Imágenes de segunda generación de armónicos en un modelo de rata para estudiar defectos de tubulina

Comience con una rebanada de tejido cerebral de rata montada en un portaobjetos de vidrio y sumergida en un tampón.

La rata sufre de tubulinopatía, una afección causada por defectos en la tubulina, los componentes básicos de los microtúbulos, lo que lleva a su acumulación y alteración anormales.

Esto también afecta la producción de mielina en el sistema nervioso central.

Coloque la rebanada bajo un microscopio de excitación de dos fotones cubierto para obtener imágenes detalladas.

Hidrata regularmente la rebanada para mantener su integridad.

Configure el microscopio en un modo de imagen sin escaneo, una técnica sin etiquetas para detectar señales débiles.

Exponga el tejido a un láser infrarrojo pulsado.

Los microtúbulos emiten luz como señales detectables conocidas como señales de generación de segundos armónicos o SHG.

Las áreas con acumulación anormal de microtúbulos amplifican estas señales, aumentando su detectabilidad.

Aplique filtros ópticos para refinar estas señales.

La imagen capturada revela la densidad y las anomalías de los microtúbulos, en las que la alta intensidad y la agrupación de SHG indican defectos de tubulina y una producción reducida de mielina.

Coloque la muestra bajo el microscopio y colóquela adecuadamente debajo del objetivo mediante observación directa a través de los oculares con luz transmitida. Retire el exceso de HBSS para que una fina película líquida cubra toda la muestra. Revise visualmente la película líquida cada pocos minutos para evitar la evaporación y el secado excesivos de la muestra.

Prepare la platina del microscopio para obtener imágenes no escaneadas, lo que incluye cerrar todas las puertas de la cámara de incubación oscura o cubrir la cámara de incubación con una tela recubierta de poliuretano de nailon negro. Seleccione el modo de imagen no escaneada a lo largo de la ruta de transmisión. De esta manera, se optimizará la captura de la señal SH débil de la tubulina.

Luego seleccione el objetivo. A continuación, establezca una potencia láser con un tiempo de permanencia de píxeles de 12,6 microsegundos. Tome imágenes de no más de 512 por 512 píxeles, con una velocidad de 5 y un promedio de 2 para un tiempo de adquisición promedio de 15 segundos. Capture imágenes primero con un filtro de paso corto de 485 nanómetros. Y en un segundo paso, agregue un filtro de paso de banda nítido de 405 nanómetros.