Una guía para la generación y uso de hiPSC NPCs derivados para el Estudio de las Enfermedades Neurológicas

El objetivo general de este procedimiento es generar células progenitoras neurales o NPCs a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas o PSCs de alto grado, como una plataforma para estudiar los mecanismos celulares y moleculares que contribuyen a las enfermedades neurológicas. Esto se logra primero diferenciando las PSCs de alto grado mediante inhibidores duales de SMAD hacia rosetas neurales. El segundo paso consiste en recolectar estas rosetas neurales y permitir que crezcan hasta formar poblaciones expandibles de NPCs.

A continuación, transducción lentiviral con una infección por centrifugación. Este paso, utilizado para mejorar la eficiencia, sirve para manipular la expresión génica. El paso final consiste en cultivar las NPC en suspensión para que formen espontáneamente neuroesferas.

En última instancia, esta plataforma puede utilizarse para analizar una variedad de fenotipos celulares. Por ejemplo, medir el efecto de la manipulación genética sobre la migración neuronal. Aunque este método puede proporcionar información sobre mecanismos celulares como la migración.

También puede aplicarse para estudiar otros procesos biológicos como la replicación, el estrés oxidativo, la apoptosis y el crecimiento de neuritas. La diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas o PSCs altas conduce a la formación de rosetas neurales visibles, que se caracterizan como agrupaciones redondeadas de células neuroepiteliales con polaridad apicobasal para la selección enzimática de rosetas neurales en el día 14. Aspire el medio de los cuerpos embrionarios adheridos o EBS y agregue un mililitro de reactivo de selección de rosetas neurales por pocillo de una placa de seis pocillos; incube a 37 grados Celsius durante una hora.

Después de una hora, utilice un pipetaman P1000 para retirar suavemente la enzima de cada pocillo y agregue un mililitro de D-M-E-M-F12 por pocillo. Para lavar las rosetas, recoja el mililitro de D-M-E-M-F12 y expúlselo rápidamente de vuelta al pocillo, desprendiendo así las rosetas de la placa.

Recolecte las rosetas en un tubo falcon. Pipete otro mililitro de D-M-E-M-F 12 y expúlselo rápidamente en el mismo pocillo para desprender las rosetas restantes. No trate y evite romper los agregados de rosetas. Recolecte las rosetas neurales en el mismo tubo falcon.

Puede añadirse más enzima y repetirse este procedimiento si las rosetas no se desprenden fácilmente cuando se han recolectado todas las rosetas neurales. Centrifugar el tubo Falcon a 300 G durante tres minutos. Aspirar la solución de lavado y resuspender.

Suspenda las rosetas en dos mililitros de medio para células progenitoras neuronales. Transfiera las células a una placa de seis pocillos recubierta con laminina de poli-L-ornitina y cultívelas a 37 grados Celsius durante una semana. En este laboratorio, las células progenitoras neuronales o NPCs se cultivan en placas con matrigel, se alimentan cada dos días y se mantienen a una densidad muy elevada.

Para separar las NPCs, primero aspire el medio y luego agregue un mililitro de accutane tibio por pocillo de una placa de seis pocillos e incube a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Transfiera suavemente las células desprendidas a un tubo de 15 mililitros que contenga D-M-E-M-F 12 con el mínimo estrés mecánico posible. No triture las células mientras estén en el enzima. Pellete las células centrifugando a 1000 G durante cinco minutos; tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda las NPCs.

Se esperan entre cinco y diez millones de células por pocillo confluyente de una placa de seis pocillos, en aproximadamente un mililitro de medio NPC por pocillo original de una placa de seis pocillos, tras la resuspensión y el recuento celular. Pase la placa de NPCS con aproximadamente uno a dos millones de células por pocillo de una placa de seis pocillos para mantener las NPCS. La eficiencia de formación de neuroesferas varía entre experimentos y líneas celulares, pero generalmente ocurre mejor si entre 200.000 y un millón de células se siembran por pocillo de una placa no adherente de seis pocillos; si ocurre agregación, reduzca el número de células sembradas. Idealmente, dentro de uno o dos días posteriores al repicado.

Las NPC de NP deben transducirse con vectores lentivirales o retrovirales para aumentar el porcentaje de células transfectadas. Utilice infección por centrifugación. Aspire el medio de cada pocillo y sustitúyalo por los lentivirus o retrovirus de sobreexpresión o control pertinentes, titulados a la multiplicidad de infección deseada y diluidos.

En el medio NPC, utilice 1,5 mililitros por pocillo de una placa de seis pocillos, centrifugue a 1000 ×g y temperatura ambiente durante una hora en una centrífuga para placas. Después de la centrifugación, coloque la placa nuevamente en el incubador para reducir la muerte celular. Reemplace el medio dentro de las ocho horas posteriores a la infección por centrifugación.

Comience este procedimiento lavando una vez los NEUROESFERAS derivadas de NPC en medio para NPC para eliminar los restos celulares. Incline la placa a un ángulo de 45 grados y permita que las neuroesferas sedimenten; luego, retire tanto medio como sea posible sin aspirar las neuroesferas. Reemplace con medio fresco.

A continuación, seleccione manualmente las ESFERAS NEUROPROGENITORAS derivadas bajo un microscopio utilizando una pipeta P200 y transfiera una esfera neuroprogenitora a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con matrigel. Es importante seleccionar esferas neuroprogenitoras de tamaños similares para reducir la variabilidad en los resultados. Añada adicionalmente 0,5 miligramos de matrigel diluido en medio frío para células progenitoras neurales a las esferas neuroprogenitoras en cada placa de 96 pocillos.

Utilice la punta de una pipeta para centrar manualmente cada neuroesfera individual en el centro del pocillo. Permita que ocurra la migración de las neuroesferas durante 48 horas. Después de fijar y teñir las células con los marcadores inmunohistoquímicos deseados, fotografíe las neuroesferas en su totalidad utilizando un objetivo microscópico de Forex. Para medir la migración radial, utilice el software Image J.

Utilice la herramienta de selección manual para trazar manualmente el borde de las células que han migrado más lejos. Asegúrese de que el área esté seleccionada en la ventana de configuración de mediciones, ubicada bajo la pestaña analizar. Luego, utilice la función de medición para calcular el área de la forma resultante.

Utilice el valor de la medición del área y la ecuación para el área de un círculo para determinar el radio externo de la misma manera, trazando el borde de la neuroesfera original. Mida el área y calcule el radio interno. Calcule la migración radial total como la diferencia entre los radios externo e interno.

Estas imágenes muestran las etapas de la diferenciación neural de PSCs altas, desde PSCs altas hasta cuerpos embrionarios, rosetas neurales, NPC y neuronas. Los NPC validados expresan el marcador de NPC nestina y el factor de transcripción de células madre neurales SOX2 en la mayoría de las células. La tinción de beta-tubulina tres también es visible en todas las poblaciones de NPC. Los NPC también expresan el factor de transcripción de células madre neurales PAC6 y el marcador de progenitores de cerebro cuatro.

TBR2, pero no marcadores de mesencéfalo como LMX1A y FOXA2, NPCs pueden diferenciarse en neuronas positivas para beta-tubulina 3, del 70 al 80 %, mostradas en verde, y astrocitos positivos para proteína ácida fibrilar glial, del 20 al 30 %, mostrados en rojo, NPCs de alta calidad. Los NPCs expresan nestina y SOX2 en la mayoría de las células, mientras que los NPCs de baja calidad presentan áreas de células negativas para SOX2 y negativas para nestina. Las neuronas de cuatro semanas diferenciadas a partir de NPCs de alta calidad expresan MAP2AB y beta-tubulina 3.

Tras una transducción exitosa con un vector lentiviral o retroviral de alto título. Más del 80 % de las células están marcadas por el reportero fluorescente. La inclusión en el vector de la generación de neuroesferas produce una población de neuroesferas de tamaño relativamente homogéneo, que pueden mantenerse sanas en cultivo durante aproximadamente una semana.

Con alimentación regular, la migración de neuroesferas ocurre de manera robusta en neuroesferas sanas, como lo ilustran estas imágenes de campo brillante antes y después de 48 horas de migración en Matrigel tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la esquizofrenia exploraran la migración neuronal en células progenitoras neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas. No olvide que trabajar con un retrovirus puede ser potencialmente peligroso y que todo trabajo de cultivo de tejidos debe realizarse en condiciones de nivel de bioseguridad dos o superior cuando haya presencia potencial de virus.