Name: Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a caracterizar la rigidez del tejido pulmonar mediante microindentación con microscopía de fuerza atómica. Esta técnica de alta resolución espacial permite mapear propiedades mecánicas en muestras normales y fibroticas.

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Damos las gracias a A. Tager y Shea B. por su colaboración en curso, y para proporcionar el tejido pulmonar utilizada para propósitos de demostración aquí. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención HL-092961. Este trabajo fue realizado en parte en el Centro de Sistemas de Nanoescala (SNC), un miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura, que es apoyada por la National Science Foundation NSF premio en ECS-0335765. SNC es parte de la Facultad de Artes y Ciencias de la Universidad de Harvard.

1. Tejido pulmonar Franja de preparación <ol><li> El tejido pulmonar es muy compatible y difícil de cortar en tiras para la caracterización de AFM. Para estabilizar transitoriamente la estructura pulmonar para el corte, inflar los pulmones del ratón aislados intratraqueal con el peso corporal de 50 ml / kg de baja 2% en gel de agarosa al punto (preparado en PBS) calentado a 37 ° C. Ate la tráquea y los pulmones inflados enfriar en un baño de PBS a 4 ° C durante 60 minutos. El gel de agarosa se ​​endurecen y en los espacios aéreos para estabilizar suavemente la estructura pulmonar durante este intervalo de 5. Mayores concentraciones de agarosa, un 3-4%, es decir, se puede utilizar para mejorar aún más la estabilización de tejidos para el corte. </li><li> Cortar el tejido de ratón de agarosa-estabilizado de pulmón con una navaja o una cuchilla de bisturí en tiras de 5 x 5 mm de longitud y anchura y 400 micras de espesor, luego se lava las tiras en un baño de PBS pre-calentado a 37 ° C con 100 ml de vidrio en un vaso de precipitados de sobremesa placa de agitación se calienta durante 5 minutos para eliminar los restos de agarosa. Para excluir a las grandes vías respiratorias y los vasos, cortar tiras de las regiones subpleurales distante de los bronquios principales madre. Si las vías respiratorias y los grandes vasos se van a imágenes, cortar tiras de tejido pulmonar más proximal de los bronquios principales madre. </li></ol> 2. AFM Microindentation y imágenes de fluorescencia <ol><li> Para aislar las áreas de interés para microindentation AFM, el tejido puede ser visualizado por microscopía de contraste de fase, o immunostained y se visualizan por microscopía de fluorescencia. Por inmunoticción, bloque de tiras de tejido con 5% de suero de la fuente del anticuerpo deseado secundaria (en PBS) durante 2 horas sin fijación o permeabilización a temperatura ambiente. </li><li> Incubar la tira de tejido con anticuerpos adecuados primaria (por ejemplo, de conejo anti-colágeno I para visualizar colágeno intersticial (1:250 dilución), de conejo anti-laminina (1:250 dilución) para visualizar la membrana basal) en un pocillo de una placa de 12 pocillos en un eje de balancín con agitación suave durante 1 hora, lavar la muestra tres veces durante 5 minutos cada uno con PBS, seguido de anticuerpo apropiado secundario conjugado con etiqueta fluorescente (por ejemplo, Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo secundaria de anticuerpos (1:250 dilución)) para una hora a temperatura ambiente. </li><li> Lave las tiras de tejido fino extensivamente con PBS y se almacenan en PBS a 4 ° C </li><li> Inmediatamente antes de la caracterización de AFM, coloque la tira de tejido a un poli-l-lisina de 15 mm cubreobjetos levantando el cubreobjetos desde abajo el tejido flotante, lo que hace que la tira de tejido se extiende de manera uniforme sobre la superficie del cubreobjetos, si es necesario, la banda de sándwich con un paño limpio en segundo lugar, no recubierto cubreobjetos y aplicar una presión suave para ayudar con la adhesión del tejido a los portaobjetos con poli-L-lisina. </li><li> Calibrar el sistema AFM siguiendo las instrucciones del fabricante, inmediatamente antes de cada ronda de experimentos microindentation. Determinar dos parámetros fundamentales: 1) el resorte en voladizo constante utilizando el método de las fluctuaciones térmicas en el aire 6, y, 2) la sensibilidad de deflexión en voladizo, que es un parámetro utilizado para escalar la señal de salida de fotodiodo a la distancia de voladizo desviación real, Δd. Calibrar sensibilidad de deflexión mediante la obtención de un estándar de la curva fuerza-desplazamiento en PBS en un portaobjetos de vidrio limpio luego calcular la pendiente de la curva fuerza-desplazamiento (Fig.1b). En la medición de la curva fuerza-desplazamiento, la punta del AFM se extiende y se retrae hacia la superficie de la muestra en un solo lugar (sin barrido de direcciones en XY), con la deflexión del cantilever, Δd, controlará como una función de desplazamiento de su punta, Δz . </li></ol> Le recomendamos que utilice un nitruro de silicio en voladizo con un triángulo de 5 micras de diámetro borosilicato esférica punta (Novascan). El uso de sondas de AFM con un resorte de constante de 0,06 N / m, hemos caracterizado mecánicamente materiales blandos con módulos de corte que abarca de 100 a 50.000 Pa. <ol start="6"><li> Limpie la superficie inferior del cubreobjetos de la muestra con papel de seda, se sujetan a un portaobjetos de vidrio estándar con grasa de vacío, coloque la placa de vidrio sobre el escenario de la muestra AFM y cubrir el tejido con 500 l de PBS (temperatura ambiente). </li><li> Ajuste el microscopio para ver ocular para alinear la punta del AFM en el centro del campo de visión mediante el ajuste de la etapa de la muestra microscopio. Elija un área de interés en el papel moviendo el escenario de la muestra AFM, luego cambiar a la cámara CCD de visión para grabar la imagen de contraste de fase y / o imágenes de fluorescencia de los tejidos, según se desee. </li><li> Realizar la operación estándar de compromiso AFM moviendo la punta del AFM lentamente hacia abajo hasta que esté en contacto con la muestra. </li><li> Caracterización precisa microindentation AFM de muestras blandas requiere profundidades pequeña hendidura para evitar grandes tensiones locales que invalidan el modelo de Hertz utiliza para el cálculo elástico módulo. Para evitar grandes deformaciones, realizar el sangrado en el modo de disparo mediante el establecimiento de la flecha máxima en voladizo (puntos gatillo) a 500 nm. Este límite de deflexión frenará elfuerza de indentación máxima a menos de 30 nN (F = resorte en voladizo de desplazamiento * constante, o F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> La velocidad del sangrado debe ser seleccionado para ser lo suficientemente lenta para explorar más elástica propiedades viscoelásticas de la muestra suave 7. Un rango de velocidad de 2.20 micras por segundo es adecuado para el tejido pulmonar. <ol start="10"><li> Por una sola medición de un área de interés, mover la sonda AFM a la ubicación de interés y realizar una sola muesca para recoger un nivel de desplazamiento de fuerza curva (la sonda sólo se mueve en la dirección Z, sin barrido XY). </li><li> Para el mapeo automático de una región de interés, cambiar al modo de la Fuerza-Map, seleccione el tamaño de escaneado y los puntos de muestreo en el área seleccionada. En el modo de Fuerza-Map, la punta del AFM tramas a través de la superficie de la muestra entre los movimientos de sangría, y recoge cada fuerza-desplazamiento curvas en cada punto dentro de una cuadrícula muestra definida. Más puntos de muestreo proporcionará una mayor resolución espacial, sino prolongar el tiempo necesario para el mapeo. Nos pareció que era práctico utilizar una cuadrícula de 16 x 16 muestra un mapa de 80 x 80 m área a una velocidad de sangrado de 20 micras por segundo, lo que se puede completar en unos 10 minutos. </li></ol> 3. Extracción de datos AFM <ol><li> Para calcular el módulo de Young, el ajuste de la curva fuerza-desplazamiento para el modelo de indentación Hertz esférica utilizando mínimos cuadrados no lineal adecuado curva 8 (Fig. 1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Ecuación 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 1"> donde F = k c * Δ d, es la fuerza para doblar el voladizo, k c es el resorte en voladizo constante, R es el radio de la esfera punta, δ = Δ z - Δ d es el sangrado y υ es la relación de la muestra de Poisson (υ = 0,4 para el tejido pulmonar 9). </li><li> Para evaluar la calidad del ajuste, el cálculo del valor SSR, o la suma de los cuadrados de la diferencia entre los datos y los valores de ajuste, durante el ajuste de la curva no lineal. Eliminar las medidas poco fiables o sin interpretable por los datos de los descartes de los "malos" con los valores de las curvas de SSR de gran tamaño. </li><li> Si lo desea, convertir el módulo de elasticidad (E) de módulo de corte (G), utilizando la relación E = 2 x (1 + υ) x G. Para visualizar los patrones espaciales de la rigidez en el modo de recogida de la Fuerza-Map, la trama de datos en el contorno del módulo de mapas (por ejemplo, en 16 x 16 muestra la red que cubre un 80 x 80 m de área). </li><li> Para procesar una gran cantidad de datos de la curva fuerza, un algoritmo personalizado se puede escribir en forma automática de fuerza-desplazamiento curvas, módulos de extracción, y / o elastographs gráfico utilizando los mismos procedimientos y parámetros como se indica en 3.2 y 3.3 (por ejemplo, Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 (A) Esquema de microindentation AFM de una muestra suave sobre un sustrato rígido con una sonda esférica (Reproducido con permiso de Dimitriadis E., et al. Biophys 2002 J 8). (B) Representante de la curva fuerza-desplazamiento recogido de un portaobjetos de vidrio limpio en PBS para determinar la sensibilidad de deflexión en voladizo. (C) Representante de fuerza-desplazamiento curvas de recogida de suave (azul) y dura (rojo) muestras con los parámetros correspondientes a partir de (A). 4. Los resultados representativos: Figura 2A muestra una franja de parénquima pulmonar adjunta en poli-l-lisina cubreobjetos recubiertos de PBS con una sonda de AFM en el lugar justo encima de la región de interés y listo para el mapeo de microindentation. Figura 2B muestra que en el tejido bien cortado y teñido, la microarquitectura alveolar del parénquima pulmonar está bien conservado, como se observa mediante la tinción de inmunofluorescencia para laminina componente de la membrana basal sin fijación o permeabilización. Figura 2 CD tinción de inmunofluorescencia para mostrar colágeno I en fresco los pulmones de los ratones no fijadas cosechado previamente tratados con PBS (Fig. 2C), o tratados con bleomicina (Fig. 2D) para inducir fibrosis 10. La figura 3A muestra de la muestra de fuerza-desplazamiento obtenidas de parcelas microindentation AFM. Con la misma fuerza aplicada, AFM punta genera una gran escotadura en una región blanda (línea azul), resultando en un relativamente "plano" de desplazamiento de fuerza frente a la curva de una pequeña hendidura y un "fuerte" curva de fuerza-desplazamiento para una región más rígido ( línea roja). Con el fin de obtener las curvas de limpiar la fuerza, después de cada muesca de la punta del AFM debe ser retirado por completo de la superficie de la muestra y libre de contacto antes de la sangría que viene. Este estado libre de contacto corresponde a la región plana de la curva en la Figura 3, donde la punta se traduce sin desviarse en voladizo. Figura 3B muestra una curva típica falsa sin una región plana que se produce cuando la punta no está completamente cerrada a partir de la superficie de la muestra (por ejemplo, muestra una suavettaches a la punta) por lo que es imposible determinar el punto de contacto. Si la punta está completamente atrapado en la muestra suave, la curva puede verse como se muestra en la Figura 3C, sin desviación clara, pero el ruido pequeño. La Figura 4 muestra los datos de corte módulo extraído de las curvas de fuerza-desplazamiento se muestra espacialmente como mapas de la rigidez (elastographs), donde las escalas de color con el módulo de corte. Elastographs demuestran grandes diferencias en el alcance y la distribución de los módulos de corte de tejidos en condiciones normales (Fig. 4A) y fibrosis (Fig. 4B) parénquima pulmonar, y grandes variaciones espaciales en el módulo de corte, sobre todo dentro de la muestra fibrosis pulmonar. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) Micrografía de contraste de fase que muestra una sonda de AFM en una franja de pulmón de ratón parénquima. Barra de escala, de 50 micras. (B) La inmunotinción de laminina en el tejido pulmonar normal de ratón que muestra la microarquitectura alveolar del parénquima pulmonar normal. Cuadro blanco indica típica 80 por 80μm área de la cartografía elasticidad. Barra de escala: 20 micras. (C y D) La inmunotinción de colágeno I en solución salina (C) y bleomicina (D) trata de ratón parénquima pulmonar. Las barras de escala, 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) Representante interpretar las curvas de fuerza-desplazamiento recogidos de solución salina (azul) y bleomicina tratada (rojo) del ratón parénquima pulmonar, respectivamente. Las líneas de negro son la mejor opción que resulta del modelo de Hertz esférica y están etiquetados con sus correspondientes módulos de Young calculado. (B, C) representante de la ONU-interpretables de fuerza-desplazamiento curvas. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Elastographs Representante recogida de solución salina (A) y bleomicina tratados (B) ratón parénquima pulmonar. Las barras de colores indican módulo de corte en kilopascales. Etiquetas de los ejes indican la escala espacial en micrómetros. Barra de escala: 20 m

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No hay conflictos de interés declarado.

Caracterización mecánica del tejido pulmonar con microindentation AFM ofrece una resolución espacial sin precedentes (Fig. 4), proporcionando una perspectiva única sobre las variaciones descrito en la rigidez del tejido. Como ejemplo de su utilidad, previa escala macro mediciones en bandas de tejido normal y fibrosis pulmonar indica un aproximado de 2 a 3 veces aumento de la elastancia con fibrosis 11,12. Por el contrario, revela que microindentation AFM endurecimiento del tejido es muy localizada, con algunas regiones presentan aumentos de hasta ~ 30 veces en módulo de corte por encima de la mediana observada en el tejido pulmonar normal 10. Como matriz de rigidez ahora se sabe que influyen en la crítica función de las células, estas mediciones locales ofrecen parámetros muy valiosa para mejorar la biofidelity de estudio de cultivos celulares de células de los pulmones. Varias cuestiones de índole práctica con el uso de tiras delgadas de tejido pulmonar. Las superficies de las tiras no sea totalmente plana, como el perfil del tejido sigue la arquitectura subyacente de los alvéolos. El sistema AFM se ajusta automáticamente la posición de punta en la dirección Z durante el sangrado cuando la superficie de la muestra variación de la altura es menor que 15 micras para ayudar a superar este desafío. Las mediciones se realizan a temperatura ambiente, no 37 ° C, por lo que las desviaciones en las propiedades mecánicas causadas por esta variación en la temperatura no puede ser evaluada, aunque se espera que sea menor. La influencia de la arquitectura de la pared alveolar subyacente en observar las propiedades mecánicas es difícil de determinar con la configuración del microscopio de luz actual. Por ejemplo, sería conveniente determinar si las paredes alveolares presentan anisotropía y propiedades mecánicas diferentes al sangrado en direcciones alineadas con o transversal al plano de la pared. Sin embargo, los ejemplares actuales son gruesas y el sistema de imagen no tiene capacidades 3D, por lo que no es posible determinar la orientación local de la pared alveolar en cada punto de contacto. Por último, la influencia de los componentes celulares de medir las propiedades mecánicas aún no ha sido dilucidado. En los métodos detallados aquí, no se hacen esfuerzos para eliminar específicamente los componentes celulares de los tejidos. Sin embargo, las células presentes en la superficie disponible para el sangrado es poco probable que sea viable, dado el tiempo transcurrido desde la cosecha de tejidos y la necesidad de cortar el tejido para obtener acceso a los alvéolos. Experimentos específicos para eliminar las células, o repoblar matrices con células viables, y evaluar los cambios resultantes en la rigidez del tejido que parece estar justificada. Dado que el tejido no fijado fresco que se necesita para estas mediciones, el tiempo transcurrido desde la recolección de tejido para la medición debe ser mínimo y las muestras deben ser almacenadas a 4 ° C para evitar cambios en las propiedades mecánicas. Se debe prestar especial atención cada vez que tiras de tejido se transfieren entre los contenedores durante el lavado o la tinción de modo que un mínimo de distorsión o daño se genera. Para la aplicación de AFM en líquido, es un paso crucial para cortar el tejido lo más plano posible e inmovilizar la muestra en el portaobjetos de apoyo. Si está disponible, una máquina automática de seccionamiento como una máquina de cortar el tejido vibratome o puede ser utilizado para cortar rebanadas de espesor muy uniforme. Es importante colocar las tiras de tejido inmediatamente antes de las mediciones de AFM y minimizar el tiempo transcurrido para las mediciones de AFM en la muestra final se separará de los cubreobjetos. Una observación útil es que las grandes bandas parecen conectar de manera más estable para cubrir los resbalones y permanecer en su lugar durante un período prolongado en que las pequeñas tiras de PBS. Microindentation AFM puede caracterizar muestras que abarcan una amplia gama de 100 Pa a 50 kPa (módulo de corte) cuando se utiliza un estándar de 0,06 N / m en voladizo con un diámetro de la punta esférica 5 micras. Este rango puede ser ampliado mediante sondas con diferentes constantes de los resortes, las sondas de AFM con las puntas de vidrio esférico de 0,6 a 12 um de diámetro y constantes de la primavera que van desde 0,01 hasta 0,58 N / m están disponibles comercialmente (por ejemplo, Novascan) y de uso general 3. Con una punta de 5 micras esférico, el área de contacto entre la punta teórica y el tejido es de unos 9.5 m 2 para el sangrado 400-700 nm (Fig. 1A). Consejos más o menos grandes se pueden utilizar para proporcionar las escalas más pequeñas o más grandes de la resolución espacial. Puntas piramidales también se han utilizado en microindentation AFM 13-16, proporcionando pequeñas áreas de contacto y así aumentar la resolución espacial en la cartografía, a pesar de conexión de datos es más complejo de esta geometría de la punta. Varias limitaciones a este método se debe tener en cuenta. El pulmón ha sido tradicionalmente caracterizada mecánica no invasiva, por ejemplo el uso de presión-volumen de análisis de 17 o punch-sangría de todo el pulmón 19,20. Métodos invasivos, tales como el descrito aquí alterar la arquitectura del pulmón de manera importante a través de la pérdida de la int aire-líquidoerface que existe normalmente en los pulmones llenos de aire y la pérdida de pre-tensión que mantiene la inflación pulmonar parcial a la relajación de los músculos respiratorios. Estas limitaciones son comunes a todas las mediciones realizadas en las tiras de tejido pulmonar de 18 años. Cabe destacar, sin embargo, la rigidez media medida en el parénquima del tejido pulmonar normal (módulo de corte ~ 0.5kPa) no difieren sustancialmente de las estimaciones basadas en perforación, sangrado de los pulmones intactos en los volúmenes de descanso 19,20. Mientras que el tejido pulmonar se sabe que presentan no lineal de refuerzo con deformación creciente, no es posible probar de forma rigurosa si esta propiedad persiste hasta la escala micro, con los métodos empleados aquí. El modelo de Hertz supone homogeneidad de la muestra. Sin embargo, la mayoría de los materiales biológicos, como el parénquima pulmonar, son cada vez más heterogéneo a la disminución de escalas espaciales. La heterogeneidad de la muestra puede resultar en manchas, como la variación de módulo de Young en función de profundidad de penetración, es decir, en función de la capa o componente que está deformando. La heterogeneidad en el plano xy puede ser limitado por elegir cuidadosamente el tamaño adecuado punta esférica en función de la microestructura del material biológico propuesto por Dimitriadis EK et al. 8 Es mucho más difícil de predecir o corregir el error del modelo Hertz debido al material heterogeneidad en la dirección z. Azeloglu et al. ha propuesto recientemente un modelo híbrido computacional para caracterizar las propiedades elásticas del sustrato heterogéneo con inclusiones discretos integrados 21. Su nueva técnica proporciona un medio potencial para calcular las propiedades de la inclusión de materiales heterogéneos, la superación de las limitaciones del análisis hertzianas. El modelo de Hertz también asume un comportamiento elástico absoluta, mientras que los materiales biológicos suelen mostrar en función del tiempo las conductas viscoelástico. Una caracterización viscoelástica lleno de tejido se puede obtener mediante la variación de las velocidades de sangrado utilizado. Es importante destacar que, previa escala macro pruebas mecánicas del tejido pulmonar normal y fibrosis demuestra débil dependencia de la frecuencia de las propiedades mecánicas del tejido pulmonar, y la preservación de las diferencias entre las propiedades de los tejidos normales y fibrótico mecánicas en todas las frecuencias a prueba 11. Estos hallazgos sugieren que la medición de las propiedades mecánicas con una velocidad de sangrado individual con AFM capta un aspecto esencial de los cambios en las propiedades mecánicas del tejido que acompañan a la fibrosis. La relación de Poisson de 0,4 para el tejido pulmonar utilizado en este trabajo es a partir de una medición macroscópica 9. Por desgracia, la relación de Poisson a micro-escala y los cambios en estado de enfermedad no están disponibles en la literatura. Como alternativas a la E, E / (1-υ 2) o (1-υ 2) / πE (k denota la constante elástica) 22 se puede calcular a partir de microindentation AFM e informó de que la relación de Poisson es desconocida. Para la mayoría de los biomateriales de Poisson está en el rango de 0,4 a 0,5, debido a su alto contenido de agua. Dentro del rango de 0.3-0.5, el factor 1 / (1-υ 2) sólo varía desde 1,10 hasta 1,33, de manera que las variaciones razonables en la relación de Poisson ejercen sólo un efecto modesto en el módulo informó. El incremento en el módulo de corte que nos informe por tejido fibrótico en relación con el tejido normal es varias veces en magnitud, lo que implica que los errores asociados con las variaciones en el coeficiente de Poisson son menores en relación con los cambios en las propiedades mecánicas observadas. El algoritmo actual y el código que puede ser utilizado para el análisis de los datos de fuerza-desplazamiento está sujeto a la condición de aplicación específica y las características posteriores de las diversas poblaciones de las curvas de fuerza-desplazamiento. Si un análisis más sofisticado de interés, se puede consultar el trabajo de Lin et al. 23. Los autores recopilaron una serie de estrategias sinérgicas en un algoritmo que supera muchas de las complicaciones que previamente han obstaculizado los esfuerzos para automatizar la instalación de los modelos de Hertz de los datos de sangrado. Otras áreas están disponibles para un mayor desarrollo y explotación de este método. En los casos en que uno está interesado en la visualización de las paredes alveolares, sin etiquetado de anticuerpos, tanto la elastina y el colágeno se puede visualizar desde su señal autofluorescentes en el espectro de color verde. Por otro lado, una mejor imagen, ya sea utilizando delgadas secciones de tejidos, técnicas de imágenes en 3D, o ambos, podrían mejorar la capacidad de relacionar la arquitectura del tejido subyacente con las propiedades mecánicas. Mientras que los métodos actuales permiten a las manchas y la visualización de los componentes de la matriz extracelular, como colágeno y laminina, los esfuerzos adicionales podrían ser destinados a la tinción de marcadores de superficie celular para identificar poblaciones específicas de células y caracterizar los microambientes mecánica en las cercanías de dichas poblaciones. Alternatively, el tejido podría obtenerse de ratones que expresan fluorescencia etiquetados linaje de marcadores de células o proteínas específicas para perseguir el mismo objetivo. Finalmente, el método detallado aquí parece adecuada para caracterizar otras características anatómicas en los pulmones, como los vasos que remodelar en la hipertensión, y las vías respiratorias que remodelar en el asma. Sobre la base de su actual estado de desarrollo y el potencial de seguir mejorando, microindentation AFM parece dispuesta a ceder información valiosa sobre los cambios en la rigidez de los tejidos que acompañan a la progresión de la enfermedad en el pulmón, y sin duda será de valor en la caracterización de los cambios espaciales y temporales en el la rigidez de una variedad de otros tejidos blandos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> AFM punta </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 micras de borosilicato de cuentas, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina cubreobjetos </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm redondo de vidrio No.1 </td></tr><tr><td> Agarosa, temperatura de gelificación de baja </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-colágeno I (Rb PAB) de anticuerpos </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo de anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-laminina </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mecánica caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matriz de rigidez influye fuertemente en el crecimiento, diferenciación y función de las células adherentes 1-3. En la escala macro de la rigidez de los tejidos y órganos dentro del cuerpo humano abarcan varios órdenes de magnitud 4. Se sabe mucho menos acerca de cómo la rigidez varía espacialmente dentro de los tejidos, y lo que el alcance y la escala espacial de los cambios de rigidez en los procesos de enfermedades que resultan en la remodelación tisular. Para entender mejor cómo los cambios en la matriz de rigidez contribuir a la fisiología celular en la salud y la enfermedad, las mediciones de la rigidez del tejido obtenido en una escala espacial relevante para las células residentes son necesarios. Esto es particularmente cierto para el pulmón, un tejido altamente compatible y elástico en el que la remodelación de la matriz es una característica importante en enfermedades como el asma, el enfisema, la hipertensión y la fibrosis. Para caracterizar el medio ambiente local mecánica del parénquima pulmonar en una escala espacial relevante para las células residentes, que han desarrollado métodos para medir directamente las propiedades locales elástica de tejido fresco de pulmón murino mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) microindentation. Con la elección apropiada de AFM penetrador, en voladizo, y profundidad de penetración, estos métodos permiten realizar mediciones de locales módulo de tejido de corte en paralelo con contraste de fase y de imágenes de fluorescencia de la región de interés. El muestreo sistemático de las tiras de tejido proporciona mapas de las propiedades mecánicas del tejido que revelan las variaciones locales de espacio en el módulo de corte. Las correlaciones entre las propiedades mecánicas y características subyacentes anatomopatológicas ilustrar cómo la rigidez varía con la deposición de la matriz en la fibrosis. Estos métodos pueden extenderse a otros tejidos blandos y los procesos de la enfermedad para revelar cómo las propiedades mecánicas del tejido local varían a través del espacio y la progresión de la enfermedad.

La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.

Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

La rigidez de la matriz influye considerablemente en el crecimiento, la diferenciación y la función de las células adherentes1-3. A escala macroscópica, la rigidez de los tejidos y órganos...

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar el entorno mecánico local del parénquima pulmonar a una escala espacial relevante para las células residentes, mediante la medición directa de las propiedades elásticas locales de tejido pulmonar fresco mediante microindentación con microscopía de fuerza atómica. Esto se logra cortando el tejido pulmonar de ratón inflado con agarro con una cuchilla de afeitar o bisturí, para preparar tiras de parénquima pulmonar de cinco por cinco milímetros de largo y ancho, y 400 micrómetros de grosor. A continuación, las tiras de tejido pulmonar no fijadas y no permeabilizadas se tiñen mediante inmunotinción, lo que identifica áreas de interés para la microindentación con MF.Luego se realiza una microindentación con FM en tiras de tejido en PBS a temperatura ambiente. Con el fin de medir directamente las propiedades elásticas locales del tejido pulmonar fresco, se obtienen resultados que muestran diferencias notables en el rango y la distribución de la rigidez del tejido en el parénquima pulmonar normal y fibrotico, así como grandes variaciones espaciales en la rigidez, particularmente dentro de la muestra de pulmón fibrotico.Basado en mapas de rigidez extraídos de curvas de desplazamiento forzado obtenidas mediante microindentación con microscopio de fuerza. La principal ventaja de esta técnica frente a medidas existentes, como el estiramiento de tiras de tejido, es que ofrece una resolución espacial sin precedentes, proporcionando una perspectiva única sobre la variación a escala microscópica en la rigidez del tejido. Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave, como cómo varía espacialmente la rigidez dentro del tejido y cuál es el alcance y la escala espacial de los cambios de rigidez en la enfermedad.Los procesos que resultan en la remodelación del tejido Para preparar tiras de tejido pulmonar, comience por estabilizar la estructura del pulmón para el corte, inflando pulmones de ratón aislados. Intratraquealmente con 50 mililitros por kilogramo de peso corporal de agar al 2% de bajo punto de gel, preparado en PBS. Amarre la tráquea y enfríe los pulmones inflados en un baño de PBS a cuatro grados Celsius durante 60 minutos. El agar se gelificará y endurecerá en los espacios aéreos, estabilizando suavemente la estructura pulmonar. Durante este intervalo, utilizando una navaja o bisturí, corte el tejido pulmonar de ratón estabilizado con agar en tiras de aproximadamente cinco por cinco milímetros de largo y ancho, y 400 micrómetros de espesor.Luego, lave las tiras en PBS a 37 grados Celsius durante cinco minutos para eliminar restos de aros y excluir vías aéreas grandes y vasos. Corte tiras de regiones subpleurales alejadas de los bronquios principales si se van a imaginar vías aéreas y vasos grandes; corte tiras del tejido pulmonar más próximo a los bronquios principales para aislar áreas de interés para una microindentación por FM. Visualice el tejido mediante microscopía de contraste de fases o inmunotinción y visualice mediante microscopía de fluorescencia.Consulte la parte escrita de este protocolo para conocer el procedimiento. Inmediatamente antes de una caracterización por microscopía de fluorescencia (FM), sujete las tiras de tejido a laminillas de 15 milímetros recubiertas con poli-L-lisina elevando la laminilla desde debajo del tejido flotante, asegurándose de que la tira de tejido se extienda uniformemente sobre la superficie de la laminilla. Si es necesario, coloque la tira entre dos laminillas limpias sin recubrir y aplique una presión suave para ayudar a la fijación del tejido a la laminilla recubierta con poli-L-lisina.Calibre el sistema de FM-A siguiendo las instrucciones del fabricante inmediatamente antes de cada serie de experimentos de microindentación. Para ello, determine dos parámetros críticos: la constante del resorte del cantiléver mediante el método de fluctuación térmica en aire y la sensibilidad de deflexión del cantiléver, que es un parámetro utilizado para escalar la señal de salida del fotodiodo a la distancia real de deflexión del cantiléver.Calibre la sensibilidad de deflexión obteniendo una curva estándar de desplazamiento forzado en PBS sobre un portaobjetos limpio. Luego, calcule la pendiente de la curva de desplazamiento forzado en la medición de la curva de desplazamiento forzado. La punta de MF se extiende hacia y se retrae de la superficie de la muestra en una ubicación única, monitorizando la deflexión del micromuelle delta D como función del desplazamiento de la punta delta Z. Se recomienda utilizar un micromuelle triangular de nitruro de silicio con una punta esférica de borosilicato de cinco micrómetros de diámetro, empleando sondas de MF con una constante elástica de 0,06 newtons por metro.Hemos caracterizado mecánicamente materiales blandos con módulo de cizalladura que abarca de 100 a 50.000 pascales. Limpie la superficie inferior del portaobjetos de la muestra con papel de tejido, luego fíjelo a un portaobjetos de vidrio estándar con grasa al vacío. Monte el portaobjetos de vidrio en la platina de muestra de AFM y cubra el papel de tejido con 500 microlitros de PBS a temperatura ambiente.Luego coloque una cabeza de exploración de FM sobre la muestra. Ajuste el portaobjetos del microscopio para configurar el microscopio para la observación mediante el ocular y alinear la punta de FM en el centro del campo de visión. Mueva el portaobjetos de FM para seleccionar un área de interés en el tejido.Luego cambie a la visualización con cámara CCD para grabar la imagen de contraste de fases y/o imágenes de fluorescencia del tejido según se desee. Mueva lentamente la punta de microscopía de fuerza atómica (AFM) hacia abajo hasta que esté en contacto preciso con la muestra. La caracterización por microindentación con AFM de muestras blandas requiere pequeñas profundidades de indentación para evitar grandes deformaciones locales, lo que invalidaría el modelo de Hertz utilizado para el cálculo del módulo elástico. Para evitar grandes deformaciones, realice la indentación en modo de disparo (trigger) ajustando la desviación máxima del cantiléver a 500 nanómetros.Este límite de desviación restringirá la fuerza máxima de indentación a menos de 30 nanonewtons. La velocidad de indentación debe seleccionarse lo suficientemente lenta como para explorar las propiedades elásticas en lugar de las propiedades viscoelásticas de la muestra blanda. Seleccione un rango de velocidad de dos a 20 micrómetros por segundo para el tejido pulmonar para una única medición desde un área de interés.Mueva la sonda A FM a la ubicación de interés y realice una sola indentación para recopilar una curva estándar de fuerza-desplazamiento. La sonda se moverá únicamente en la dirección Z. Para la cartografía automatizada de una región de interés, cambie al modo de mapa de fuerza, seleccione el tamaño de escaneo y los puntos de muestreo dentro del área seleccionada.La punta de AFM se desplaza sobre la superficie de la muestra entre los movimientos de indentación y recopila curvas individuales de fuerza-desplazamiento en cada punto dentro de una cuadrícula de muestra definida. Resultó práctico utilizar una cuadrícula de muestra de 16 por 16 para mapear un área de 80 micrómetros por 80 micrómetros a una velocidad de indentación de 20 micrómetros por segundo, lo cual puede completarse en aproximadamente 10 minutos. Para calcular el módulo de Young, ajuste la curva de fuerza-desplazamiento al modelo de indentación esférica de Hertz mediante un ajuste no lineal de curvas de mínimos cuadrados, como se muestra aquí, donde F equivale a K sub C multiplicado por delta D, siendo la fuerza necesaria para flexionar el cantiléver.K sub C es la constante elástica del resorte del cantiléver. R es el radio de la punta esférica, delta igual a delta Z menos delta D es la indentación, y nu es la relación de Poisson de la muestra, que equivale a 0,4 para el tejido pulmonar. Para evaluar la calidad del ajuste, calcule el valor SSR, o suma de cuadrados de las diferencias entre los datos y los valores ajustados durante el ajuste no lineal de la curva.Elimine mediciones poco fiables o ininteligibles descartando datos de curvas defectuosas con valores grandes de SSR. Si se desea, convierta el módulo elástico o E en módulo de cizalladura G, utilizando la relación E igual a dos veces la suma de uno más ν multiplicado por G. Para visualizar los patrones espaciales de rigidez recopilados en modo de mapa de fuerza, represente gráficamente los datos del módulo y mapas de contorno, por ejemplo, en una cuadrícula de 16 por 16 que cubra un área de 80 micrómetros por 80 micrómetros.Para procesar una gran cantidad de datos de curvas de fuerza, se puede escribir un algoritmo personalizado para ajustar automáticamente las curvas de fuerza-desplazamiento, extraer módulos y/o trazar mapas de contorno o injertos ELA. Utilizando los mismos procedimientos y parámetros descritos anteriormente, esta figura muestra que el tejido fue correctamente cortado y teñido. La microarquitectura alveolar del parénquima pulmonar se conserva adecuadamente, como se observa mediante tinción de inmunofluorescencia del componente de la membrana basal, laminina, sin fijación ni permeabilización.Estos paneles muestran la tinción de inmunofluorescencia para colágeno, una en pulmones frescos no fijados obtenidos de ratones previamente tratados con PBS o con bleomicina para inducir fibrosis. Aquí se muestran gráficos de fuerza-desplazamiento obtenidos mediante microindentación FM con la misma fuerza aplicada. La punta de FM genera una gran indentación en una región blanda, lo que resulta en una curva de fuerza-desplazamiento relativamente plana mostrada en azul, frente a una pequeña indentación y una curva de fuerza-desplazamiento empinada para una región más rígida mostrada en rojo.Para obtener curvas de fuerza limpias tras cada indentación, es necesario retirar completamente la punta de microscopía de fuerza atómica (AFM) de la superficie de la muestra y asegurar que no haya contacto antes de la siguiente indentación. Este estado libre de contacto corresponde a la región plana de la curva, donde la punta se desplaza sin desviación del cantiléver. Esta figura muestra una curva típica errónea sin región plana, que ocurre cuando la punta no se retira completamente de la superficie de la muestra, como cuando una muestra blanda se adhiere a la punta, haciendo imposible determinar el punto de contacto si la punta queda completamente atrapada en la muestra blanda.La curva puede tener este aspecto sin una desviación clara, pero con un pequeño ruido. Esta figura muestra la rigidez. Los datos extraídos de las curvas de desplazamiento forzado se muestran espacialmente como mapas de rigidez denominados injerto ELAs, donde la escala de colores varía según la rigidez. El injerto ELAs demuestra diferencias notables en el rango y la distribución de la rigidez del tejido en el parénquima pulmonar normal y fibrotico, así como grandes variaciones espaciales en la rigidez, particularmente dentro de la muestra pulmonar fibrotica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar el entorno mecánico local del parénquima pulmonar mediante la medición directa de las propiedades elásticas locales de tejido pulmonar fresco utilizando microscopía de fuerza atómica.

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Investigación

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Biology

Biología

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