Inducción de enterocolitis necrotizante en modelo enteroide epitelial humano

Obtener criptas derivadas del tejido del intestino delgado humano: invaginaciones tubulares que contienen células madre y varios tipos de células epiteliales.

Agregue las criptas intestinales en una matriz basal fría.

Transfiera esta mezcla a una placa de pocillos múltiples, creando una cúpula tridimensional.

Agregue el medio de crecimiento e incube.

Las células madre se autoorganizan, proliferan y se diferencian en múltiples tipos de células intestinales, formando enterosferas.

Con el tiempo, las enterosferas maduran y se convierten en enteroides, estructuras tridimensionales que se renuevan a sí mismas, que se asemejan a las criptas intestinales.

Agregue lipopolisacáridos, o LPS, una endotoxina bacteriana, en el pocillo que contiene enteroides e incube.

Las moléculas de LPS se unen al receptor tipo toll en el enteroide, iniciando una respuesta proinflamatoria, lo que resulta en la acumulación de especies reactivas de oxígeno. Esto desencadena una cascada de eventos que conducen a la apoptosis.

En consecuencia, la integridad del enteroide se ve comprometida, lo que lleva a la penetración de LPS en la luz, intensificando aún más la respuesta inflamatoria.

Esto imita el desarrollo de enterocolitis necrotizante, una inflamación severa en los intestinos de los bebés prematuros.

En el momento de la recolección en la sala de operaciones, coloque la muestra de tejido del intestino delgado humano en DPBS frío. Lave la muestra en el DPBS frío hasta que esté libre de sangre y heces.

Almacene la muestra en medio RPMI 1640 a cuatro grados Celsius hasta que esté lista para el aislamiento de la cripta. Cuando esté listo para continuar, vuelva a verificar para asegurarse de que la muestra esté libre de heces y sangre. Con unas tijeras de disección delicadas, retire el exceso de grasa o los clips y grapas quirúrgicos. Pesa el espécimen y apunta a una pieza de aproximadamente 0,75 a 2,5 gramos.

A continuación, corte el tejido en trozos de 0,5 centímetros y colóquelos en un tubo que contenga 30 mililitros de tampón quelante # 1. Agitar a baja velocidad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, filtre el tejido a través de un colador celular de 100 micrómetros y deseche el flujo.

Agregue el tejido filtrado a un tubo que contenga 30 mililitros de tampón quelante # 2. Agitar a baja velocidad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Filtre el tejido a través de un filtro de 100 micrómetros y deseche el flujo continuo.

Después de esto, descongele 500 microlitros de matriz de membrana basal en hielo para su uso posterior. Agregue un poco de papel a 10 mililitros de DMEM frío en un tubo cónico de 50 mililitros y agite vigorosamente a mano durante 10 segundos. Filtre esta suspensión a través de un filtro celular de 100 micrómetros y recoja el flujo continuo. Mantenga este tubo en hielo.

Agregue un poco de papel a otros 10 mililitros de DMEM frío en un tubo cónico separado de 50 mililitros y agite vigorosamente a mano durante 10 segundos. Filtre esta suspensión a través de un filtro celular de 100 micrómetros y recoja el flujo continuo.

Repita este proceso dos veces más hasta que haya cuatro tubos cónicos que contengan flujo continuo etiquetados del uno al cuatro. Luego, filtre la solución en el tubo número uno a través de un filtro celular de 100 micrómetros y transfiera el flujo a un tubo cónico de 15 mililitros también etiquetado como número uno. Repita este proceso para los tubos dos a cuatro.

Centrifugar los tubos de 15 mililitros a 200 veces g y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. En una campana de flujo laminar, retire el sobrenadante de cada tubo y deséchelo. Evite interrumpir la nube de tejido inmediatamente encima del gránulo, incluso si eso significa dejar algo de sobrenadante. En cada tubo, pipetea hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclar el gránulo con el sobrenadante sobrante.

Transfiera la mezcla de cada tubo a un solo tubo cónico de 2 mililitros y centrifugue a 200 veces g y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de esto, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros de matriz de membrana basal predescongelada.

Utilice una punta de pipeta fría para aplicar 50 microlitros de esta suspensión en el centro de un pocillo en una placa de 24 pocillos. Esta muestra debe aparecer en forma de cúpula. Repita este proceso de aplicación nueve veces para llenar 10 pozos en total.

Transfiera la placa de 24 pocillos a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir la polimerización. Luego, agregue 500 microlitros de medios de miniintestino humano completos a cada pocillo. Continúe incubando en las mismas condiciones, asegurándose de reemplazar este medio cada dos días.