Ensayo de la neurosfera NPC: un ensayo in vitro para evaluar la respuesta migratoria de las células precursoras neurales de la neurosfera

Las neuroesferas son agregados esféricos no adherentes de células precursoras neuronales o NPC.

Cuando se siembran en condiciones específicas de cultivo adherente, las NPC pueden migrar espontáneamente fuera de la neurosfera.

Para evaluar la respuesta migratoria de las NPC, primero, prepare una suspensión de NPC de la densidad deseada en un medio adecuado.

A continuación, siembre la suspensión celular en una placa de cultivo que contenga medios e incube.

Los factores de crecimiento específicos en el medio apoyan la proliferación de células. Además, la ausencia de un sustrato de recubrimiento mantiene las células suspendidas en los medios, lo que les facilita formar agregados celulares 3D llamados neuroesferas.

Al alcanzar el tamaño deseado, recolecte las neuroesferas.

Centrifugar y volver a suspender el gránulo de neuroesfera en el medio diluido.

Luego, coloque la suspensión de la neuroesfera en una placa recubierta de matriz extracelular que contenga medios diluidos e incube.

Durante el cultivo, las neuroesferas se adhieren a la matriz extracelular.

Con el tiempo, debido a los componentes de la matriz extracelular, algunas NPC comienzan a migrar lejos del núcleo de la neuroesfera.

Ahora, retire los medios y fije las celdas.

Capture imágenes de contraste de fase de las neuroesferas que exhiben migración celular.

Con un software adecuado, mida el área de la neurosfera total y la masa celular interna.

Finalmente, reste el área de masa celular interna del área total de la neuroesfera para calcular la migración promedio de NPC desde la neurosfera.

Para formar la neurosfera, pipetee 1 mililitro de medios de expansión al 100 % en un plato de 35 milímetros sin ningún sustrato de recubrimiento. Luego, agregue un millón de células precursoras neurales en cada una de estas placas e incube la placa a 37 grados Celsius durante 48 a 96 horas.

Para preparar la placa para la migración de la neuroesfera, disuelva las alícuotas de gel que imitan la ECM en 6 mililitros de medio de expansión al 30%. Agregue 1 mililitro de gel imitador de ECM con medio de expansión al 30% en un solo pocillo de una placa de 6 pocillos. Luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Para colocar las neuroesferas, use una pipeta para recolectar las células en el medio del plato de 35 milímetros y transferirlas a un tubo cónico. Luego, gire el tubo a 100 x g para granular las neuroesferas. Luego, vuelva a suspender el gránulo en 1 a 3 mililitros de medio de expansión al 30% precalentado.

A continuación, pipetee 200 microlitros de las neuroesferas resuspendidas en la placa de 6 pocillos que contiene el gel imitador de ECM con un medio de expansión del 30% y balancee la placa. Luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante 48 horas. Aspire el gel imitador de ECM con medio de expansión al 30% y luego fije las células durante 30 minutos con paraformaldehído al 4%.

Para analizar las neuroesferas, capture imágenes utilizando la configuración de contraste de fase con un aumento de 10X. Utilice el software NIH ImageJ para medir la migración promedio de las neuroesferas. En ImageJ, use la herramienta de línea a mano alzada para trazar el contorno exterior de la neurosfera.

Luego, use la función de medición para calcular el área de traza y rastrear la masa celular interna de la esfera. Reste la masa celular interna del área total de la neurosfera para cuantificar la migración promedio.