Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

El objetivo general de este procedimiento es marcar proteínas en la superficie de las neuronas vivas y, posteriormente, distinguir las proteínas de superficie de las proteínas internalizadas mediante el marcaje diferencial de anticuerpos secundarios. Para hacer esto, las neuronas primarias cultivadas en un cubreobjetos se incuban con un anticuerpo dirigido contra un epítopo de superficie y se incuban para permitir la internalización. Después de la incubación, se aplica un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia para identificar las proteínas expuestas a la superficie.

A continuación, se aplica el exceso de anticuerpo secundario no marcado para bloquear los complejos de anticuerpos primarios de proteínas de superficie restantes. A continuación, las neuronas cultivadas se permean y se aplica un anticuerpo secundario de un color diferente para detectar la proteína internalizada. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los niveles relativos de proteína internalizada frente a proteína de superficie a través de microscopía de inmunofluorescencia.

Siguiendo este procedimiento, se puede obtener un curso temporal de la internalización de la proteína de superficie de origen que proporciona información sobre las tasas de tráfico de proteínas en condiciones de albahaca y estimuladas. Comience este procedimiento preparando los cubreobjetos para el lavado de cultivos celulares recubiertos de polilisina de 18 milímetros con cubreobjetos de vidrio bólico preparados un día antes sumergiéndolos en tres platos de enjuague separados que contengan PBS Agregue 500 microlitros de solución laminada a los pocillos de una placa de 12 pocillos y, luego, con pinzas, coloque los cubreobjetos en cada uno. Bueno, presione hacia abajo cada cubreobjetos para asegurarse de que esté plano en la base del pozo incubar durante dos horas a 37 grados centígrados, este protocolo se puede realizar utilizando cortezas de ratón E 15 o E 18 rata hipopótamo Campi.

En esta demostración, se utilizan cortezas de ratón. Colocar las cortezas de media camada o de una camada de embriones en hielo en un einor de un mililitro que contenga PBS con calcio y magnesio y colocar en hielo. A continuación, con una micropipeta de un mililitro, retire el PBS del tejido cortical.

A continuación, añada 500 microlitros de una solución de ADN Pappa al tejido cortical de medio grupo de embriones. Incubar a 37 grados centígrados durante 15 a 20 minutos. Dos veces durante el período de incubación, agite suavemente el tubo para mezclar el contenido después de la incubación, use una pipeta de pasta siliconada pulida con llama para recalificar suavemente el tejido de 10 a 15 veces hasta obtener la dispersión celular.

Quedan pocos trozos de tejido no disociado, si es que quedan algunos, para evitar la generación de burbujas. Coloque cuidadosamente la suspensión celular disociada sobre un cojín de tres mililitros de 4%BS, A en el BSS de Hank con aditivos. Luego, en una centrífuga de sobremesa con una centrífuga de rotor oscilante a 100 veces G durante siete minutos.

Después del centrifugado, retire con cuidado el sobrenadante teniendo cuidado de no aspirar la pelletización de celdas. A continuación, añada un mililitro de medio neurobasal completo, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células granuladas. A continuación, utilice un hemocitómetro para determinar la concentración de células vivas.

Solo las células brillantes de fase deben considerarse vivas inmediatamente antes de la siembra. Aspire el exceso de solución de suero laminado de los cubreobjetos en los pocillos y reemplácelo con medio de cultivo de neuronas primarias. Luego agregue de 75.000 a 100.000 neuronas primarias a cada pocillo.

Cultive las neuronas durante un máximo de 21 días en medio neurobasal a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono en el día siete, y cada semana a partir de entonces, agregue fluoro antimitótico, desoxi uridina uridina para prevenir el crecimiento excesivo de la glía y realice un cambio de medio medio. Durante la primera semana de cultivo, las neuronas desarrollaron árboles dendríticos, como se muestra en esta imagen de un cultivo de dos días de edad. Para la segunda o tercera semana, han madurado y experimentarán sinaptogénesis.

En esta figura se ilustra una extensa red de proyecciones tomadas a los 14 días in vitro para marcar las proteínas de interés expuestas a la superficie, añadir el anticuerpo primario directamente al medio condicionado a la concentración adecuada. Cada afección debe probarse por triplicado Cuatro controles, el suero preinmune o los anticuerpos que reconocen regiones intracelulares de la proteína que no están expuestas durante la exocitosis se pueden usar en la misma dilución que el anticuerpo primario de la prueba. Regrese las células a la incubadora de cultivo durante una, dos o cuatro horas después de la incubación, aspire el medio que contiene anticuerpos, lave los pocillos una vez suave pero rápidamente con PBS.

Agregue la temperatura ambiente agregando solución a los pocillos, luego aspire. A continuación, añada el 4% de formaldehído recién preparado e incube durante cinco minutos. Agregue temperatura ambiente para fijar las celdas después de la fijación.

Retire la solución de paraformaldehído de los pocillos y deséchela en un contenedor de desechos líquidos en la campana extractora. A continuación, enjuague rápidamente las células tres veces con PBS como antes. Deje el tercer lavado en su lugar para que el cubreobjetos se pueda quitar fácilmente.

A continuación, use pinzas para quitar con cuidado los cubreobjetos de la placa y colóquelos con la célula hacia arriba sobre una hoja de param en la base o tapa de una placa de cultivo desechable. El resto del protocolo de tinción se realizará en esta superficie, pipeteando suavemente la solución de bloqueo de PBS 5%BSA sobre las células para hacer una gota redondeada en forma de burbuja en el cubreobjetos para que no se seque. Incubar durante 30 minutos.

Es importante recordar que no debe agregar detergente a la solución de bloqueo. En esta etapa, las células no deben estar permeadas cuando solo se van a marcar las proteínas de la superficie celular. Después del bloqueo, aspire la solución de bloqueo, luego marque las proteínas expuestas a la superficie, aplique un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, luego incube durante dos horas a temperatura ambiente después de la incubación, aspire el anticuerpo secundario y lave los cubreobjetos dos veces con PBS durante cinco minutos cada vez para bloquear cualquier proteína en la superficie celular que no esté unida al anticuerpo secundario marcado.

Incubar las neuronas no permeables con una alta concentración de anticuerpo secundario no marcado durante la noche. A temperatura ambiente. La incubación durante la noche es crucial.

Los períodos de incubación más cortos no bloquearán completamente ningún anticuerpo primario que no esté completamente unido al anticuerpo secundario marcado. Al día siguiente, lave las fundas dos veces durante cinco minutos cada una con PBS como antes. A continuación, fije las células con un 4% de formaldehído en tampón de fosfato durante cinco minutos a temperatura ambiente después de retirar el fijador.

Enjuague rápidamente las células dos veces con PBS. A continuación, para el marcaje intracelular, permea y bloquea las células con PBS que contienen 5 % de BSA y 0,1 % de Triton X 100 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la permeación, retire la solución de bloqueo.

Teniendo cuidado de que los cubreobjetos no se sequen. Agregue un anticuerpo secundario marcado de manera diferente e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Después de retirar el segundo anticuerpo secundario, lave los cubreobjetos tres veces durante cinco minutos con PBS.

A continuación, lávelos brevemente con agua desionizada. La cubierta se desliza sobre portaobjetos de vidrio con un medio de montaje acuoso que contiene un agente antidecoloración y permite que se almacenen en seco los portaobjetos en la oscuridad a cuatro grados centígrados para una conservación óptima de la señal fluorescente. Obtención de imágenes de las células inmunoteñidas en un microscopio confocal utilizando los filtros de excitación y emisión adecuados.

Utilice los mismos parámetros de adquisición de imágenes para todas las réplicas y condiciones posteriores a la obtención de imágenes. Utilice un software de análisis de imágenes estándar, como Fiji Image J o metamorph, para determinar la densidad integrada de las regiones estándar de interés o los atributos de Punta, como el número y el tamaño, para determinar si el gen seis relacionado con las convulsiones o dice que seis estaba presente e internalizado en la superficie de la neurona. Se realizó un marcaje de doble color de neuronas de hipocampo de rata cultivadas como se describe en este video.

En esta imagen, la proteína de la superficie celular etiquetada se muestra en cian y la proteína internalizada se muestra en verde. La doble tinción indicada por la punta de flecha solo se observó en una célula que parecía no estar sana para determinar si la proteína internalizada durante la incubación de la alimentación de anticuerpos localizada en las neuronas de los endosomas que expresan el marcador de endosomas de reciclaje temprano transferrina mCherry estaba inmunoteñida después de la permeación, como se muestra en esta región del árbol dendrítico, hubo una amplia superposición de la tinción punteada con la transferrina, lo que confirma que la proteína internalizada se localizó en los endosomas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que se puede utilizar un solo anticuerpo para distinguir entre la superficie celular y los grupos de proteínas internalizadas.