Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar el entorno mecánico local del parénquima pulmonar a una escala espacial relevante para las células residentes mediante la medición directa de las propiedades elásticas locales del tejido pulmonar espejado fresco utilizando microscopía de fuerza atómica y microindentación. Esto se logra cortando el tejido pulmonar de ratón inflado con una navaja de afeitar o una hoja de bisturí para preparar tiras de parénquima pulmonar de cinco por cinco milímetros de largo y ancho, y 400 micrómetros de grosor. A continuación, las tiras de tejido pulmonar no fijado en permanente son la tinción inmunológica, que identifica áreas de interés para una microindentación de FM.

A continuación, se realiza una microindentación FM en tiras de tejido en PBS a temperatura ambiente. Con el fin de medir directamente las propiedades elásticas locales del tejido pulmonar fresco, se obtienen los resultados. Esto muestra diferencias notables en el rango y la distribución de la rigidez del tejido en el parénquima pulmonar normal y fibrótico y grandes variaciones espaciales en la rigidez, particularmente dentro de la muestra de pulmón fibrótico.

Basado en mapas de rigidez extraídos de curvas de desplazamiento forzado obtenidas mediante una microindentación FM. La principal ventaja de esta técnica sobre las medidas existentes, como el estiramiento de tiras de tejido, es que ofrece una resolución espacial sin precedentes, proporcionando una perspectiva única sobre la variación a microescala en la rigidez del tejido. Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave, como cómo varía la rigidez espacialmente dentro del tejido y cuál es el alcance y la escala espacial de los cambios de rigidez en la enfermedad.

Procesos que dan lugar a la remodelación del tejido: Para preparar tiras de tejido pulmonar, se comienza por estabilizar la estructura pulmonar para el corte mediante el inflado de pulmones de ratón aislados. Por vía intratraqueal con 50 mililitros por kilogramo de peso corporal caliente, al 2% de punto de gel, preparado en PBS, amarre la tráquea y enfríe los pulmones inflados en un baño de PBS a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Los aros se gelificarán y endurecerán en los espacios de aire para estabilizar suavemente la estructura pulmonar Durante este intervalo, con una navaja de afeitar o un bisturí, corte el tejido pulmonar del ratón estabilizado en tiras de aproximadamente cinco por cinco milímetros de largo y ancho, y 400 micrómetros de grosor.

A continuación, lavar las tiras en PBS a 37 grados centígrados durante cinco minutos para eliminar los aros residuales y excluir las vías respiratorias y los vasos sanguíneos grandes. Cortar tiras de las regiones subpleurales distantes de los bronquios del tronco principal si se van a obtener imágenes de las vías respiratorias en los vasos grandes, cortar tiras del tejido pulmonar más proximal a los bronquios del tronco principal para aislar las áreas de interés para una microindentación de FM. Visualice el tejido mediante microscopía de contraste facial o inmunotinción y visualice mediante microscopía de fluorescencia.

Consulte la parte escrita de este protocolo para conocer el procedimiento. Inmediatamente antes de una caracterización de FM, fije las tiras de tejido a los cubreobjetos de 15 milímetros recubiertos de poli L lisina levantando el cubreobjetos desde debajo del tejido flotante, asegurándose de que la tira de tejido se extienda uniformemente sobre la superficie del cubreobjetos. Si es necesario, coloque la tira con un segundo cubreobjetos limpio y sin recubrimiento y aplique una presión leve para ayudar a la fijación del tejido al cubreobjetos recubierto de poli L lisina.

Calibre el sistema A FM siguiendo las instrucciones del fabricante inmediatamente antes de cada ronda de experimentos de microindentación. Para ello, determine dos parámetros críticos. La constante de resorte en voladizo utilizando el método de fluctuación térmica en el aire y la sensibilidad a la deflexión en voladizo, que es un parámetro utilizado para escalar la señal de salida del fotodiodo a la distancia de deflexión en voladizo real.

Calibre la sensibilidad a la deflexión obteniendo una curva de desplazamiento forzado estándar en PBS en un portaobjetos de vidrio limpio. A continuación, calcule la pendiente de la curva de desplazamiento forzado en la medición de la curva de desplazamiento forzado. La punta A FM se extiende y se retrae de la superficie de la muestra en una sola ubicación con la deflexión del voladizo delta D monitoreada en función del desplazamiento de la punta delta Z.It se recomienda usar un voladizo triangular de nitruro de silicio con una punta esférica de silicato bo de cinco micrómetros de diámetro utilizando sondas FM con una constante de resorte de 0.06 newton's por metro.

Hemos caracterizado mecánicamente materiales blandos con una luz modulada de 100 a 50.000 pascales. Limpie la superficie inferior del portaobjetos de la muestra con papel de seda y, a continuación, fíjelo a un portaobjetos de vidrio estándar con grasa para aspiradoras. Monte el portaobjetos de vidrio en la platina de muestra A FM y cubra el tejido con 500 microlitros de PBS a temperatura ambiente.

A continuación, coloque el cabezal de escaneo FM sobre la muestra. Ajuste la platina de muestra del microscopio para configurar el microscopio para la visualización del ocular a fin de alinear la punta A FM en el centro del campo de visión. Mueva la platina de muestra A FM para elegir un área de interés en el tejido.

A continuación, cambie a la visualización de la cámara CCD para grabar imágenes de contraste de fase y/o imágenes de fluorescencia del tejido, según lo desee. Mueva la punta A FM lentamente hacia abajo hasta que esté en contacto con la muestra precisa. Una caracterización de micro indentación FM de muestras blandas requiere pequeñas profundidades de indentación para evitar grandes deformaciones locales, lo que invalida el modelo de hercios utilizado para el cálculo del módulo elástico para evitar grandes depresiones, realizar la indentación en modo de disparo estableciendo la deflexión máxima en voladizo a 500 nanómetros.

Este límite de deflexión restringirá la fuerza de indentación máxima a menos de 30 nano newtons. La velocidad de indentación debe seleccionarse para que sea lo suficientemente lenta como para explorar las propiedades elásticas en lugar de viscoelásticas de la muestra blanda. Seleccione un rango de velocidad de dos a 20 micrómetros por segundo para el tejido pulmonar para una sola medición desde un área de interés.

Mueva la sonda A FM a la ubicación de interés y realice una sola indentación para recopilar una curva de desplazamiento de fuerza estándar. La sonda se moverá solo en la dirección Z. Para el mapeo automatizado de una región de interés, cambie al modo de mapa forzado, seleccione el tamaño de escaneo y los puntos de muestreo dentro del área seleccionada.

El A FM puntea los RA a través de la superficie de la muestra entre los movimientos de indentación y recoge curvas de desplazamiento forzado individuales en cada punto dentro de una cuadrícula de muestra definida inde. Nos pareció práctico usar una cuadrícula de muestra de 16 por 16 para mapear un área de 80 micrómetros por 80 micrómetros a una velocidad de indentación de 20 micrómetros por segundo, que se puede completar en unos 10 minutos. Para calcular el módulo de Young, ajuste la curva de desplazamiento de fuerza al modelo de indentación esférica de hercios utilizando el ajuste de curva no lineal de Lee Square, como se muestra aquí, donde F es igual a K sub C por delta D es la fuerza para doblar el voladizo.

K sub C es la constante del resorte en voladizo. R es el radio de la punta de la esfera, delta es igual a delta Z menos delta D es la indentación, y new es la relación de poisson de las muestras, que es igual a 0,4 para el tejido pulmonar. Para evaluar la calidad del ajuste, calcule el valor SSR o la suma de cuadrados de la diferencia entre los datos y los valores de ajuste durante el ajuste de curva no lineal.

Elimine las mediciones poco fiables o ininterpretables descartando los datos de curvas incorrectas con grandes valores de SSR. Si lo desea, convierta el módulo elástico o E en módulo puro. G.Usando la relación E igual a dos veces la suma de uno más nuevos tiempos G.To visualizar patrones espaciales de rigidez recopilados en el modo de mapa de fuerzas, trazar datos de módulo y mapas de contorno, por ejemplo, en una cuadrícula de 16 por 16 que cubre un área de 80 micrómetros por 80 micrómetros.

Para procesar una gran cantidad de datos de curvas de fuerza, se puede escribir un algoritmo personalizado para ajustar automáticamente las curvas de desplazamiento de fuerza, extraer mapas de contorno modulares o de trazado o injerto ELA. Utilizando los mismos procedimientos y parámetros que acabo de describir, esta figura muestra que puedo cortar y teñir correctamente el tejido. El micro alveolar del parénquima pulmonar está bien conservado, como se observa mediante tinción inmunofluorescente para el componente de la membrana basal, laminina, sin fijación ni permeación.

Estos paneles muestran una tinción inmunofluorescente para colágeno, una en pulmones frescos no fijados recolectados de ratones previamente tratados con PBS o tratados con blio micina para inducir fibrosis. Aquí se muestran gráficos de muestra de desplazamiento de fuerza obtenidos a partir de una micro indentación FM con la misma fuerza aplicada. La punta A FM genera una gran hendidura en una región blanda, lo que da como resultado una curva de desplazamiento de fuerza relativamente plana que se muestra en azul frente a una pequeña indentación y una curva de desplazamiento de fuerza pronunciada para una región más rígida que se muestra en rojo.

Para obtener curvas de fuerza limpias después de cada indentación, la punta A FM debe retraerse completamente de la superficie de la muestra y sin contacto antes de la siguiente indentación. Este estado libre de contacto corresponde a la región plana de la curva donde la punta se traduce sin deflexión en voladizo. Esta figura muestra una curva falsa típica sin una región plana, que ocurre cuando la punta no está completamente retraída de la superficie de la muestra, como cuando la muestra blanda se adhiere a la punta, lo que hace imposible determinar el punto de contacto si la punta está completamente atrapada en la muestra blanda.

La curva puede verse así sin una deflexión clara, pero con poco ruido. Esta figura muestra la rigidez. Los datos extraídos de las curvas de desplazamiento forzado se muestran espacialmente como mapas de rigidez denominados injertos de ELAs, donde las escalas de color con el injerto de ELAs de rigidez demuestran diferencias sorprendentes en el rango y la distribución de la rigidez del tejido en el parénquima pulmonar normal y fibrótico y grandes variaciones espaciales en la rigidez, particularmente dentro de la muestra de pulmón fibrótico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar el entorno mecánico local del parénquima pulmonar midiendo directamente las propiedades elásticas locales del tejido pulmonar fresco utilizando una copia microscópica de fuerza atómica.