Electroforesis capilar de afinidad por cambio de movilidad: un método para analizar las interacciones muestra-ligando en función de la migración diferencial de los complejos proteína-ligando

Los ligandos, como los iones metálicos, se unen de forma no covalente a una proteína específica, formando un complejo de iones proteína-metal. Esta unión altera la carga global de la proteína, lo que permite la caracterización de estos complejos mediante electroforesis capilar de afinidad.

Para comenzar, tome un capilar de vidrio delgado y preacondicionado con grupos de silanol cargados en la superficie interna. Enjuague el capilar con solución de EDTA. El EDTA es un agente quelante que elimina las impurezas de iones metálicos. Ahora, inyecte hidrodinámicamente la solución de muestra que contiene la proteína deseada en el capilar desde su extremo positivo o ánodo.

Aplique un alto voltaje para crear un flujo electroosmótico, obligando a las proteínas en su conformación nativa con cargas inherentes a moverse dentro del capilar hacia el cátodo. Registre el patrón de migración de proteínas no unidas desde el capilar.

A continuación, introduzca una solución de ligando específica en el capilar junto con las muestras de proteínas y aplique el mismo voltaje. Dentro del capilar, las moléculas del ligando se unen de forma no covalente a la proteína diana, formando complejos.

Esto induce un cambio conformacional en las proteínas, lo que lleva a una alteración en sus cargas inherentes y afecta la relación carga-tamaño. Estos cambios modulan sus interacciones con la superficie cargada del capilar, lo que hace que fluyan de manera diferente en comparación con la proteína no unida.

Registre estos cambios en la movilidad electroforética, que se correlacionan con la fuerza de la interacción proteína-ligando.

Después de preparar el método para las mediciones sin ligandos, prepare el método para las mediciones con ligandos, utilizando primero una solución de EDTA 0,1 molar para enjuagar el capilar a 2,5 bar durante 1 minuto. Luego, use agua desionizada para enjuagar el capilar. A continuación, equilibre el capilar utilizando una solución de ligando para enjuagarlo a 2,5 bar durante 1,5 minutos.

A continuación, inyecte la solución de acetanilida a 0,05 bar durante 6 segundos y cambie los viales de entrada y salida por los viales de tampón que contienen ligando. Aplicar 0,05 bar durante 2,4 segundos, para empujar la solución de acetanilida más adentro de la punta del capilar. Aplique 10,0 kilovoltios durante 6 minutos y detecte el pico de acetanilida a una longitud de onda de 200 nanómetros.

Después de enjuagar el capilar con EDTA, agua desionizada y la solución de ligando como antes, inyecte la muestra de proteína y cambie los viales de entrada y salida por viales de tampón nuevos que contengan ligando. En última instancia, repita la toma de medidas con y sin ligandos.