Caracterización estructural de polisacáridos de pared celular mananos en plantas con ritmo

El objetivo general de este experimento es caracterizar los polisacáridos de la pared celular de las plantas. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la biología de la pared celular de las plantas, incluida la estructura y la cantidad de glucomanano. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere formación especializada ni equipos costosos.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la interpretación de los geles, por lo que la inclusión y la comprensión de todos los controles descritos es fundamental. El alcohol y el residuo soluble, o AIR, se preparan previamente a partir de material vegetal cosechado como se describe en el protocolo de texto. Pese seis miligramos de AIRE en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y agregue agua hasta una concentración final de dos miligramos por mililitro.

Vortex para lograr una suspensión uniforme. Alícuota 500 microgramos en tubos de microfuga. Seque las alícuotas con una centrífuga de vacío a 30 grados centígrados durante la noche.

Trate previamente el AIRE, incluida una alícuota para un control de AIRE sin enzimas con hidróxido de sodio molar durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, agregue 200 microlitros de agua y 20 microlitros de ácido clorhídrico molar a cada tubo para neutralizar el hidróxido de sodio. Pruebe que el pH sea de aproximadamente seis a siete quitando un microlitro y manchándolo en las tiras indicadoras de pH de papel.

Agregue 50 microlitros de un tampón de acetato de amonio molar pH 6.0 y agregue agua hasta un volumen total de 500 microlitros a cada tubo. Para comenzar este procedimiento, agregue una cantidad predeterminada de mananasas a las alícuotas de AIR y al búfer. Incluya controles negativos apropiados, así como un control positivo.

Agite el vórtice y luego gire brevemente para recoger la mezcla de reacción en el fondo del tubo. Incubar a 37 grados centígrados con una suave agitación durante la noche. Al día siguiente, detenga la reacción incubando a 95 grados centígrados durante 20 minutos.

Centrifugar a máxima velocidad durante 10 minutos. Guarde el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet en 250 microlitros de agua. Centrifugar de nuevo y retener el sobrenadante.

Combine ambos sobrenadantes y seque en una centrífuga al vacío a 30 grados centígrados durante unas tres horas. Antes del procedimiento de derivatización, prepare los reactivos necesarios como se describe en el protocolo de texto. Caliente la solución madre de 0,2 molares ANTS a 60 grados centígrados para disolver completamente el sólido.

A cada muestra, agregue cinco microlitros de ANTS, cinco microlitros de dos picolinas-borano y 10 microlitros de tampón de derivatización. Gire brevemente para acumularse en el fondo del tubo, haga un vórtice a fondo y luego vuelva a girar brevemente. Incubar las muestras durante la noche a 37 grados centígrados, protegidas de la luz.

Al día siguiente, seque las muestras en una centrífuga al vacío a 30 grados centígrados durante unas dos horas. Resuspender cada muestra en oligosacárido patrón y 100 microlitros de urea de tres molares. Almacene a menos 20 grados centígrados protegido de la luz hasta que se necesite.

El montaje del equipo de fundición en gel dependerá de la marca. Para el equipo utilizado en esta demostración, un gel equivale a 50 mililitros. En un tubo de centrífuga de 50 mililitros, mezcle 20,2 mililitros de agua, cinco mililitros de tampón PACE 10x, 24,6 mililitros de acrilamida al 40%/bis-acrilamida, 200 microlitros de APS y 20 microlitros de TEMED.

Invierta suavemente para mezclar teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Utilice una pipeta serológica u otra pipeta de gran volumen para verter el gel resolutivo a aproximadamente cuatro centímetros por debajo de la parte superior de las placas de vidrio. Cubra cuidadosamente el gel con alcohol isopropílico.

Deje que el gel se polimerice durante 20 a 30 minutos. Vierte la capa superior. Seque el exceso de líquido con papel secante.

A continuación, haz el gel de apilamiento. En un tubo de centrífuga de 15 mililitros, mezcle 6,8 mililitros de agua, un mililitro de tampón PACE 10x, 2,8 mililitros de acrilamida/bis-acrilamida, 80 microlitros de APS y ocho microlitros de TEMED. Invierta para mezclar y superponga sobre el gel de resolución polimerizado.

Inserte suavemente el peine evitando atrapar burbujas de aire debajo de los dientes del peine. Después de que el gel se haya polimerizado, envuélvalo en un pañuelo húmedo y luego en una envoltura de plástico, y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que lo necesite. Para ayudar a realizar un seguimiento del orden de carga e identificar dónde están los pozos una vez que se retira el panal, use un marcador permanente para etiquetar las posiciones de los pozos en el vidrio.

Retira el peine. Llene los pozos con un tampón PACE X. Utilice una jeringa de 10 microlitros para cargar dos microlitros de patrones y muestras en los pocillos.

Evite usar los carriles más exteriores, que tienden a procesar mal las muestras y dejan un carril vacío entre las muestras. Ensamble la cámara superior del aparato de gel para correr y coloque el gel en un tanque de funcionamiento enfriado que contenga un tampón X PACE. Llene la cámara superior con un tampón PACE X.

Encienda la alimentación y haga funcionar el gel a 200 voltios durante 30 minutos. Después de 30 minutos, aumente el voltaje a 1, 000 voltios durante una hora y 40 minutos. Protege el gel de la luz.

Comience limpiando el sistema de imágenes de gel con un pañuelo húmedo que no suelte pelusa para asegurarse de que esté libre de polvo. Retire el gel del tanque PACE y observe brevemente mientras el gel aún está en las placas de vidrio para determinar si el frente del tinte todavía está en el gel. Use una herramienta de cuña para abrir el gel y, mientras el gel aún está en un plato de vidrio, use un cortador de pizza para quitar tanto el gel de apilamiento como la parte inferior del gel si el frente del tinte todavía está en el gel.

Dispense unos cinco mililitros de agua sobre la superficie del transiluminador y luego transfiera el gel directamente al transiluminador. Con el software, configure el filtro en UV 605 y encienda el transiluminador UV de onda larga. Tome varias imágenes en varios momentos de exposición, asegurándose de apagar la luz ultravioleta entre imágenes para evitar degradar la fluorescencia.

Asegúrese de que al menos dos de las imágenes no tengan bandas saturadas. Guarde los archivos como imágenes TIFF de alta resolución. Se muestra un gel representativo de un ensayo PACE estándar del contenido de manano en la pared celular.

Los carriles uno, dos y tres muestran una escalera de oligosacáridos comprados comercialmente a una concentración de cinco, 10 y 50 picomoles respectivamente. El carril cuatro muestra una digestión de mananasa de glucomanano konjac que sirve como control positivo tanto para la digestión enzimática como para la reacción de derivatización en presencia de la enzima y las sales tampón. El carril cinco muestra la huella dactilar PACE de un tallo de Arabidopsis de tipo salvaje.

El carril seis muestra la huella dactilar PACE del tallo de una planta Arabidopsis que carece de la tallo principal, el manano sintasa. En comparación con el tipo salvaje, solo hay una pequeña cantidad de manano, como lo demuestran las intensidades de banda reducidas para todos los oligosacáridos derivados de la mananasa. El carril 10 muestra la huella dactilar PACE de la madera de pino que contiene galactoglucomanano y tiene un patrón de oligosacáridos liberados claramente diferente al de Arabidopsis.

Los carriles siete, ocho, nueve y 11 son varios controles negativos que revelan bandas inespecíficas marcadas con asteriscos que deben excluirse del análisis. Después de ver este video, deberías tener una muy buena comprensión de cómo analizar la estructura del manán usando PACE. Una vez dominada, esta técnica se puede aplicar a otros polisacáridos de interés utilizando diferentes glicosilhidrolasas.

Hemos tenido éxito aplicando esta técnica a muchas otras especies de plantas, además de Arabidopsis, así como a otras especies no vegetales, como el manán de levadura.