Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

El objetivo general de este ensayo es detectar interacciones proteína-ADN utilizando sondas no radiactivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología molecular y la bioquímica, como determinar la secuencia diana de ADN de las proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que constituye una alternativa sencilla, segura y ahorradora de tiempo frente al uso de sondas radiactivas.

Para comenzar este procedimiento, prepare un gel nativo de poliacrilamida al cinco por ciento que contenga TBE (tris borato EDTA) 0,5x y glicerol al 2,5%, utilizando un sistema de geles proteicos mini. Para preparar 30 mililitros de solución de gel para cuatro geles, mezcle agua destilada, TBE, persulfato de amonio, TEMED, acrilamida bis y glicerol. Pase inmediatamente la solución de gel.

Después de la polimerización, envuelva los geles con una envoltura de plástico transparente previamente humedecida con TBE 0,5x y almacénelos a cuatro grados Celsius. A continuación, diseñe un oligonucleótido largo de aproximadamente 51 pares de bases. Diseñe oligonucleótidos cortos complementarios de aproximadamente 14 pares de bases con modificación de colorante fluorescente infrarrojo en el extremo cinco prime.

Una vez que los oligonucleótidos hayan sido preparados, resuspenda los mismos en tampón Tris-EDTA 1x hasta una concentración final de 100 micromolar. Para el apareamiento, mezcle 0,6 microlitros del oligonucleótido corto marcado con el colorante en el extremo 5', 1,2 microlitros del oligonucleótido largo y 28,2 microlitros de tampón Tris-EDTA con cloruro de sodio en un tubo de 1,5 mililitros. Coloque el tubo en agua hirviendo durante cinco minutos, luego apague la fuente de calor y deje enfriar el agua con los oligonucleótidos apareados durante la noche en la oscuridad.

Para obtener sondas de ADN bicatenario, mezcle 30 microlitros de los oligonucleótidos apareados con dNTPs, tampón Klenow, marcador de colorante en el extremo cinco de Klenow y agua doblemente destilada en un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Incube la mezcla durante 60 minutos a 37 grados Celsius en una máquina de PCR. Luego, añada 3,4 microlitros de EDTA 0,5 molar para detener la reacción e inactível por calor a 75 grados Celsius durante 20 minutos en la máquina de PCR.

A continuación, diluya las sondas marcadas con tampón de cloruro de sodio Tris-EDTA hasta una concentración final de 0,1 micromolar. Almacene los oligonucleótidos a menos 20 grados Celsius en la oscuridad hasta que estén listos para su uso. Para preparar sondas no marcadas, mezcle 20 microlitros de oligonucleótido largo, 20 microlitros de oligonucleótido Long R y 60 microlitros de tampón de cloruro de sodio Tris-EDTA en un tubo de 1,5 mililitros.

Coloque el tubo en agua hirviendo durante cinco minutos, luego apague la fuente de calor y deje que el agua con los oligos recocidos se enfríe durante la noche. Prepare un mililitro de tampón de unión 5x mezclando Tris HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, EDTA, DTT, BSA y agua doblemente destilada. Antes de preparar las reacciones de unión, realice una electroforesis previa en un gel nativo de poliacrilamida al 5% en TBE 0,5x y glicerol al 2,5% para eliminar todos los rastros de persulfato de amonio a 80 voltios durante 30 minutos a una hora, o hasta que la corriente ya no varíe con el tiempo.

A continuación, mezcle cuatro microlitros de tampón de unión 5x, de 80 a 200 nanogramos de la proteína A purificada, un microlitro de la sonda marcada con colorante 0,1 micromolar y agua doblemente destilada. Incube la mezcla a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15 minutos. Tras la incubación, cargue toda la reacción de unión en el gel y corra el gel a 10 voltios por centímetro hasta la distancia deseada.

Cubra el aparato de electroforesis con aluminio para mantener el gel en la oscuridad tanto como sea posible. Limpie el lecho del escáner de un sistema de imagen infrarrojo con agua destilada. Seque con cuidado las placas de vidrio que contienen el gel y colóquelas sobre el lecho del escáner.

Abra el software de imagen infrarroja y haga clic en la pestaña Adquirir. Para placas más gruesas, utilice los ajustes de 700 para el canal, automático para la intensidad, 84 micrómetros para la resolución, medio para la calidad y 3,5 milímetros para el desplazamiento del enfoque. Seleccione el área que ocupa el gel en el escáner.

Finalmente, haga clic en Iniciar para comenzar el escaneo. El progreso de la electroforesis se puede visualizar con el colorante de carga Orange G, mientras que el azul de bromofenol se detecta durante el escaneo y, por lo tanto, interfiere con el análisis de la imagen. La adición de dI-dC a la reacción de unión eliminó la unión del 6xHis-SOX-2 purificado con las sondas de ADN marcadas con colorante en el extremo cinco prime.

El mutante LIM-4 y la sonda fría SOX-2 con el sitio de unión a LIM-4 mutado son tan eficientes como la sonda fría de tipo salvaje al competir con la sonda marcada con tinte fluorescente infrarrojo por la unión a 6xHis-SOX-2. Sin embargo, la eficiencia de competencia de la sonda fría mutante LIM-4 y SOX-2 con el sitio de unión a SOX-2 mutado es mucho menor que la de la sonda fría de tipo salvaje para unirse a 6xHis-SOX-2. Los ensayos de supershift del complejo de ADN SOX-2 utilizando epítopos 6xHis y flag produjeron una banda de ADN SOX-2 supershift.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos a cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las sondas de infrarrojo en la oscuridad. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la edición del genoma con CRISPR cas9 para responder preguntas adicionales, como la importancia de una secuencia específica de unión al ADN.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioquímica exploraran las interacciones proteína-ADN en diversos organismos modelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar las interacciones proteína-ADN utilizando etiquetas de ADN no radiactivas. No olvide que trabajar con acrilamida puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.