Una guía para la generación y uso de hiPSC NPCs derivados para el Estudio de las Enfermedades Neurológicas

El objetivo general de este procedimiento es generar células neuroprogenitoras o NPC a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas o PSC altas como plataforma para estudiar los mecanismos celulares y moleculares que contribuyen a las enfermedades neurológicas. Esto se logra diferenciando primero las PSC altas utilizando inhibidores de smad duales en rosetas neuronales. El segundo paso es cosechar estas rosetas neuronales y permitir que crezcan hasta convertirse en poblaciones de N PC expandibles.

Siguiente transducción lentiviral con una infección de espín. El paso para mejorar la eficiencia se utiliza para manipular la expresión génica. El paso final es hacer crecer los NPC en suspensión para que formen neuroesferas espontáneamente.

En última instancia, esta plataforma se puede utilizar para ensayar una variedad de fenotipos celulares. Por ejemplo, medir el efecto de la manipulación genética en la neuromigración. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre los mecanismos celulares, como la migración.

También se puede aplicar para estudiar otros procesos biológicos como la replicación, el estrés oxidativo, la apoptosis y el crecimiento de neuritas. La diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano o PSCs altas conduce a la formación de rosetas neurales visibles, que se caracterizan como grupos redondos de células neuroepiteliales con polaridad basal aico para la selección enzimática de rosetas neurales en el día 14. Aspirar los medios de los cuerpos embrionarios adheridos o ebs y añadir un mililitro de reactivo de selección de roset neural por pocillo de una placa de seis pocillos para incubar a 37 grados centígrados durante una hora.

Después de una hora. Utilice una pipeta P 1000 para eliminar suavemente la enzima de cada pocillo y añada un mililitro de D-M-E-M-F 12 por pocillo. Para lavar las rosetas, recoja un mililitro de D-M-E-M-F 12 y expúselo rápidamente de nuevo al pozo, separando así las rosetas de la placa.

Recoja las rosetas en un tubo de halcón Pipetee otro mililitro de D-M-E-M-F 12 y expúlselo rápidamente en el mismo pozo para separar las rosetas restantes. No intente y trate de no romper los agregados de roseta. Recoge las rosetas neurales en el mismo tubo de halcón.

Se puede agregar más cantidad de la enzima y repetir este procedimiento si las rosetas no se desprenden fácilmente cuando se han recogido todas las rosetas neurales. Girar el tubo Falcon a 300 g durante tres minutos. Aspirar el lavado y resus.

Suspenda las rosetas en dos mililitros de medio de célula progenitora neural. Transfiera las células a una placa de seis paredes recubierta de laminado de poli L ornitina y crezca a 37 grados centígrados durante una semana. En este laboratorio, las células progenitoras neurales o NPC se cultivan en placas de matrigel, se alimentan cada dos días y se mantienen a una densidad muy alta.

Para dividir los NPC, primero aspire el medio y luego agregue un mililitro de accutane tibio por pocillo de una placa de seis pocillos incubada a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Transfiera suavemente las células separadas a un tubo de 15 mililitros que contenga D-M-E-M-F 12 con el menor esfuerzo mecánico posible. No tritrate las células mientras está en la enzima granule las células girando a 1000 G durante cinco minutos después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las NPC.

En aproximadamente un mililitro de medio NPC por pocillo original de una placa de seis pocillos, se esperan de cinco a 10 millones de células por pocillo confluente de una placa de seis pocillos después de la resuspensión y el recuento de células. Repl la placa de los NPCs aproximadamente de una a 2 millones de células por pocillo de una placa de seis pocillos para mantener los NPCs. La eficiencia de la formación de neuroesferas varía entre el experimento y las líneas celulares, pero generalmente ocurre mejor si entre 200, 000 y un millón de células están asentadas por pocillo de una placa no adherente de seis paredes.

Las NPCs NPCs deben ser transducidas con vectores lentivirales o retrovirales para aumentar el porcentaje de células transfectadas. Usa la infección por espín. Aspirar los medios de cada pocillo y sustituir con la sobreexpresión o control correspondiente lentivirus o retrovirus titulados a la multiplicidad deseada de infección diluida.

En medios NPC: Utilice 1,5 mililitros por pocillo de un centrifugado de placa de seis pocillos a 1000 G y temperatura ambiente durante una hora en una centrífuga de placa. Después del centrifugado, vuelva a colocar la placa en la incubadora para reducir la muerte celular. Reemplace el medio dentro de las ocho horas posteriores a la infección por centrifugado.

Comience este procedimiento lavando las NEUROESFERAS derivadas de NPC una vez en los medios de NPC para eliminar los desechos celulares. Incline la placa en un ángulo de 45 grados y permita que las neuroesferas se asienten y luego elimine la mayor cantidad de medios posible sin aspirar las neuroesferas. Reemplace con medios nuevos.

A continuación, elija manualmente las NEUROESFERAS derivadas de NPC bajo un microscopio utilizando una pipeta P 200 y transfiera una esfera de neuros a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta de matrigel. Es importante elegir neuroesferas de tamaños similares para reducir la variabilidad en los resultados. Agregue 0,5 miligramos adicionales de gel de matri diluido en medios NPC fríos a las neuroesferas en cada placa de 96 pocillos.

Con una punta de pipeta, centre manualmente cada esfera neurológica individual en el centro del pocillo Permita que se produzca la migración de la esfera neurológica durante 48 horas. Después de fijar y teñir las células con los marcadores inmunohistoquímicos deseados, fotografíe las neuroesferas en su totalidad utilizando un objetivo de microscopio Forex. Para medir la migración radial, utilice el software image J.

Utilice la herramienta de selección a mano alzada para trazar manualmente el borde de las celdas migratorias más lejanas. Asegúrese de que el área esté marcada en la ventana de conjunto de medidas que se encuentra en la pestaña Analizar. Y luego use la función de medición para calcular el área de la forma resultante.

Use el valor de la medición del área y la ecuación para el área de un círculo para determinar el radio exterior de la misma manera, trace el borde de la esfera neuros original. Mide el área y calcula el radio interior. Calcule la migración radial total como la diferencia entre los radios exterior e interior.

Estas imágenes muestran las etapas de la diferenciación neuronal de PSC alta de PSC altas a cuerpos embrionarios, rosetas neurales, NPC y neuronas validadas que expresan las NPC, el anidamiento del marcador NPC y el factor de transcripción de células madre neurales SOX dos en la mayoría de las células. La tinción de beta tres tubulina también es visible en todas las poblaciones de NPC. Las NPC también expresan el factor de transcripción de células madre neurales PAC seis y el marcador progenitor de cuatro cerebros.

TBR dos, pero no los marcadores del mesencéfalo como LMX uno A y FOX A dos NPC pueden diferenciar entre un 70 y un 80%beta tres neuronas tubulinas positivas que se muestran en verde y un 20 a 30% de astrocitos gliales positivos para proteínas ácidas fibrilares que se muestran en rojo, PSC alta y de alta calidad. Los NPC expresan neston y SOX dos en la mayoría de las celdas, mientras que los NPC de baja calidad tienen parches de SOX dos negativos y anidan solo en celdas negativas. Las neuronas de cuatro semanas de edad diferenciadas de los NPC de alta calidad expresan el mapa dos AB y beta tres turbulento.

Después de una transducción exitosa con un vector lentiviral o retroviral de alto título. Más del 80% de las células están marcadas por el indicador fluorescente. Incluida en la generación vectorial de neurosferas se obtiene una población de neuroesferas de tamaño relativamente homogéneo, que pueden permanecer sanas en cultivo durante aproximadamente una semana.

Con la alimentación regular, la migración de la esfera de las neurosferas ocurre de manera robusta en las neuroesferas sanas, como se ilustra en estas imágenes de campo claro antes y después de 48 horas de migración en matrigel después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la esquizofrenia exploraran la neuromigración en NPC derivadas de células madre PL ponentes inducidas por humanos. No olvide que trabajar con un retrovirus puede ser potencialmente peligroso y todo el trabajo de cultivo de tejidos debe realizarse en condiciones BL dos plus cuando el virus está potencialmente presente.