Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

El objetivo general de este ensayo es detectar las interacciones proteína-ADN utilizando sondas no radiactivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología molecular y la bioquímica, como la determinación de la secuencia diana del ADN de las proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que es una alternativa fácil, segura y que ahorra tiempo al uso de sondas radiactivas.

Para comenzar este procedimiento, prepare un gel de poliacrilamida nativa al cinco por ciento que contenga 0,5 veces tris borato EDTA o TBE, y 2,5% de glicerol utilizando un mini sistema de gel de proteínas. Para preparar 30 mililitros de solución de gel para cuatro geles, mezcle agua destilada, TBE, persulfato de amonio, TEMED, acrilamida bis y glicerol. Pase la solución de gel inmediatamente.

Después de la polimerización, envuelva los geles en una envoltura de plástico transparente prehumedecida con 0,5x TBE y guárdelos a cuatro grados centígrados. A continuación, diseñe un oligonucleótido largo para aproximadamente 51 mers. Diseño de oligonucleótidos cortos complementarios para aproximadamente 14 mers con modificación de colorante fluorescente infrarrojo en los cinco terminales principales.

Una vez preparados los oligonucleótidos, volver a suspenderlos en 1x tampón Tris-EDTA hasta una concentración final de 100 micromolares. Para el recocido, mezcle 0,6 microlitros de oligonucleótido corto de cinco tintes primarios, 1,2 microlitros de oligonucleótido largo y 28,2 microlitros de tampón Tris-EDTA de cloruro de sodio en un tubo de 1,5 mililitros. Coloque el tubo en agua hirviendo durante cinco minutos, luego apague la fuente de calor y deje que el agua con los oligonucleótidos recocidos se enfríe durante la noche en la oscuridad.

Para hacer sondas de ADN bicatenario, mezcle 30 microlitros de oligonucleótidos recocidos con DNTP, tampón Klenow, etiqueta de tinte Klenow de cinco primos y agua destilada doble en un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Incubar la mezcla durante 60 minutos a 37 grados centígrados en una máquina de PCR. A continuación, se añaden 3,4 microlitros de EDTA 0,5 molar para detener la reacción, y se inactiva el calor a 75 grados centígrados durante 20 minutos en la máquina de PCR.

A continuación, diluya las sondas rellenas con tampón Tris-EDTA de cloruro de sodio hasta una concentración final de 0,1 micromolar. Almacene los oligonucleótidos a menos 20 grados centígrados en la oscuridad hasta que estén listos para usar. Para preparar sondas sin marcar, mezcle 20 microlitros de oligonucleótido largo, 20 microlitros de oligonucleótido Long R y 60 microlitros de tampón Tris-EDTA de cloruro de sodio en un tubo de 1,5 mililitros.

Coloque el tubo en agua hirviendo durante cinco minutos, luego apague la fuente de calor y deje que el agua con los oligonucleótidos recocidos se enfríe durante la noche. Prepare un mililitro de tampón aglutinante 5x mezclando Tris HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, EDTA, DTT, BSA y agua bidestilada. Antes de configurar las reacciones de unión, ejecute previamente el gel de poliacrilamida al 5 % nativo en 0,5 veces TBE y 2,5 % de glicerol para eliminar todos los rastros de persulfato de amonio a 80 voltios durante 30 minutos a una hora, o hasta que la corriente ya no varíe con el tiempo.

A continuación, mezcle cuatro microlitros de tampón de unión 5x, de 80 a 200 nanogramos de proteína A purificada, un microlitro de sonda conjugada con colorante de 0,1 micromolares y agua destilada doble. Incuba la mezcla a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. Después de la incubación, cargue toda la reacción de unión en el gel y haga funcionar el gel a 10 voltios por centímetro a la distancia deseada.

Cubra el aparato de gel con aluminio para mantener el gel en la oscuridad tanto como sea posible. Limpie la base del escáner de un sistema de imágenes infrarrojas con agua destilada. Seque las placas de vidrio que contienen el gel y colóquelas en la base del escáner.

Abra el software de imágenes infrarrojas y haga clic en la pestaña Adquirir. Para placas más gruesas, utilice la configuración de 700 para el canal, automático para la intensidad, 84 micrómetros para la resolución, media para la calidad y 3,5 milímetros para el desplazamiento del enfoque. Seleccione el área que ocupa el gel en el escáner.

Finalmente, haga clic en Iniciar para comenzar el escaneo. El progreso de la electroforesis se puede visualizar con el colorante de carga Orange G, mientras que el azul de bromofenol se detecta durante el escaneo y, por lo tanto, interfiere con el análisis de la imagen. La adición de dI-dC a la reacción de unión abolió la unión de 6xHis-SOX-2 purificado con las cinco sondas de ADN de colorante principal.

El mutante LIM-4 y la sonda fría SOX-2 mutada en el sitio de unión de LIM-4 es tan eficiente como la sonda fría de tipo salvaje para competir con la sonda marcada con tinte fluorescente infrarrojo para unirse a 6xHis-SOX-2. Sin embargo, la eficiencia de competencia de la sonda fría mutante LIM-4 y SOX-2 mutada en el sitio de unión de SOX-2 es mucho menor que la de la sonda fría de tipo salvaje para unirse a 6xHis-SOX-2. Los ensayos de superdesplazamiento del complejo de ADN SOX-2 utilizando epítopos 6xHis y bandera dieron como resultado una banda de ADN SOX-2 superdesplazada.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos a cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las sondas infrarrojas en la oscuridad. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la edición del genoma CRISPR cas9 para responder a preguntas adicionales como la importancia de una secuencia de unión de ADN en particular.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioquímica exploraran las interacciones proteína-ADN en varios organismos modelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar las interacciones proteína-ADN utilizando etiquetas de ADN no radiactivo. No olvide que trabajar con acrilamida puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el equipo de protección personal al realizar este procedimiento.