Name: La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprende a detectar variantes genéticas no codificantes mediante EMSA y DAPA para estudiar su funcionalidad en enfermedades. Este protocolo permite analizar el binding de factores de transcripción y comprender mecanismos reguladores.

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Agradecemos a Erin Zoller, Jessica Bene y Lindsey Hays por su aporte y dirección en el desarrollo del protocolo. MTW fue financiado en parte por el HG008186 R21 de los NIH y una subvención del Premio del Fideicomisario de la Fundación de Investigación del Hospital Infantil de Cincinnati. ZHP fue apoyado en parte por T32 GM063483-13.

1. Preparación de soluciones y reactivos <ol><li> Ordenar sondas de oligonucleótidos de ADN personalizados para su uso en la EMSA y la DAPA. <ol><li> Para reducir la proteína de unión no específica, diseñar oligos cortos (entre 35-45 pares de bases (pb) de longitud) 30, y colocar la variante de interés directamente en el centro, flanqueado por su secuencia genómica endógena 17 pb. Para oligos EMSA, añadir un &#39;fluoróforo 5. Para oligos DAPA, añadir una etiqueta 5 &#39;con biotina. </li><li> Ordenar tanto la cadena sentido y su cadena de complemento inverso. Alternativamente, dúplex fin (pre-recocido) oligos. Al asignar nombres a los oligos, basar la nomenclatura en un genoma de referencia establecido. Nota: &quot;riesgo&quot; y la designación de &quot;no riesgo&quot; puede ser la enfermedad y específica del proyecto, mientras que &quot;referencia&quot; y &quot;no es de referencia&quot; son más universalmente relevante. </li><li> A la llegada de los oligos, girar brevemente hacia abajo el contenido y volver a suspender en agua libre de nucleasa a una concentración final de 100 μ;METRO. Tienda volvió a suspender acciones a -20 ° C. Proteger los oligonucleótidos marcados con un fluoróforo de la luz envolviendo con papel de aluminio. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Secuencia </td></tr><tr><td> rs76562819_REF_FOR </td><td> Un GTAATGCCTTAATGAGAGAG GTTAGTCATCTTCTCACTTC </td></tr><tr><td> rs76562819_REF_REV </td><td> GAAGTGAGAAGATGACTAAC T CTCTCTCATTAAGGCATTAC </td></tr><tr><td> rs76562819_NONREF_FOR </td><td> GTAATGCCTTAATGAGAGAG G GTTAGTCATCTTCTCACTTC </td></tr><tr><td> rs76562819_NONREF_REV </td><td> GAAGTGAGAAGATGACTAAC C CTCTCTCATTAAGGCATTAC </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Ejemplo de diseño de oligonucleótidos EMSA / DAPA para poner a prueba un SNP para Bin diferencialding. &quot;REF&quot; significa el alelo de referencia, mientras que &quot;NONREF&quot; significa el alelo no es de referencia. &quot;A&quot; representa el capítulo adelante, mientras que &quot;REV&quot; indica su complemento. El SNP se ve en rojo. <ol start="2"><li> Preparar tampón de extracción citoplasmática (CE) con una concentración final de HEPES 10 mM (pH 7,9), KCl 10 mM, y EDTA 0,1 mM en agua desionizada. </li><li> Preparar extracción nuclear (NE) tampón con una concentración final de HEPES 20 mM (pH 7,9), 0,4 M NaCl, y EDTA 1 mM en agua desionizada. </li><li> Preparar tampón de reasociación con una concentración final de Tris 10 mM (pH 7,5 a 8,0), NaCl 50 mM, y EDTA 1 mM en agua desionizada. </li></ol> 2. Preparación de lisado nuclear de células cultivadas Nota: Este protocolo experimental se ha optimizado el uso de líneas de células linfoblastoides B, pero se ha probado en varias otras líneas de células adherentes / suspensión no relacionados y funciona universalmente. <ol><li> Culture células linfoblastoides B en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutamina, suero bovino fetal 10%, y 1 x antibiótico-antimicótico que contiene 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 250 ng / ml de anfotericina B. <ol><li> Seed en un rango de 200,000-500,000 células viables / ml y se incuban frascos a 37 ° C con dióxido de carbono al 5% en una posición vertical con tapas ventiladas o sueltas. Nota: El crecimiento de las células linfoblastoides B se ralentiza cuando llegan a más de 1.000.000 células / ml. Romper blastos de células pipeteando arriba y abajo varias veces y las células volver a 200,000-500,000 células / ml para mantener una velocidad rápida de crecimiento. </li></ol></li><li> Lavar las células cultivadas dos veces con solución salina tamponada con 10 ml de hielo frío de fosfato (PBS), girar hacia abajo a 4 ° C, 300 xg durante 5 min y retirar PBS a través de la aspiración. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro y se vuelve a suspender sedimento como 1 ml de PBS enfriado en hielo por 10 7 células. Nota: Por ejemplo, si la lisis de 2 x 10 7 &lt;/ Sup&gt; células, se vuelve a suspender en 2 ml de PBS. </li><li> Alícuota de 1 ml a tubos de 1,5 ml de microcentrífuga de modo que cada tubo contiene 10 7 células en PBS. Centrifugar a 3300 xg durante 2 min 4 ° C y aspirado fuera de PBS. </li><li> Antes de usar, añadir ditiotreitol 1 mM (DTT), inhibidor de la fosfatasa 1x, y el inhibidor de la proteasa 1x a una madre de trabajo de tampón CE. Resuspender el sedimento celular con 400 l de tampón CE y se incuba en hielo durante 15 minutos. </li><li> Añadir 25 l de 10% de Nonidet P-40 y se mezcla con la pipeta. Se centrifuga a 4 ° C, velocidad máxima durante 3 minutos. Decantar y desechar el sobrenadante. </li><li> Antes de usar, añadir 1 mM de DTT, inhibidor de la fosfatasa 1x, 1x y inhibidor de la proteasa a una madre de trabajo de tampón NE. Resuspender el sedimento celular con 30 l de tampón NE y mezclar mediante agitación. </li><li> Se incuba a 4 ° C en un rotador de tubo o en hielo durante 10 min. Centrífuga 3300 xg durante 2 min 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante claro (lisado nuclear) y alícuota antes de almacenar a -806; C para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación que pueden degradar la proteína. Deja un alícuota de 10 l para medir la concentración de proteínas mediante el ensayo del ácido bichoninic (BCA) 31. </li></ol> 3. Desplazamiento de Movilidad electroforética de ensayo (EMSA) <ol><li> Preparar Oligo de Trabajo y EMSA gel. <ol><li> Si oligos fueron ordenados en dúplex, descongelar la madre 100 mM y se diluye 1: 2000 en tampón de recocido para conseguir una solución de trabajo de 50 nM. </li><li> Si oligos fueron ordenados de cadena simple, descongelar los 100 M existencias y se diluye 1:10 en tampón de recocido para alcanzar 100 acciones de trabajo nm. Combinar 100 l de la solución de hebra de complemento 100 nM entre sí en un tubo de microcentrífuga. <ol><li> Colocar en un bloque de calor a 95 ° C durante 5 min. Apagar el bloque de calor y permitir que los oligos se enfríen lentamente hasta temperatura ambiente durante al menos una hora antes de su uso. </li></ol></li><li> Pre-correr el gel EMSA. <ol><li> Retire el portaobjetos de un prefabricado 6% TBE gel y enjuague con agua desionizada varias veces para eliminar cualquier tampón de los pocillos. Preparar 1 L de tampón TBE 0,5x mediante la adición de 50 ml de 10x TBE a 950 ml de agua desionizada. </li><li> Montar el aparato de electroforesis en gel y comprobar si hay fugas llenando la cámara interior con tampón TBE 0,5x. Si no hay memoria intermedia se filtra en la cámara exterior, llenar la cámara exterior aproximadamente dos tercios del camino. </li><li> Pre-correr el gel a 100 V durante 60 min. </li><li> Lave cada pocillo con 200 l de tampón TBE 0,5x. </li></ol></li></ol></li><li> Preparar tampón de unión Mix Master. <ol><li> Preparar 10x tampón de unión con una concentración final de Tris 100 mM, KCl 500 mM, DTT 10 mM; pH 7,5 en agua desionizada. </li><li> En un tubo de microcentrífuga, crear una mezcla maestra que consiste en los reactivos comunes a todas las reacciones (10 l de 10x tampón de unión, 10 l de DTT / polisorbato, 5 l de poli d (IC), y ADN de esperma de salmón 2,5 l; tabla 2). Preparar un 10% adicionalpara tener en cuenta la pérdida de volumen debido a pipeteado. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Conc final. </td><td> Rxn # 1 </td><td> Rxn # 2 </td><td> Rxn # 3 </td><td> Rxn # 4 </td></tr><tr><td> Agua ultra pura </td><td> a 20 l vol. </td><td> 13,5 l </td><td> 11,98 l </td><td> 13.5μl </td><td> 11,98 l </td></tr><tr><td> 10x tampón de unión </td><td> 1x </td><td> 2 l </td><td> 2 l </td><td> 2 l </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> TDT / TW-20 </td><td> 1x </td><td> 2 l </td><td> 2 l </td><td> 2 l </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> ADN de esperma de salmón </td><td> 500 ng / l </td&gt; <td> 0,5 l </td><td> 0,5 l </td><td> 0,5 l </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> 1μg / l de poli d (IC) </td><td> 1 g </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Extracto Nuclear (5.26 ug / l) </td><td> 8 mg </td><td> - </td><td> 1,52 l </td><td> - </td><td> 1,52 l </td></tr><tr><td> NE Buffer </td><td></td><td> 1,52 l </td><td> - </td><td> 1,52 l </td><td> - </td></tr><tr><td> Referencia alelo oligo </td><td> 50 fmol </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> No es de referencia alelo oligo </td><td> 50 fmol </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Ejemplo EMSA setu reacciónp. La tabla ilustra un ejemplo EMSA para probar la hipótesis de que existe el genotipo unión dependiente de TFS a un SNP específico. <ol start="3"><li> Añadir agua libre de nucleasa a cada tubo de microcentrífuga de tal manera que el volumen final después de la adición de todos los reactivos será de 20 l. </li><li> Añadir la cantidad apropiada (5,5 l) de la mezcla maestra a cada tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 8 g de lisado nuclear para los tubos de microcentrífuga apropiadas. Incluyen tubos que contienen el oligo sin extracto nuclear como controles negativos (por ejemplo, la Tabla 2, Rxn # 1 y Rxn # 3). Nota: La cantidad óptima de lisado por reacción debe determinarse experimentalmente mediante valoración. En general, valoración de una gama de 2 a 10 g de lisado es suficiente. </li><li> Añadir 50 fmol de oligo a los tubos de microcentrífuga apropiados. Flick para mezclar y brevemente girar el contenido al fondo del tubo. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Nota: Si attempting de un supershift, incubar la mezcla de lisado con el anticuerpo durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de oligos. Se recomienda el uso de 1 mg de un anticuerpo chip-grado para mejores resultados. </li><li> Añadir 2 l de 10x naranja colorante de carga a cada tubo de microcentrífuga. Pipetear arriba y abajo para mezclar. </li><li> Cargar las muestras en la previa al funcionamiento de gel de TBE 6% pipeteando arriba y abajo para mezclar y luego la expulsión de cada muestra en un pocillo separado. Correr el gel a 80 V hasta que el colorante naranja ha migrado de 2/3 a 3/4 del camino hacia abajo el gel. Esto debe tomar aproximadamente 60-75 minutos. </li><li> Retire el gel de la casete de plástico haciendo palanca con un cuchillo de gel y colocar el gel en un recipiente con tampón TBE 0,5% para evitar que se reseque. </li><li> Colocar el gel en la superficie de un sistema de imágenes de infrarrojos y de quimioluminiscencia, asegurándose de eliminar cualquier burbuja o contaminantes que contribuyen a perturbar la imagen. </li><li> Utilizando el software de sistema de exploración, haga clic en la pestaña &quot;Adquirir&quot;y luego seleccionar &quot;Dibujo Nuevo&quot; para dibujar una caja alrededor de la zona correspondiente a donde el gel se encuentra en la superficie del escáner. </li><li> En la sección &quot;Canales&quot; de la pestaña &quot;Adquirir&quot;, seleccione el canal correspondiente a la longitud de onda de la etiqueta fluoróforo en el oligo. En la sección &quot;Escáner&quot;, haga clic en &quot;vista previa&quot; para obtener una vista previa del escaneo de baja calidad. Ajustar el área de escaneado arrastrando el cuadro azul que rodea a la previsualización de la imagen adquirida hasta la porción del gel para formar una imagen. Nota: Por ejemplo, si el uso de oligonucleótidos marcados con un fluoróforo 700 nm, asegúrese de que el canal &quot;700 nm&quot; se ha seleccionado antes de escanear. </li><li> En la sección &quot;Controles de escaneo&quot;, seleccione la opción &quot;84 M&quot; resolución y la calidad de la opción &quot;Medio&quot;. Establecer el foco para compensar a la mitad del grosor del gel. Nota: Por ejemplo, un gel de 1 mm utilizaría un 0,5 mm de desfase de enfoque. </li><li> En la sección &quot;Escáner&quot;, haga clic en &quot;Inicio&quot; para bEgin la exploración. Nota: Durante la exploración, el esquema de brillo, contraste y color a menudo se puede ajustar manualmente en función del fabricante del sistema de exploración. </li><li> Después de finalizado el análisis, seleccione la pestaña &quot;Imagen&quot; y haga clic en &quot;girar o voltear&quot; en la sección &quot;Crear&quot; para corregir la orientación. Guarde el archivo de imagen haciendo clic en &quot;Exportar&quot; en el menú principal y luego seleccione &quot;Imagen Individual con vistas.&quot; </li></ol> 4. ADN Purificación por Afinidad de ensayo (DAPA) <ol><li> Preparación de 5 M Oligo de trabajo Stock. <ol><li> Si oligos fueron ordenados en dúplex, descongelar la madre 100 mM y se diluye 1:20 en tampón de recocido para conseguir una solución de trabajo 5 micras. </li><li> Si oligos fueron ordenados de cadena simple, descongelar los 100 M existencias y se diluye 1:10 en tampón de recocido para alcanzar 10 M reservas de trabajo. Combinar 10 l de los 10 M cadenas complementarias entre sí. Colocar en un bloque de calor a 95 ° C durante5 minutos. Apagar el bloque de calor y permitir que los oligos enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente antes de su uso. </li></ol></li><li> Antes de comenzar, calentar el tampón de unión, el tampón de lavado de baja rigurosidad, tampón de lavado de alta rigurosidad, y tampón de elución a temperatura ambiente. Nota: Una concentración final de 50 ng / ml de poli d (IC) puede ser añadido a la memoria intermedia de unión, el tampón de lavado de baja rigurosidad, y tampón de lavado de alta rigurosidad para reducir el potencial de unión no específica de proteínas a los oligos. </li><li> Preparar las mezclas de unión para cada variante. <ol><li> Mezclar 1 volumen de lisado nuclear con 2 volúmenes de tampón de unión. Nota: La cantidad requerida de lisado debe determinarse experimentalmente debido a la variación abundancia de TFS. Uso de entre 100 a 250 g de lisado nuclear por columna es suficiente en la mayoría de los casos. </li><li> Añadir inhibidor de fosfatasa 1x, 1x inhibidor de la proteasa, y potenciador de unión 1x (opcional) y mezclar con un movimiento rápido el tubo varias veces. Nota: 100X de uniónpotenciador consta de 750 mM MgCl 2 y 300 mM ZnCl 2. Añadir potenciador de unión si la unión del TF al ADN depende de cofactores o agentes reductores. Si esta información no se conoce, añadir el promotor de unión. </li><li> Añadir 10 l de 5 M de ADN de captura biotinilado (50 pmol) a cada mezcla de unión respectiva. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Nota: El tiempo de incubación y la temperatura pueden variar dependiendo de la TF. Los valores óptimos deben determinarse experimentalmente. </li></ol></li><li> Añadir 100 l de microperlas de estreptavidina. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Para cada sonda oligo siendo probado, colocar una columna de unión en el separador magnético. Colocar un tubo de microcentrífuga directamente debajo de cada columna de unión y aplicar 100 l de tampón de unión para enjuagar la columna. </li><li> Pipetear los contenidos de cada mezcla de unión en columnas separadas y permitir que el líquido fluya completamente a través de la columna en la microcentrífugatubo antes de continuar. Asegúrese de etiquetar las columnas con el oligo variante que se utilizó en la mezcla de unión. Etiquetar las muestras de flujo continuo y reemplazar con nuevos tubos de microcentrífuga para recoger las aguas de lavado de baja rigurosidad. </li><li> Aplicar 100 l de tampón de lavado de baja rigurosidad a la columna; esperar hasta el depósito de la columna está vacía. Repetir el lavado de 4x. Etiquetar las muestras de lavado de baja rigurosidad y reemplazar con nuevos tubos de microcentrífuga para recoger las aguas de lavado de alta rigurosidad. </li><li> Aplicar 100 l de tampón de lavado de alta rigurosidad a la columna; esperar hasta el depósito de la columna está vacía. Repetir el lavado de 4x. Etiquetar las muestras de lavado de alta rigurosidad y reemplazar con nuevos tubos de microcentrífuga para recoger el pre-elución. </li><li> Añadir 30 l de tampón de elución nativa a la columna y dejar reposar durante 5 minutos. Etiquetar las muestras pre-elución y reemplazar con nuevos tubos de microcentrífuga para recoger la elución. Nota: Esto no eluir la proteína unida; se lava la alta rigurosidad restantetampón de la columna y se lo reemplaza con tampón de elución para maximizar la eficiencia de la elución. </li><li> Añadir un 50 l de tampón de elución nativa adicional para eluir la TFS encuadernados. Para un mayor rendimiento, pero eluato menos concentrado, añadir un 50 l adicionales de tampón de elución nativa y recoger el flujo continuo. Nota: Analizar las muestras de elución a través de espectrometría de masas para determinar la identidad de los TF unido 32. Después, verificar los resultados proteómicos a través de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida al sulfito (SDS-PAGE), seguido de una transferencia de Western 33. Si la espectrometría de masas no está disponible, ejecutar una tinción de plata usando la técnica estándar en lugar de una transferencia Western para determinar el tamaño de la proteína (s) que muestra el genotipo dependiente de la unión. Utilice esta información para reducir la lista de TFS predichos de los métodos de cálculo que se detallan en la introducción. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> A pesar de los avances en las tecnologías de secuenciación y genotipado han mejorado enormemente nuestra capacidad para identificar variantes genéticas asociadas con la enfermedad, nuestra capacidad para comprender los mecanismos funcionales afectadas por estas variantes se está quedando. Una fuente importante del problema es que muchas variantes asociados a la enfermedad se encuentran en n en la codificación de las regiones del genoma, lo que probablemente afectará más difícil de predecir mecanismos que controlan...

Secuenciación y genotipado basado en estudios, incluyendo estudios de genoma completo (GWAS Association), estudios candidato locus, y profundo de secuenciación de los estudios, han identificado muchas variantes genéticas que están estadísticamente asociados con una enfermedad, rasgo o fenotipo. Contrariamente a las predicciones iniciales, la mayoría de estas variantes (85-93%) se localizan en regiones no codificantes y no cambian la secuencia de aminoácidos de las proteínas de 1,2. Interpretación de la función de estas variantes no codificantes y la determinación de los mecanismos biológicos que los conectan a la enfermedad asociada, rasgo, o fenotipo ha demostrado ser un desafío 3-6. Hemos desarrollado una estrategia general para identificar los mecanismos moleculares que enlazan variantes a un fenotipo intermedio importante - la expresión génica. Esta tubería está específicamente diseñado para identificar la modulación de la unión por variantes genéticas TF. Esta estrategia combina los enfoques computacionales y técnicas de biología molecular destinadas a predecirefectos biológicos de las variantes candidatos in silico, y verificar estas predicciones empíricamente (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54093/54093fig1.jpg" /> Figura 1:.. Enfoque estratégico para el análisis de los pasos no codificantes de variantes genéticas que no están incluidos en el protocolo detallado asociado a este manuscrito están sombreados en gris <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54093/54093fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> En muchos casos, es importante comenzar mediante la ampliación de la lista de variantes para incluir a todos los de alta desequilibrio de unión (LD) con cada variante estadísticamente asociado. LD es una medida de asociación no aleatoria de los alelos en dos posiciones cromosómicas diferentes, que se puede medir por el r 2 Estadística 7. r 2 es una medida de la linKage desequilibrio entre dos variantes, con una unión perfecta r 2 = 1 denota entre dos variantes. Alelos en alto LD se encuentran a co-segregar en el cromosoma a través de poblaciones ancestrales. matrices de genotipos actuales no incluyen todas las variantes conocidas en el genoma humano. En su lugar, se aprovechan de la LD dentro del genoma humano e incluyen un subconjunto de las variantes conocidas que actúan como representantes de otras variantes dentro de una región particular del LD 8. Por lo tanto, una variante sin ninguna consecuencia biológica puede estar asociado con una enfermedad en particular, ya que es en LD con la variante de la causal variante con un efecto biológico significativo. Del procedimiento, se recomienda para convertir la última versión de los 1.000 genomas Proyecto 9 archivos variante llamada (VCF) en archivos binarios compatibles con PLINK 10,11, una herramienta de código abierto para el análisis de asociación de genoma completo. Posteriormente, todas las demás variantes genéticas con LD r 2&gt; 0,8 con cada entrada va genéticaRiant puede ser identificado como candidatos. Es importante la utilización de la población de referencia apropiada para este paso- por ejemplo, si una variante fue identificada en sujetos de ascendencia europea, los datos de los sujetos de ascendencia debe emplearse la misma para la expansión LD. expansión LD a menudo resulta en variantes de candidatos docenas, y es probable que sólo una pequeña fracción de estos contribuyen a mecanismo de la enfermedad. A menudo, no es factible para examinar experimentalmente cada una de estas variantes de forma individual. Es por lo tanto útil para aprovechar los miles de conjuntos de datos de genómica funcional públicamente disponibles como un filtro para priorizar las variantes. Por ejemplo, el consorcio ENCODE 12 ha realizado miles de experimentos chip-ss que describen la unión de TFS y co-factores, y las marcas de las histonas en una amplia gama de contextos, junto con los datos de la cromatina accesibilidad de las tecnologías tales como DNasa-ss 13, ATAC -seq 14 y ss Faire-15. DatabASES y servidores web, tales como la UCSC Genome Browser 16, Hoja de Ruta Epigenómica 17, 18 Epigenoma Blueprint, Cistrome 19 y 20 de RECONFIGURACIÓN proporcionan acceso libre a los datos producidos por estas y otras técnicas experimentales a través de una amplia gama de tipos y condiciones de las celdas. Cuando hay demasiadas variantes para examinar experimentalmente, estos datos se pueden utilizar para dar prioridad a los situados dentro de las regiones reguladoras probables en los tipos de células y tejidos pertinentes. Además, en los casos en que es una variante dentro de un pico de chip-ss para una proteína específica, estos datos pueden proporcionar pistas potenciales en cuanto a la TF (s) específico o co-factores cuya unión podría estar afectando. A continuación, las variantes resultantes prioridad son examinados experimentalmente para validar la unión usando EMSA 21,22 proteína genotipo dependiente predicho. EMSA mide el cambio en la migración de la oligo en un gel de TBE no reductor. oligo marcado con fluorescencia se incuba con ellisado nuclear, y la unión de factores nucleares retardará el movimiento del oligo en el gel. De esta manera, oligo que se ha unido factores más nucleares presentará como una señal fluorescente más fuerte sobre la exploración. En particular, la EMSA no requiere predicciones acerca de las proteínas específicas cuya unión se verán afectados. Una vez que se identifican las variantes que se encuentran dentro de las regiones reguladoras predichos y son capaces de factores nucleares diferencialmente de unión, se emplean métodos computacionales para predecir el TF (s) específico cuya unión podrían afectar. Nosotros preferimos utilizar CIS-BP 23,24, RegulomeDB 25, Uniprobe 26 y 27 JASPAR. Una vez que se identifican candidato TFS, estas predicciones pueden ser probados específicamente el uso de anticuerpos contra estos TFS (EMSA-supershifts y DAPA-Oeste). Un EMSA-supershift implica la adición de un anticuerpo específico-TF al lisado nuclear y oligo. Un resultado positivo en un EMSA-supershift es represented como un cambio adicional en la banda de EMSA, o una pérdida de la banda (revisado en referencia 28). En la DAPA complementaria, un dúplex de oligo 5 &#39;biotinilado que contiene la variante y la 20 pares de bases que flanquean nucleótidos se incuban con lisado nuclear de tipo de célula relevante (s) para capturar cualquier factores nucleares se unen específicamente a los oligos. El complejo del factor nuclear-duplex oligo es inmovilizado por estreptavidina microperlas en una columna magnética. Los factores nucleares unidas se recogieron directamente a través de la elución 29,48. predicciones de unión pueden ser evaluados por una transferencia de Western usando anticuerpos específicos para la proteína. En los casos en que no hay predicciones obvias, o demasiadas predicciones, las eluciones de variantes desplegables de los experimentos DAPA se pueden enviar a un núcleo de la proteómica para identificar TFS candidatos utilizando la espectrometría de masa, que posteriormente se pueden validar el uso de estos descritos anteriormente métodos. En el resto de la article, se proporciona el protocolo detallado para el análisis EMSA y DAPA de variantes genéticas.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleótidos de ADN personalizados</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td></tr><tr><td>cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>KCl, para tampón CE</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>para tampón CE y NE</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>R1021</td><td>para tampón CE, NE y recocido</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>NaCl, para tampón NE</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>BP1756-100</td><td>Para tampón de recocido</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (1x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21040CM</td><td>PBS, para lavado celular</td></tr><tr><td>Solución de DL-Ditiothreitol (1 M)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Agente reductor</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Cóctel</td><td>Thermo Scientific</td><td>87786</td><td>Previene el catabolismo del</td></tr><tr><td>cóctel inhibidor de la fosfatasa TF&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78420</td><td>Previene la desfosforilación de TFs</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Sustituto</td><td>IBI Scientific</td><td>IB01140</td><td>NP-40, para extracción nuclear</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Para medir la concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Odyssey EMSA Buffer Kit</td><td>Licor</td><td>829-07910</td><td>Contiene todos los tampones EMSA necesarios</td></tr><tr><td>Geles TBE, 6%, 12 pocillos</td><td>Invitrogen</td><td>EC6265BOX</td><td>para tampón EMSA</td></tr><tr><td>TBE (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td>para EMSA</td></tr><tr><td>FactorFinder Kit de inicio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-318</td><td>Contiene todos los tampones DAPA necesarios</td></tr><tr><td>Licor Odyssey CLx</td><td>Licor Escáner</td><td></td><td>recomendado para DAPA/EMSA</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Contiene 10.000 unidades/ml de penicilina, 10.000 &micro; g/ml de estreptomicina, y 25 &micro; g/ml de Fungizone&reg; Suero fetal bovino antimicótico</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>FBS, para medio de cultivo</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>22400-071</td><td>Contiene L-glutamina y 25 mM HEPES</td></tr></tbody></table>

la detección de funcional no codificante-variantes genéticas uso de movilidad electroforética shift ensayo (emsa) y el adn afinidad precipitación ensayo (dapa)

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

Los estudios genéticos basados en la población y la familia suelen dar lugar a la identificación de variantes genéticas que se asocian estadísticamente con una enfermedad clínica o fenotipo. Para muchas enfermedades y rasgos, la mayoría de las variantes no son codificantes y, por lo tanto, es probable que actúen afectando mecanismos sutiles y comparativamente difíciles de predecir que controlan la expresión génica. Aquí, describimos un enfoque estratégico general para priorizar las variantes no codificantes y seleccionarlas para determinar su función. Este enfoque implica la priorización computacional utilizando bases de datos genómicas funcionales, seguida de un análisis experimental de la unión diferencial de factores de transcripción (TF) a alelos de riesgo y no riesgo. Tanto para el análisis de variantes genéticas como para el análisis de variantes genéticas tanto en el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) como en el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA), se utiliza un oligonucleótido de ADN sintético (oligo) para identificar factores en el lisado nuclear de la enfermedad o células relevantes para el fenotipo. Para EMSA, los oligonucleótidos con o sin factores nucleares unidos (a menudo TF) se analizan mediante electroforesis no desnaturalizante en un gel de poliacrilamida de tris-borato-EDTA (TBE). Para DAPA, los oligonucleótidos se unen a una columna magnética y los factores nucleares que se unen específicamente a la secuencia de ADN se eluyen y analizan mediante espectrometría de masas o con una electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio reductor (SDS-PAGE) seguida de un análisis de Western blot. Este enfoque general puede ser ampliamente utilizado para estudiar la función de las variantes genéticas no codificantes asociadas con cualquier enfermedad, rasgo o fenotipo.

En esta sección, los resultados representativos de lo que cabe esperar se proporcionan al realizar una EMSA o DAPA, y la variabilidad en cuanto a se caracteriza la calidad de lisado. Por ejemplo, se ha sugerido que la congelación y descongelación muestras de proteínas varias veces puede dar lugar a la desnaturalización. Con el fin de explorar la reproducibilidad del análisis EMSA en el contexto de estos ciclos de &quot;congelación-descongelación&quot;, dos 35 oligos pb que difieren en un...

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...

El objetivo general de esta estrategia experimental es investigar la funcionalidad de las variantes no codificantes asociadas a la enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en genómica, como cómo las variantes genéticas que en realidad no cambian la secuencia de aminoácidos aún contribuyen al fenotipo de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un proceso simplificado para evaluar la varianza genética de la actividad de la función y proporciona información sobre las proteínas reguladoras y las vías afectadas.Esta técnica puede beneficiar la investigación de cualquier enfermedad con una variante causal candidata. Porque el procedimiento de análisis de estas variantes es universal independientemente del fenotipo que se estudie. Aunque este método puede proporcionar información sobre las enfermedades humanas, también se puede aplicar a las mutaciones en cualquier organismo.En este experimento se prepararán lisados nucleares a partir de células linfoblastoides B, sin embargo, este procedimiento se puede aplicar a la mayoría de las líneas celulares. Después de contar las células con un hemocitómetro, reduzca el número deseado de células para la lisis. Aspire el medio, agregue 10 mililitros de PBS helado y vuelva a centrifugar las celdas.Lave las celdas por segunda vez con PBS y retire el PBS después del centrifugado. Vuelva a suspender el paladar celular en PBS helado usando un mililitro de PBS por cada 10 celdas a la séptima. Alícuota de un mililitro de la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, de modo que cada tubo contiene de 10 a la séptima celdas en PBS.Centrifugar durante dos minutos y aspirar el PBS. Agregue a un stock de trabajo tampón CE, un milimolar de ditiotreitol, o DTT, inhibidor de fosfatasa 1X y fluoruro de fenilmetanosulfonilo o PMSF de 0,5 milimolares. Vuelva a suspender cada paleta de células con 400 microlitros de este tampón e incube en hielo durante 15 minutos.Añadir 25 microlitros de Nonidet P-40 al 10% a cada tubo de microcentrífuga y mezclar mediante pipeteo. Centrifugar a cuatro grados centígrados y velocidad máxima durante tres minutos. Decantar y desechar el sobrenadante.A continuación, agregue a un stock de trabajo de tampón NE, un DTT milimolar, un inhibidor de fosfoaasa 1X y un PMSF milimolar. Resuspender cada célula del paladar con 30 microlitros de este tampón y mezclar por vórtice. Incubar a 4 grados centígrados, en un rotador de tubos, durante 10 minutos.Centrifugar durante dos minutos. Recoge el sobrenadante transparente, que es el lisado nuclear. Aliquotar el lisado nuclear antes de almacenarlo a menos 80 grados centígrados para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación que puedan degradar la proteína.Comience este procedimiento preparando un material de trabajo de 50 nanomolares del oligonucleótido, como se describe en el texto del protocolo. Coloque los oligonucleótidos en un bloque de calor a 90 grados centígrados durante cinco minutos. Después de cinco minutos, apague el bloque de calor y deje que los oligonucleótidos se enfríen lentamente a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de usar.A continuación, prepare el ensayo de cambio de movilidad electroforética o gel EMSA. Retire el portaobjetos de un gel prefabricado de tris-borato-EDTA o TBE al seis por ciento, y enjuague con agua desionizada varias veces para eliminar cualquier tampón de los pozos. Ensamble el aparato de electroforesis en gel y verifique si hay fugas llenando la cámara interna con tampón TBE 0.5X.Si no hay fugas de tampón en la cámara exterior, llene la cámara exterior, aproximadamente, dos tercios de su capacidad. Deje correr el gel a 100 voltios durante 60 minutos. Cuando se complete la ejecución previa, enjuague cada pocillo con 200 microlitros de tampón 0.5X TBE.Prepare una mezcla maestra de búfer de enlace. En un tubo de microcentrífuga, mezcle estos reactivos que son comunes a todas las reacciones. Tampón de unión 10X, polisorbato DTT, Poly(dI-dC) y ADN de esperma de salmón.Para configurar las reacciones EMSA, agregue agua libre de nucleasas a cada tubo de microcentrífuga, de modo que el volumen final, después de la adición de todos los reactivos, sea de 20 microlitros. Agregue la cantidad adecuada de mezcla maestra a cada tubo de microcentrífuga. Añada ocho microgramos de lisado nuclear a los tubos de microcentrífuga adecuados.Incluir los tubos que contienen el oligonucleótico, sin extracto nuclear, como controles negativos. Agregue 50 femtomoles de oligo a los tubos de microcentrífuga apropiados y mezcle para mezclar. Gire brevemente el contenido hasta el fondo del tubo.Incubar todos los tubos, durante 20 minutos, a temperatura ambiente. A continuación, agregue dos microlitros de tinte de carga naranja 10X a cada tubo de microcentrífuga. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar.Cargue las muestras en el gel TBE del seis por ciento previo pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar y luego expulsar cada muestra a un pocillo separado. Pasa el gel a 80 voltios durante aproximadamente 60 a 75 minutos, hasta que el tinte naranja haya migrado de dos tercios a tres cuartos del camino por el gel. Cuando termine la carrera, use un cuchillo de gel para abrir el casete de plástico.Retire el gel del casete y colóquelo en un recipiente con un 0,5 por ciento de tampón TBE para evitar que se seque. Coloque el gel en la superficie de un sistema de imágenes infrarrojas y de quimioluminiscencia. Elimine cualquier burbuja o contaminante que pueda alterar la imagen.Escanee el gel utilizando el software del sistema de escaneo como se describe en el texto del protocolo. Para comenzar este procedimiento, prepare un material de trabajo de cinco oligonucleótidos micromolares como se describe en el texto del protocolo. Coloque los oligonucleótidos en un bloque de calor a 95 grados centígrados durante cinco minutos.Después de cinco minutos, apague el bloque de calor y deje que los oligonucleótidos se enfríen lentamente a temperatura ambiente antes de usarlos. Caliente los siguientes tampones a temperatura ambiente: tampón de unión, tampón de lavado de baja rigurosidad, tampón de lavado de alta rigurosidad y tampón de elución. Prepare las mezclas aglutinantes para cada variante.Mezcle un volumen de lisado nuclear con dos volúmenes de tampón de unión. Agregue 1X inhibidor de fosfatasa, PMSF 0.5 milimolar y 1X potenciador de unión. Agregue 10 microlitros de ADN de captura biotinilado de cinco micromolares a cada mezcla de unión.Mezcle moviendo el tubo varias veces. Incubar las mezclas aglutinantes durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue 100 microlitros de MicroBeads de estreptavidina a cada mezcla aglutinante.Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para cada sonda de oligonucleótidos que se esté probando, coloque una columna de unión en el separador magnético. Asegúrese de que las columnas estén etiquetadas con la variante de oligo que se utilizó en la mezcla de unión.Coloque un tubo de microcentrífuga directamente debajo de cada columna de unión y aplique 100 microlitros de tampón de unión para enjuagar la columna. Pipetear el contenido de cada mezcla aglutinante en columnas separadas. Deje que el líquido fluya completamente a través de la columna hacia el tubo de microcentrífuga.Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de baja rigurosidad a la columna y espere hasta que el depósito de la columna esté vacío. Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de baja rigurosidad a la columna nuevamente. Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de alta rigurosidad a la columna y espere hasta que el depósito de la columna esté vacío.Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de alta rigurosidad a la columna nuevamente. Agregue 30 microlitros de tampón de elución nativo a la columna y deje reposar durante cinco minutos. Por último, añada 50 microlitros adicionales de tampón de elución nativo para eluir los factores de transcripción unidos.Con el fin de explorar la reproducibilidad de los resultados de EMSA y las consecuencias de los ciclos de congelación y descongelación, se utilizaron oligonucleótidos que contenían el alelo de referencia o no de referencia de una variante genética para probar la misma preparación de extracto nuclear de linfocitos B después de múltiples ciclos de congelación y descongelación. La flecha azul indica la sonda libre. La unión de los factores de transcripción al oligonucleótido se ve como una banda en la mitad superior del gel, indicada por la flecha roja.Estos resultados indican que la congelación y descongelación de este extracto nuclear en particular hasta cinco veces no tiene, aparentemente, ningún efecto sobre la integridad de las proteínas. También es importante optimizar la relación señal/ruido para la EMSA. Se utilizaron varias concentraciones de oligonucleótidos para sondear una sola preparación de lisado nuclear.Se observó un aumento en la intensidad de la banda, hasta 100 femtomoles de oligonucleótido. Aquí se muestran los resultados representativos de un estudio de un alelo de riesgo asociado al lupus. El factor de transcripción, STAT 1, se identificó por primera vez mediante DAPA seguido de un análisis proteómico.A continuación, un Western blot de DAPA confirmó la identidad de STAT 1 y la mayor unión de la forma fosforilada de STAT 1 al oligonucleótido de riesgo de lupus. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como la espectrometría de masas y el Western blot. Esto nos ayudará a identificar la proteína reguladora que muestra la unión dependiente de alelos.Los ensayos reporteros, como la luciferasa, también se pueden utilizar para investigar los cambios en la expresión génica en función de los alelos.

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