma a dos micrómetros para obtener una fluorescencia intensa. Al tomar imágenes, intente usar una transmisión láser baja, por ejemplo, del 1 al 5 %, para evitar el fotoblanqueo de toda la imagen. A continuación, seleccione la espina de interés para este experimento.Se eligen espinas dendríticas de hongo con diámetros de cabeza de aproximadamente un micrómetro para realizar un experimento de envoltura. Tome cinco imágenes de control antes del blanqueo, luego blanquee la espina de interés 10 veces a una transmisión láser nominal del 100 % y capture una serie de imágenes inmediatamente después del blanqueo. El intervalo de tiempo debe ajustarse según las diferentes proteínas diana y los diferentes diseños experimentales.Para este experimento, se capturan imágenes cada segundo durante 15 segundos tras el blanqueo. A continuación, guarde las imágenes para analizar los datos. Abra las imágenes con el software Image J y alinee la pila de imágenes utilizando la herramienta de alineación para que la espina de interés no se desplace y permanezca en la misma posición.En la imagen, mida la intensidad de fluorescencia relativa del espinazo de interés, que es una región transfectada pero no fotoblanqueada. Mida la región de fondo en las imágenes de lapso de tiempo con la herramienta de monitorización de intensidad versus tiempo de ImageJ. Utilice una región no fluorescente como región de fondo y ajuste la intensidad fluorescente con una ecuación exponencial de una fase en el software GraphPad Prism u otro software similar. Finalmente, calcule el porcentaje de fracción móvil e inmóvil de la fluorescencia mostrada.Aquí se muestran las mediciones de FRAP de la fluorescencia de EGFP en una espina de una neurona hipocampal en cultivo. Se marcaron las regiones de la espina, el control y el fondo, y la flecha roja indica el momento del blanqueo fotónico. Se tomaron fotografías de la misma área antes y a los 0, 1, 5, 10 y 15 segundos tras el blanqueo fotónico.Se muestran curvas FRA de fluorescencia de EGFP durante un período de 15 segundos, con los puntos sobre las curvas representando el FRA en cada segundo. Las curvas fueron ajustadas mediante ecuaciones exponenciales de una fase. La fluorescencia promedio antes del fotoblanqueamiento se contó como el 100%. En este experimento, la fracción móvil es del 87% y la fracción inmóvil es del 13%A.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la movilidad de una proteína marcada con GFP utilizando la técnica FRAPPE.

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Aprende a medir la movilidad de proteínas EGFP en espinas dendríticas de neuronas de hipocampo de rata mediante FRAP. Este método cuantifica fracciones móviles e inmóviles para estudiar dinámica proteica sináptica.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas (Video) | JoVE Journal

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

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