La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

El objetivo general de esta estrategia experimental es investigar la funcionalidad de las variantes no codificantes asociadas a la enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en genómica, como cómo las variantes genéticas que en realidad no cambian la secuencia de aminoácidos aún contribuyen al fenotipo de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un proceso simplificado para evaluar la varianza genética de la actividad de la función y proporciona información sobre las proteínas reguladoras y las vías afectadas.

Esta técnica puede beneficiar la investigación de cualquier enfermedad con una variante causal candidata. Porque el procedimiento de análisis de estas variantes es universal independientemente del fenotipo que se estudie. Aunque este método puede proporcionar información sobre las enfermedades humanas, también se puede aplicar a las mutaciones en cualquier organismo.

En este experimento se prepararán lisados nucleares a partir de células linfoblastoides B, sin embargo, este procedimiento se puede aplicar a la mayoría de las líneas celulares. Después de contar las células con un hemocitómetro, reduzca el número deseado de células para la lisis. Aspire el medio, agregue 10 mililitros de PBS helado y vuelva a centrifugar las celdas.

Lave las celdas por segunda vez con PBS y retire el PBS después del centrifugado. Vuelva a suspender el paladar celular en PBS helado usando un mililitro de PBS por cada 10 celdas a la séptima. Alícuota de un mililitro de la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, de modo que cada tubo contiene de 10 a la séptima celdas en PBS.

Centrifugar durante dos minutos y aspirar el PBS. Agregue a un stock de trabajo tampón CE, un milimolar de ditiotreitol, o DTT, inhibidor de fosfatasa 1X y fluoruro de fenilmetanosulfonilo o PMSF de 0,5 milimolares. Vuelva a suspender cada paleta de células con 400 microlitros de este tampón e incube en hielo durante 15 minutos.

Añadir 25 microlitros de Nonidet P-40 al 10% a cada tubo de microcentrífuga y mezclar mediante pipeteo. Centrifugar a cuatro grados centígrados y velocidad máxima durante tres minutos. Decantar y desechar el sobrenadante.

A continuación, agregue a un stock de trabajo de tampón NE, un DTT milimolar, un inhibidor de fosfoaasa 1X y un PMSF milimolar. Resuspender cada célula del paladar con 30 microlitros de este tampón y mezclar por vórtice. Incubar a 4 grados centígrados, en un rotador de tubos, durante 10 minutos.

Centrifugar durante dos minutos. Recoge el sobrenadante transparente, que es el lisado nuclear. Aliquotar el lisado nuclear antes de almacenarlo a menos 80 grados centígrados para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación que puedan degradar la proteína.

Comience este procedimiento preparando un material de trabajo de 50 nanomolares del oligonucleótido, como se describe en el texto del protocolo. Coloque los oligonucleótidos en un bloque de calor a 90 grados centígrados durante cinco minutos. Después de cinco minutos, apague el bloque de calor y deje que los oligonucleótidos se enfríen lentamente a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de usar.

A continuación, prepare el ensayo de cambio de movilidad electroforética o gel EMSA. Retire el portaobjetos de un gel prefabricado de tris-borato-EDTA o TBE al seis por ciento, y enjuague con agua desionizada varias veces para eliminar cualquier tampón de los pozos. Ensamble el aparato de electroforesis en gel y verifique si hay fugas llenando la cámara interna con tampón TBE 0.5X.

Si no hay fugas de tampón en la cámara exterior, llene la cámara exterior, aproximadamente, dos tercios de su capacidad. Deje correr el gel a 100 voltios durante 60 minutos. Cuando se complete la ejecución previa, enjuague cada pocillo con 200 microlitros de tampón 0.5X TBE.

Prepare una mezcla maestra de búfer de enlace. En un tubo de microcentrífuga, mezcle estos reactivos que son comunes a todas las reacciones. Tampón de unión 10X, polisorbato DTT, Poly(dI-dC) y ADN de esperma de salmón.

Para configurar las reacciones EMSA, agregue agua libre de nucleasas a cada tubo de microcentrífuga, de modo que el volumen final, después de la adición de todos los reactivos, sea de 20 microlitros. Agregue la cantidad adecuada de mezcla maestra a cada tubo de microcentrífuga. Añada ocho microgramos de lisado nuclear a los tubos de microcentrífuga adecuados.

Incluir los tubos que contienen el oligonucleótico, sin extracto nuclear, como controles negativos. Agregue 50 femtomoles de oligo a los tubos de microcentrífuga apropiados y mezcle para mezclar. Gire brevemente el contenido hasta el fondo del tubo.

Incubar todos los tubos, durante 20 minutos, a temperatura ambiente. A continuación, agregue dos microlitros de tinte de carga naranja 10X a cada tubo de microcentrífuga. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar.

Cargue las muestras en el gel TBE del seis por ciento previo pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar y luego expulsar cada muestra a un pocillo separado. Pasa el gel a 80 voltios durante aproximadamente 60 a 75 minutos, hasta que el tinte naranja haya migrado de dos tercios a tres cuartos del camino por el gel. Cuando termine la carrera, use un cuchillo de gel para abrir el casete de plástico.

Retire el gel del casete y colóquelo en un recipiente con un 0,5 por ciento de tampón TBE para evitar que se seque. Coloque el gel en la superficie de un sistema de imágenes infrarrojas y de quimioluminiscencia. Elimine cualquier burbuja o contaminante que pueda alterar la imagen.

Escanee el gel utilizando el software del sistema de escaneo como se describe en el texto del protocolo. Para comenzar este procedimiento, prepare un material de trabajo de cinco oligonucleótidos micromolares como se describe en el texto del protocolo. Coloque los oligonucleótidos en un bloque de calor a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, apague el bloque de calor y deje que los oligonucleótidos se enfríen lentamente a temperatura ambiente antes de usarlos. Caliente los siguientes tampones a temperatura ambiente: tampón de unión, tampón de lavado de baja rigurosidad, tampón de lavado de alta rigurosidad y tampón de elución. Prepare las mezclas aglutinantes para cada variante.

Mezcle un volumen de lisado nuclear con dos volúmenes de tampón de unión. Agregue 1X inhibidor de fosfatasa, PMSF 0.5 milimolar y 1X potenciador de unión. Agregue 10 microlitros de ADN de captura biotinilado de cinco micromolares a cada mezcla de unión.

Mezcle moviendo el tubo varias veces. Incubar las mezclas aglutinantes durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue 100 microlitros de MicroBeads de estreptavidina a cada mezcla aglutinante.

Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para cada sonda de oligonucleótidos que se esté probando, coloque una columna de unión en el separador magnético. Asegúrese de que las columnas estén etiquetadas con la variante de oligo que se utilizó en la mezcla de unión.

Coloque un tubo de microcentrífuga directamente debajo de cada columna de unión y aplique 100 microlitros de tampón de unión para enjuagar la columna. Pipetear el contenido de cada mezcla aglutinante en columnas separadas. Deje que el líquido fluya completamente a través de la columna hacia el tubo de microcentrífuga.

Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de baja rigurosidad a la columna y espere hasta que el depósito de la columna esté vacío. Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de baja rigurosidad a la columna nuevamente. Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de alta rigurosidad a la columna y espere hasta que el depósito de la columna esté vacío.

Aplique 100 microlitros de tampón de lavado de alta rigurosidad a la columna nuevamente. Agregue 30 microlitros de tampón de elución nativo a la columna y deje reposar durante cinco minutos. Por último, añada 50 microlitros adicionales de tampón de elución nativo para eluir los factores de transcripción unidos.

Con el fin de explorar la reproducibilidad de los resultados de EMSA y las consecuencias de los ciclos de congelación y descongelación, se utilizaron oligonucleótidos que contenían el alelo de referencia o no de referencia de una variante genética para probar la misma preparación de extracto nuclear de linfocitos B después de múltiples ciclos de congelación y descongelación. La flecha azul indica la sonda libre. La unión de los factores de transcripción al oligonucleótido se ve como una banda en la mitad superior del gel, indicada por la flecha roja.

Estos resultados indican que la congelación y descongelación de este extracto nuclear en particular hasta cinco veces no tiene, aparentemente, ningún efecto sobre la integridad de las proteínas. También es importante optimizar la relación señal/ruido para la EMSA. Se utilizaron varias concentraciones de oligonucleótidos para sondear una sola preparación de lisado nuclear.

Se observó un aumento en la intensidad de la banda, hasta 100 femtomoles de oligonucleótido. Aquí se muestran los resultados representativos de un estudio de un alelo de riesgo asociado al lupus. El factor de transcripción, STAT 1, se identificó por primera vez mediante DAPA seguido de un análisis proteómico.

A continuación, un Western blot de DAPA confirmó la identidad de STAT 1 y la mayor unión de la forma fosforilada de STAT 1 al oligonucleótido de riesgo de lupus. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como la espectrometría de masas y el Western blot. Esto nos ayudará a identificar la proteína reguladora que muestra la unión dependiente de alelos.

Los ensayos reporteros, como la luciferasa, también se pueden utilizar para investigar los cambios en la expresión génica en función de los alelos.