Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

El objetivo general de este protocolo es caracterizar los procesos tempranos de desarrollo cerebral de las células precursoras neurales humanas de una manera rápida y reproducible, y definir los efectos de importantes factores extracelulares en la regulación de estos procesos. Este método puede ayudar a abordar preguntas importantes en los campos de la neuropsiquiatría y los trastornos del neurodesarrollo, como ¿todos los individuos afectados tienen la misma anomalía celular o, alternativamente, cada uno muestra la disfunción específica de una persona? La principal ventaja de nuestro protocolo es que es rápido, altamente reproducible y fácil de implementar.

Aunque este método puede utilizarse para proporcionar información sobre los trastornos del neurodesarrollo, también puede utilizarse para estudiar trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos, como el Alzheimer y la depresión. La demostración visual de algunos de estos métodos es necesaria, ya que algunas técnicas implican mover células de un plato a otro o requieren análisis morfológicos que se comunican mejor a través de la demostración visual. Para levantar las células precursoras neurales humanas, aspire el medio y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato 1X.

Aspire la solución salina tamponada con fosfato y agregue 500 microlitros de solución de desprendimiento de células 1X a un pocillo con las células precursoras neurales. Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta P1000 para añadir 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato mantenida a temperatura ambiente para lavar y eliminar las células.

Luego, transfiera las células en solución salina tamponada con fosfato a un tubo cónico de 15 mililitros. Lavar de nuevo el pocillo con un mililitro de solución salina tamponada con fosfato y transferir el lavado al tubo. A continuación, gire las células a 300 g durante cinco minutos para formar el pellet.

Luego, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en uno a cinco mililitros de medio DMEM F12 precalentado. Placa de 100.000 celdas en pocillos triplicados en una placa de 24 pocillos. Después de 46 horas, agregue timidina tritiada al medio de cultivo e incube a 37 grados centígrados durante dos horas.

Luego, después de eliminar el medio, agregue 300 microlitros de EDTA precalentado al 0,25% de tripsina e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados para separar las células y liberar el ADN. Luego, encienda la cosechadora de células y encienda la bomba. Coloque un papel de filtro en el recolector de celdas.

Siga recogiendo los tubos de la cosechadora de células en una bandeja vacía en blanco. A continuación, presione el prelavado para humedecer el papel de filtro. Coloque los tubos colectores en los pocillos de muestra y comience.

Utilice una fuente de luz caliente para secar el papel de filtro y coloque los viales correspondientes en la bandeja. Perfore los trozos de papel en los viales y luego agregue dos mililitros de cóctel de centelleo líquido a cada vial. Incubar los viales durante una hora en el contador de centelleo antes de poner en funcionamiento la máquina para obtener los recuentos por minuto de cada muestra que refleja la síntesis activa de ADN.

Siembra 500.000 células en una placa de cultivo de 35 milímetros. Luego, agite el plato en todas las direcciones para distribuir uniformemente las células. A continuación, incuba las células a 37 grados centígrados durante 46 horas.

A continuación, se añaden dos microlitros por mililitro de EdU de cinco milimolares al cultivo y se incuba durante dos horas. A continuación, disocie y pegue las células. Al pellet de celdas, agregue tres mililitros de medio de expansión al 30% con o sin factores de crecimiento o medicamentos.

Coloque un mililitro de la suspensión celular en las placas prerrevestidas e incube la placa a 37 grados centígrados durante dos horas. Para estudiar el número de células precursoras neurales en cultivo, después de dos días, etiquete y prepare tubos de microcentrífuga. A continuación, aspire el medio del pocillo y añada 200 microlitros de solución de desprendimiento de células 1X e incube la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Después del desprendimiento de la célula, agregue 300 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1X a cada pocillo. Utilice una pipeta P1000 para pipetear la solución de células varias veces y separar las células de la placa. Luego, transfiera la solución celular al tubo preparado de 1,5 mililitros e invierta el tubo dos o tres veces.

Con una pipeta, extraiga 50 microlitros de células hasta la mitad del tubo y agréguelos a la solución de azul de tripano en un tubo de 0,5 mililitros. Luego, cuente las células con un hemocitómetro. Para formar la neurosfera, pipetee un mililitro de medio de expansión al 100% en un plato de 35 milímetros sin ningún sustrato de recubrimiento.

Luego, agregue un millón de células precursoras neuronales en cada una de estas placas e incube la placa a 37 grados Celsius durante 48 a 96 horas. Para preparar la placa para la migración de la neurosfera, disuelva las alícuotas de gel de imitación de ECM en seis mililitros de medio de expansión al 30%. Agregue un mililitro de gel ECM-mimic con un medio de expansión del 30% en un solo pocillo de una placa de seis pocillos.

Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Para colocar las neurosferas, use una pipeta para recolectar las células en el medio de la placa de 35 milímetros y transfierirlas a un tubo cónico. A continuación, gire el tubo a 100 g para pellet las neurosferas.

Luego, vuelva a suspender el pellet en uno a tres mililitros de medio de expansión precalentado al 30%. A continuación, pipetee 200 microlitros de las neuroesferas resuspendidas en la placa de seis pocillos que contiene el gel imitador de ECM con un medio de expansión del 30% y agite la placa. Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante 48 horas.

Aspire el gel ECM-mimic con un medio de expansión al 30% y luego fije las células durante 30 minutos con paraformaldehído al 4%. Para analizar las neurosferas, capture imágenes utilizando ajustes de contraste de fase con un aumento de 10X. Utilice el software NIH ImageJ para medir la migración promedio de las neuroesferas.

En ImageJ, utilice la herramienta de línea a mano alzada para trazar el contorno exterior de la neurosfera. Luego, use la función de medición para calcular el área de rastreo y trace la masa de la celda interna de la esfera. Reste la masa celular interna del área total de la neurosfera para cuantificar la migración promedio.

La tinción inmunocitoquímica se realizó para estudiar la expresión de proteínas del citoesqueleto y factores de transcripción como SOX2, PAX6 y nestina en células precursoras neurales en el paso tres. A continuación, se capturaron imágenes de contraste de fase para identificar las células portadoras de neuritas. En la imagen, las células con procesos iguales o más largos que dos cuerpos celulares se consideran portadoras de neurita, mientras que las células con procesos más cortos que dos cuerpos celulares no se consideran portadoras de neurita.

Para confirmar la formación de neurosferas, se capturaron imágenes de contraste de fase que muestran que las neuroesferas recolectadas en el punto de tiempo de 72 horas tienen un tamaño de entre 80 micrómetros y 120 micrómetros y, por lo tanto, se pueden usar para el ensayo de migración. Para definir la capacidad proliferativa, se cultivaron células precursoras neurales en condiciones de control o factor de crecimiento de fibroblastos y se tiñeron para detectar la presencia de EdU. Las imágenes fluorescentes de contraste de fase muestran que las células tratadas con el factor de crecimiento de fibroblastos tienen una mayor proporción de células involucradas en la fase S, como lo demuestra la tinción con EdU.

A continuación, para comprobar el crecimiento de neuritas, se analizaron las células en condiciones de control y se compararon con PACAP. Se capturaron imágenes de contraste de fase y muestran un aumento en el número de células con neuritas bajo tratamiento con PACAP. Luego, para comprender la migración de la neurosfera, las células se trataron con neuropéptidos PACAP.

Las imágenes de contraste de fase obtenidas muestran un aumento de la migración de la neurosfera en comparación con el control. Nuestro protocolo contiene muchas técnicas y ensayos, cada uno de los cuales requiere diferentes cantidades de tiempo. Una vez dominado, el ensayo promedio puede tardar de dos a tres horas en configurarse y de 30 minutos a tres horas en analizarse.

Al realizar estos procedimientos, es fundamental asegurarse de que está utilizando células precursoras neurales de alta calidad y que estas células estén completamente disociadas y distribuidas uniformemente en todas las condiciones, con la excepción del ensayo de la neurosfera. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros análisis como Western blot, QRT-PCR, transcriptómica, proteómica y metabolómica para caracterizar los mecanismos subyacentes. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.