Medición de Múltiples Parámetros Mitocondriales en Neuronas mediante Citometría de Flujo

Tome neuronas fijas y permeabilizadas en un tubo.

Agregue un tampón de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Centrifugar la suspensión y eliminar el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender las neuronas en el amortiguador.

Transfiera la suspensión por igual a tubos que contengan anticuerpos primarios sin etiquetar y marcados con fluoróforos.

Incubar, permitiendo que los anticuerpos se unan específicamente a la cadena respiratoria mitocondrial o subunidades del complejo MRC, una proteína asociada al ADN mitocondrial y una proteína de la membrana externa mitocondrial dentro de las neuronas.

Elimine cualquier anticuerpo no unido.

Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo que se unen a los anticuerpos primarios no marcados.

Centrifugar la mezcla y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender las neuronas en tampón y transfiéralas a tubos de microcentrífuga.

Realizar citometría de flujo para detectar las señales fluorescentes en las neuronas marcadas, correspondientes a los niveles de expresión de las subunidades del complejo MRC y la medición de los niveles relativos de ADN mitocondrial.

Bloquee las muestras en 1 mililitro de tampón de bloqueo y l