Microscopía de fluorescencia intravital para estudiar la formación de trombos microvasculares

La microscopía de fluorescencia intravital es útil para estudiar la inducción fototóxica de la formación de un trombo (un coágulo de sangre) en el sitio de una lesión microvascular.

Comience tomando un ratón sin pelo anestesiado inyectado con un polisacárido fototóxico marcado con fluoróforo. Coloque el ratón en posición prona sobre una plataforma de calentamiento para mantener la temperatura fisiológica para una correcta circulación sanguínea.

Coloque la parte apical de la oreja bajo un microscopio de fluorescencia intravital. Tras la excitación con luz, el fluoróforo emite fluorescencia, lo que permite monitorear el flujo sanguíneo microvascular. Aumente la intensidad de la luz para inducir la formación de trombos.

El fluoróforo absorbe la luz de alta intensidad y reacciona con el oxígeno molecular para generar especies reactivas de oxígeno. Estas moléculas causan estrés oxidativo en las células endoteliales, lo que conduce al daño celular y la exposición de la matriz subendotelial.

Las células dañadas liberan mediadores trombóticos que unen el colágeno expuesto en la matriz subendotelial y las plaquetas circulantes, que se unen a los mediadores a través de receptores específicos.

La unión activa las plaquetas, provocando la liberación de moléculas efectoras que activan y reclutan otras plaquetas circulantes en el sitio de la lesión. Las proteínas fibrinógenas circulantes se unen a los receptores de fibrinógeno en las plaquetas activadas, uniéndolos para formar un tapón plaquetario.

Visualice el flujo sanguíneo restringido para confirmar el tapón plaquetario, el paso principal de la formación de trombos.

Coloque al animal en la plataforma debajo del microscopio estereoscópico. Utilice un aumento de 10X. Para la microscopía del oído derecho, prepare la vena yugular izquierda creando primero una incisión de 5 milímetros en la piel del cuello en dirección craneocaudal. Luego, use microfórceps y microtijeras para diseccionar el tejido subcutáneo. Luego, libere la vena de su adventicia sin tocar el vaso.

Ahora, use la jeringa de insulina previamente preparada para la inyección del tinte fluorescente. Agarre con cuidado la pared del vaso con las micropinzas sin perforar la vena. Penetre la pared del vaso distendido con la aguja de la jeringa e inyecte FITC-dextrano por vía intravenosa. Retire la aguja y detenga el sangrado con hisopos de algodón. Evite la contaminación del oído con sangre y tintes.

Transfiera el animal en la placa calefactora a una construcción de vidrio acral con una ranura para la placa calefactora y un plano de 0,5 centímetros de altura para colocar la oreja. Fije al animal en posición prona sobre la placa calefactora con un vendaje adhesivo. Coloque el cartílago convexo en la base de la oreja al lado del plano de la oreja para que la parte apical de la oreja pueda colocarse plana en el plano. Agregue una gota de agua a temperatura ambiente a la placa de vidrio acral. Con hisopos de algodón, absorba la gota de agua y deje que las fuerzas capilares unan el plano de la oreja al vidrio acral.

La aurícula debe colocarse lo más plana posible, aunque el cartílago le da a la aurícula una forma convexa. Por lo tanto, solo la parte distal más flexible de la aurícula debe colocarse en la placa de vidrio acral. Para evitar daños en los tejidos y la extravasación del tinte congelado, toque la oreja lo menos posible con las pinzas.

A continuación, agregue una gota de agua en el lado dorsal convexo de la oreja. Coloque con cuidado un cubreobjetos en la oreja sin comprimir los vasos basales que ingresan al oído. Use hisopos de algodón para eliminar la mayor cantidad posible de agua de debajo del cubreobjetos, para minimizar la distancia entre el cubreobjetos y los vasos objetivo de la oreja.

Comience ajustando el microscopio de fluorescencia intravital para la visualización de FITC-dextrano. Transfiera el animal preparado al escritorio del microscopio de fluorescencia intravital. Con un aumento de 5X, 10X y 20X y una intensidad de luz del 20%, busque un vaso venoso de 50 a 60 micras de diámetro y con un flujo sanguíneo anterógrado.

Agregue una gota de agua a temperatura ambiente al cubreobjetos para sumergir en agua el objetivo de aumento de 63X. Inmediatamente después de la aplicación de la gota de agua, comience a registrar el vaso durante 20 segundos para la evaluación de referencia del diámetro y el flujo sanguíneo. Comience la inducción de trombos 5 minutos después de la inyección de FITC-dextrano. Para ello, aumente la intensidad de la luz al 100%.

Durante la inducción de trombos fototóxicos, cierre la apertura del microscopio durante 2 segundos dentro de un período de 30 segundos para verificar si hay oclusión del flujo sanguíneo. Si el flujo sanguíneo persiste, abra la abertura nuevamente. El vaso se clasifica como ocluido si el flujo permanece detenido durante 30 segundos o más, o si el flujo sanguíneo es retrógrado. Seleccione y ocluya cinco vasos por oído dentro de un período de 1 hora después de la inyección de FITC-dextrano.